納米粒溶液粒徑

1、PLGA-PLL-PEG納米粒的制備藥學(xué)院浦藥劑1005吉冬悅林麗洪峰趙星龍摘要：本課題選用可生物降解材料聚乳酸羥基乙酸(PLGA)、聚賴氨酸(PLL)、聚乙二醇(PEG)作為合成新型 納米載藥系統(tǒng)的原料，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，制得PLGA-PLL-PEG聚合物。采用該聚合物包載抗白血病經(jīng)典藥物 柔紅霉素(DNR)及第三代MDR逆轉(zhuǎn)劑漢防己甲素(Tet)，并偶聯(lián)轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)，構(gòu)建一種具有主動靶向性 能的Tf-PEG-PLL-PLGA納米粒，以期逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥。本課題具體研究內(nèi)容與結(jié)果如下：選用復(fù)乳化溶 劑揮發(fā)法制備共載DNR和Tet的PLGA-PLL-PEG納米粒，優(yōu)化工藝條件并交聯(lián)Tf，

2、其平均粒徑為213.012nm， PI值為0.075, zeta電位為-19.16mv，外觀規(guī)則圓形。納米粒中DNR載藥量為3.630.15%，包封率為70.23 1.91%，Tet 載藥量為 4.270.12%，包封率為 86.50.7%，Tf 含量為 2.180.11%(w/w)。 關(guān)鍵字：載藥納米粒子；制備工藝；溶劑擴(kuò)散法；復(fù)乳化溶劑揮發(fā)法；轉(zhuǎn)鐵蛋白In our research, we use the biodegradable materials including poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA), poly-L-lysine (PLL),

3、polyethylene glycol (PEG) to synthesis novel nanodrug carrier system. We optimize the reaction conditions to synthesis PLGA-PLL-PEG, then use it to delivery the classical antileukemic drug daunorubicin (DNR) and the MDR reversal agents of tetrandrine (Tet) and couple transferrin (Tf).We except the T

4、f-PEG-PLL-PLGA nanoparticles can overcome the problem of multidrug resistance of leukemia. The main research contents and results are as follows. We chose double-emulsion method to prepare Tf-DNR/Tet-loaded PLGA-PLL-PEG nanoparticle through optimizing process conditions and cross-linking Tf. Nanopar

5、ticle was regular roundness, its average size was 213.0 12 nm with polydisperse index (PI) of 0.075, and the zeta potential was -19.16 mv. The drug loading of nanoparticles DNR was 3.63 0.15%, encapsulation efficiency was 70.23 1.91%. The drug loading of Tet was 4.27 0.12%, the encapsulation efficie

6、ncy was 86.5 0.7%, the concentration of transferrin was 2.18 0.11%(w/w).Keywords: drug-loaded nanoparticles; preparation process; solvent diffusion method; double emulsion solvent evaporation method; transferrin1、研究背景藥物納米化可能會使得一些難溶有機(jī)化合物用作藥物，這將使目前用于醫(yī)藥的合成化學(xué) 物質(zhì)數(shù)量增加。用納米粒子作為藥物載體可實現(xiàn)靶向輸送、緩釋給藥的目的，這是因為小粒 子可以

7、進(jìn)入很多大粒子難以進(jìn)入的人體器官組織，如小于50nm的粒子就能穿過肝臟內(nèi)皮或通過淋巴傳送到脾和骨髓，也可能到達(dá)腫瘤組織。此外納米粒子還能夠越過許多生物屏障到達(dá) 病灶部位，如透過血腦屏障把藥物送到腦部，通過口服給藥可使藥物在淋巴結(jié)中富集等。而 具有生物活性的大分子藥物（如蛋白類，多肽藥物等）就很難越過生物屏障，用納米粒子作 為載體可克服這一困難，并提高其在體內(nèi)輸送過程中的穩(wěn)定性。并且利用納米粒子實現(xiàn)基因 非病毒轉(zhuǎn)染，是輸送基因藥物的有效途徑。2、實驗材料與方法2.1實驗材料試劑廠商SCIENTZ-HD超聲波細(xì)胞粉碎儀SCIENTZ-HD超聲波細(xì)胞粉碎儀寧波新芝生物科技股份有限公司聚乳酸羥基乙酸-

8、聚賴氨酸-聚乙二醇自制丙酮南京化學(xué)試劑有限公司二氯甲烷南京化學(xué)試劑有限公司聚乙烯醇1788低粘度型阿拉丁試劑海藻糖國藥集團(tuán)化學(xué)試劑吐溫80國藥集團(tuán)化學(xué)試劑轉(zhuǎn)鐵蛋白SigmaBCA試劑盒PierceSepharose CL-4BPharmacia實驗儀器廠商Sartorius分析天平德國賽多利斯股份公司R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀瑞士 BUCHIWH-2型微型旋渦混合儀上海滬西分析儀器廠85-2型恒溫磁力攪拌器江蘇金壇醫(yī)療器械廠AKTA prime plus蛋白快速層析系統(tǒng)美國GE公司ZetaSizer3000HSAKTA prime plus蛋白快速層析系統(tǒng)美國GE公司ZetaSizer3000HS型

9、粒徑分析儀英國 Malvern 公司KQ-300DB數(shù)控超聲清洗器昆山市超聲儀器有限公司日本日立H-7650透射電子顯微鏡日本日立冷凍離心機(jī)GL-20G-H冷凍干燥機(jī)LGJ-10C冷凍離心機(jī)GL-20G-H冷凍干燥機(jī)LGJ-10C2.2實驗方法2.2.1載藥納米粒的制備2.2.1.1溶劑擴(kuò)散法將模型藥物加入PLGA-PLL-PEG的丙酮-二氯甲烷混合液中形成油相，再加入至含乳 化劑的水相中，冰浴，使用勻漿機(jī)或者一定頻率的超聲乳化后，除去有機(jī)溶劑。最后使 用冷凍離心機(jī)（4C，15000rpm ）離心，去離子水洗兩次后，冷凍干燥得納米粒。2.2.1.2復(fù)乳化溶劑揮發(fā)法將漢防己甲素及PLGA-PLL

10、-PEG溶于有機(jī)溶劑中形成油相，而柔紅霉素溶于水相中，將水 相加入油相，使用一定頻率超聲形成初乳，隨即加入至含乳化劑的水相中，采用外力形成復(fù) 乳，一定條件下除去有機(jī)溶劑。最后使用冷凍離心機(jī)（4C，15000rpm ）離心，去離子 水洗兩次后，凍干干燥制得納米粒。2.2.2制備納米粒工藝的單因素考察內(nèi)容2.2.2.1溶劑擴(kuò)散法根據(jù)調(diào)研，擬考察以下因素對納米粒載藥的影響：聚合物分子量、丙酮/二氯甲烷比例、 載體濃度、超聲頻率、乳化劑濃度、水相與油相（W/O）比例對載藥量的影響。2.2.2.2復(fù)乳化溶劑揮發(fā)法該制備方法中影響納米粒粒徑及載藥的因素主要有：PLGA分子量、載體濃度、內(nèi)水 相種類、二氯甲

11、烷與丙酮比例、外水相乳化劑濃度、內(nèi)水相與外水相比例、乳化條件、有機(jī) 相除去方式。2.2.3冷凍保護(hù)劑的考察為保證納米粒在凍干后，粒徑基本不改變且不會造成漏藥，固體結(jié)晶均一，體積不變且 不塌陷，故需要考察凍干保護(hù)劑的種類。納米粒的常見保護(hù)劑主要有蔗糖、甘露醇、海藻糖、 乳糖，濃度一般選用5%和10%，以粒徑、外觀及載藥量為指標(biāo)，選擇最佳保護(hù)劑。2.2.4納米粒交聯(lián)轉(zhuǎn)鐵蛋白取離心后的納米粒，使用PBS7.4的磷酸鹽緩沖液重懸后，超聲30s,與適量的轉(zhuǎn)鐵蛋白混 合室溫攪拌3h后，加入5%的凍干保護(hù)劑，冷凍干燥。2.2.5蛋白含量及蛋白結(jié)合效率的測定轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度使用雙辛丁酸(bicinchonic a

12、cid，BCA)試劑盒測定。BCA是用于蛋白質(zhì)分 析的反應(yīng)試劑。在堿性的條件下，二價銅離子可被蛋白質(zhì)還原成一價銅離子，一價銅離子和 BCA Solution A(含有BCA)相互作用產(chǎn)生敏感的顏色反應(yīng)。兩分子的BCA螯合一個銅離子，形 成紫色的復(fù)合物。該水溶性的復(fù)合物在562nm處有較強(qiáng)吸收，故可據(jù)其吸光值推算出蛋白濃 度。2.2.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立按照試劑盒說明書操作，取9個塑料離心管，依次標(biāo)號為AI號，按下表配置牛血清蛋 白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)溶液。表4-1牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備方法Table 4-1 The preparation method of BSA standard soluti

13、onpH 7.4 的 PBS(p L)BSA的體積和來源(p L)BSA的最終濃度A0300p L2000p g mL-1B125375p L1500p g mL-1C325325p L1000p g mL-1D175175p L的B液750p g mL-1E325325p L的C液500p g mL-1F325325p L的E液250p g mL-1G325325p L的F液125p g mL-1H400100p L的G液25p g mL-1I40000p g mL-1取上述BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.1mL,與2 mL(A:B=50:1)的工作液混合，密封，孵育，37C保 溫30分鐘，冷至室溫，5

14、62nm處測定吸收度(A)，將吸收度(A)對樣品濃度(C)進(jìn)行線性回歸， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.2.5.2方法回收率實驗按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法制備2507501500Ag-mL-1三個濃度的BSA溶液，分別取0.1mL， 與2mL(A:B=50:1)的工作液混合，密封，孵育,37C保溫30分鐘，保溫結(jié)束后，取出反應(yīng)管， 冷卻到室溫，562nm處測定吸收度(A)，計算方法回收率。2.2.5.3樣品轉(zhuǎn)鐵蛋白含量測定取轉(zhuǎn)鐵蛋白納米粒凍干粉適量，溶于去離子水中，高速離心(4C，15000rpm) 20min， 去離子水清洗，加入定量的蒸餾水重懸，取0.1mL納米粒溶液，加入至2mL的工作試劑，反 復(fù)混合，

15、密封，孵育，37C保溫30分鐘，取出反應(yīng)管，冷卻到室溫，562nm處測試吸收度(A)， 據(jù)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白濃度。2.2.5.4含量測定方法驗證為了驗證離心后轉(zhuǎn)鐵蛋白是交聯(lián)在納米粒上，而非靜電吸附，選用凝膠滲透色譜進(jìn)行檢 測，取重懸后轉(zhuǎn)鐵蛋白納米粒溶液、轉(zhuǎn)鐵蛋白各0.5mL進(jìn)樣。色譜條件：快速液相色譜系統(tǒng)AKTA FPLC；柱填：Sepharose CL-4B；流動相PBS 7.4磷酸鹽緩 沖液；檢測波長280nm。2.2.6包封率及載藥量的測定包封率(entrapment efficiency， EE)為了分離游離柔紅霉素及漢防己甲素，本實驗選用高速冷凍離心法測定納米粒的包封率。 在離心力作

16、用下，納米粒沉淀，去離子水重溶后，冷凍干燥，測定納米粒中藥物的含量。離 心條件:溫度為4C，轉(zhuǎn)速為15000rpm/min，離心時間為20min。根據(jù)以下公式計算包封率：包封率=W1/W2x100%式中：叫為包封的藥物的質(zhì)量(mg), W2為體系中的藥物總質(zhì)量(mg)載藥量(loading content， LC)稱取凍干后納米粒樣品W1mg溶于10ml容量瓶中，加入二甲亞砜破壞，按照藥物檢測方 法檢測藥物含量W2mg，根據(jù)以下公式計算載藥量率：載藥量=W2/W1x100%2.2.7納米粒粒徑及zeta電位測定用三蒸水將納米粒溶液稀釋一定倍數(shù)，于Malvren Zetasizer 3000HS

17、激光粒度儀上測定納 米粒粒徑、多分散系數(shù)(polydispersity, PI)及zeta電位。2.2.8納米粒的形態(tài)考察滴加適當(dāng)稀釋的納米粒溶液，磷鎢酸負(fù)染法染色，滴于點滴反應(yīng)瓷板的凹槽內(nèi)，并將噴 碳銅網(wǎng)放于試液上，12 min后取出銅網(wǎng)，用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸去殘余液體；將該銅網(wǎng)放在染 液滴(2%磷鎢酸溶液，pH 7.0)上約30s，吸干多余染液、干燥，日立H-7650透射電子顯微鏡下 觀察納米粒形態(tài)。結(jié)果與討論3.1溶劑擴(kuò)散法制備納米粒的單因素考察結(jié)果以載藥量和粒徑為主要考察指標(biāo)，分別考察聚合物分子量、丙酮/二氯甲烷比例、載體濃度、超聲頻率、乳化劑濃度、水相與油相(W/O)比例等六個因素對制

18、劑的影響。從處方各種因素優(yōu)化結(jié)果可見，采用溶劑擴(kuò)散法裝載兩種藥物的結(jié)果并不理想，其對難 溶性藥物漢防己甲素的包封較好(8.9%)，而水溶性藥物柔紅霉素載藥量較低(小于2%)，最終 勉強(qiáng)選定的處方：固定投藥量柔紅霉素和漢防己甲素各為8mg，乳化劑PVA濃度為1%(w/v)， PLGA分子量為30000的共聚物，載體濃度為50mg/mL，水相與油相(W/O)為3:1，丙酮： 二氯甲烷(v/v)2： 1，超聲頻率幅度85%，所制得的納米粒溶液在4C存放3d后，發(fā)生了沉降 現(xiàn)象，最好的一批納米粒粒徑圖如下(332nm左右)，故判定此法不適合包封這兩種藥物。Size Dutributizii 呵 Int

19、ens可圖4-1納米粒粒徑分布圖Figure 4-1 Partical distribution of Nanoparticles3.2復(fù)乳化溶劑揮發(fā)法制備納米粒的單因素考察結(jié)果復(fù)乳化法制備納米粒主要考察制備初乳的條件影響及復(fù)乳化條件影響，初乳的影響條件 包含PLGA分子量、載體濃度、內(nèi)水相種類、二氯甲烷與丙酮比例；復(fù)乳化條件影響因素主 要有外水相乳化劑濃度、內(nèi)水相與外水相比例、乳化條件，有機(jī)相去除方式。3.2.1初乳條件的優(yōu)化PLGA分子量影響本試驗主要考察PLGA分子量對納米制劑質(zhì)量的影響，固定投藥量柔紅霉素和漢防己甲 素各為7mg，內(nèi)水相為6%吐溫80，丙酮:二氯甲烷為1:1，載體濃度為

20、50mg/mL，超聲頻率幅 度95% (03)，乳化劑PVA濃度為1%(w/v)，水相與油相(W/O)為2:1，內(nèi)水相：外水相為 1:4，選用不同分子量的載體制得的納米粒載藥量及粒徑變化如下圖所示。柔紅霉素iiiiiii漢防己甲素粒徑圖4-2 PLGA分子量對納米粒粒徑及載藥量的影響Figure 4-2 Effect of PLGA characteristics on the mean diameter anddrug loading of nanoparticles從數(shù)據(jù)可見，納米粒的載藥量及粒徑隨載體分子量變大而變大，這可能與納米粒的粒徑 有關(guān)，當(dāng)PLGA載體分子量變大，形成納米粒內(nèi)部的

21、空間也變大，相應(yīng)的載藥量及粒徑也隨之 變大。而載體對漢防己甲素的包封效果比柔紅霉素高，可能是由于載體的疏水性區(qū)域?qū)﹄y溶 性藥物漢防己甲素包封好?？紤]到材料的易購性及國內(nèi)外文獻(xiàn)，最終選定采用分子量為30000 的PLGA共聚物作為合成納米粒的載體。載體濃度的影響選用分子量為30000的PLGA載體，柔紅霉素和漢防己甲素各為7mg，載體濃度在 1050mg/mL時對納米粒載藥量及粒徑的影響，固定其他因素不變。載體濃度（mg/ml）柔紅霉素載體濃度（mg/ml）iiiwi漢防己甲素土粒徑圖4-3載體濃度對納米粒粒徑及載藥量的影響Figure 4-3 Effect of polymer concent

22、ration on the mean diameter anddrug loading of nanoparticles圖中顯示，隨著聚合物載體濃度的增大，藥物的載藥量增大，但納米粒粒徑也隨著變大。 這是由于溶劑體系的粘度增大，超聲乳化過程中納米粒的分散性降低，從而引起納米粒聚集， 粒徑分布范圍也隨之?dāng)U大?？紤]到載藥量及粒徑綜合結(jié)果，最終選用載體濃度為50mg/mL，從 這兩個因素篩選中，發(fā)現(xiàn)漢防己甲素較柔紅霉素載藥量高，考慮到柔紅霉素為主要考察藥物， 故在以后實驗中減少漢防己甲素的量。有機(jī)溶劑的影響在溶劑擴(kuò)散法中發(fā)現(xiàn)使用二氯甲烷與丙酮的混合溶劑，能顯著減小納米粒粒徑，因此考 察二氯甲烷與丙酮

23、比例范圍定為1:11:5,柔紅霉素和漢防己甲素各為7mg、5mg柔紅霉素柔紅霉素漢防己甲素 粒徑圖4-4丙酮與二氯甲烷比例對納米粒粒徑及載藥量的影響Figure 4-4 Effect of acetone/dichloromethane volume ratio on the meandiameter and drug loading of nanoparticles從圖中可見，混合溶劑中丙酮的量，對粒徑影響較大，隨著丙酮增多，粒徑變小。可能 由于丙酮加入非溶劑系統(tǒng)形成微滴后，丙酮迅速擴(kuò)散進(jìn)入水相，使水相在有機(jī)相的界面張力 明顯降低；與此同時，界面面積增大，使有機(jī)相液滴粒徑進(jìn)一步減小，從而形成

24、粒徑較小的 納米粒。綜合載藥量及粒徑的影響，最后選擇丙酮：二氯甲烷為1:1作為有機(jī)相。內(nèi)水相種類的影響文獻(xiàn)中一般制備納米粒時，對初乳中乳化劑的加入與否很少研究，但考慮到乳化劑對初 乳的穩(wěn)定性有一定影響，故在此做出研究。分別選用水、0.5%PVA溶液、6%吐溫80作為內(nèi)水 相，從實驗結(jié)果可知，當(dāng)選用6%吐溫80時，所制得的納米粒各項指標(biāo)較好。內(nèi)水相柔紅霉素內(nèi)水相山HII漢防己甲素土粒徑圖4-5內(nèi)水相對納米粒粒徑及載藥量的影響Figure 4-5 Effect of internal phase on the mean diameter and drug loading ofnanoparticl

25、es3.2.2復(fù)乳化溶劑揮發(fā)法條件的篩選乳化條件的影響常見復(fù)乳化法有高壓均質(zhì)法及超聲法，高壓均制法由于有較大死體積不適合少量化，且 有一定浪費，操作沒有超聲法方便，但其利于工業(yè)放大，綜合實驗結(jié)果，制得納米粒在載藥 量及粒徑上差別不大，但產(chǎn)率不高，所以本實驗選用超聲95%的功率。復(fù)乳化條件300復(fù)乳化條件25020015010050柔紅霉素lllllll漢防己甲素粒徑圖柔紅霉素lllllll漢防己甲素粒徑Figure 4-6 Effect of emulsification on the mean diameter and drug loadingOf nanoparticles乳化劑濃度的影響

26、乳化劑在制備復(fù)乳中主要使納米粒穩(wěn)定，防止納米粒相互融合、團(tuán)聚。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 調(diào)研發(fā)現(xiàn)乳化劑使用聚乙烯醇（PVA）較多，故考察PVA的濃度，結(jié)果可見，使用1%的PVA作為乳化劑時，實驗結(jié)果較好，而繼續(xù)增加濃度后，制備時粘度過大，不利于超聲，且粒徑的 多分散性系數(shù)（PI）較大。54.54載3.554.54載3.5藥 3量2.5%21.510.50250200150八E100 =500PVA濃度柔紅霉素11曲1漢防己甲素粒徑圖4-7 PVA濃度對納米粒粒徑及載藥量的影響Figure 4-7 Effect of PVA concentration on the mean diameter and d

27、rug loading ofnanoparticles內(nèi)水相與外水相的比例固定其他條件不變，考察內(nèi)水相與外水相的比例，柔紅霉素及漢防己甲素的量分別為 7mg、 5mg。54.5454.54載3.5藥3量2.5%21.510.50圖4-8內(nèi)水相與外水相比例對納米粒粒徑及載藥量的影響Figure 4-8 Effect of W1/W2 volume ratio on the mean diameter and drug loading ofnanoparticles結(jié)果中可以看到，當(dāng)內(nèi)水相與外水相的比例為1:8時，粒徑較小，且載藥量較高，可能 由于外水相過少時超聲容易不均，從而納米粒發(fā)生聚集，而過

28、多后水溶性柔紅霉素容易溶于外水相中，從而載藥量下降。有機(jī)相除去方式調(diào)研國內(nèi)外文獻(xiàn)，一般有機(jī)相除去方式有旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法和室溫攪拌揮發(fā)，本實驗考察這兩 種方法對納米粒質(zhì)量的影響，其中旋蒸條件為37C，1h；室溫攪拌條件為0.3%PVA 60mL,攪 拌3h,其他條件均不變。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，旋蒸制得納米粒粒徑顯著大于恒溫攪拌，故選擇恒 溫攪拌制備。3.3制備工藝總結(jié)將漢防己甲素及載體溶于丙酮與二氯甲烷的混合溶劑(1:1)中，形成油相(0)；柔紅霉 素加入的6%吐溫80中，形成內(nèi)水相(W1)；將內(nèi)水相(W滴加入油相(0)中，超聲95% (0 3) 2min，形成初乳(W1/O);將初乳迅速滴加至1 %PVA

29、 (W，中，超聲95% (g) 2min，形成復(fù) 乳(W1/O/W2)，所得溶液滴入0.3%PVA中，攪拌3h除去有機(jī)相，高速冷凍離心(15000rpm，4C) 20min，所得納米粒去離子水清洗，使用凍干保護(hù)劑溶液重懸，放A-70C冷凍干燥機(jī)中預(yù)凍、 凍干?？瞻准{米粒的制備如上法。3.4凍干保護(hù)劑的選擇納米粒制成凍干粉后，其穩(wěn)定性會得到較大改善，但納米粒在冷凍和解凍過程中，可能 會因內(nèi)外滲透壓的改變，造成微粒裂解，從而粒徑變大且發(fā)生漏藥，因此，需要在凍干過程 中選擇合適的凍干保護(hù)劑，不同種類的保護(hù)劑對納米粒凍干過程的影響不同，因此需考察不 同種類及濃度的保護(hù)劑對納米粒凍干前后粒徑的影響。按照

30、上述處方工藝制備的納米粒 (224.5nm)，分別加入下述保護(hù)劑，凍干后檢測納米粒粒徑，結(jié)果如下：保護(hù)劑種類凍干粉外觀粒徑(nm)蔗糖5%凍干粉表面質(zhì)脆336.4蔗糖10%質(zhì)脆，晶體感較重354.9甘露醇5%體積不變288.7甘露醇10%體積不變297.1海藻糖5%體積不變，質(zhì)地細(xì)膩235.9海藻糖10%質(zhì)地細(xì)膩242.3乳糖5%容易吸濕253.5乳糖10%容易吸濕269.7從粒徑檢測結(jié)果可見，海藻糖5%及10%作為凍干保護(hù)劑時，凍干粉外觀及對納米粒的保 護(hù)均優(yōu)于其它種類保護(hù)劑，但考慮到盡量減少凍干保護(hù)劑的量，選擇使用5%的海藻糖作為凍干保護(hù)劑。3.5蛋白含量的測定3.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立以B

31、SA在562nm處的吸收度(A)對濃度(C)作線性回歸分析，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=0.001x+0.062，R2=0.99552.吸收值A(chǔ)1 5O.52.吸收值A(chǔ)1 5O.y = O.OOlx I 0,06R2= 0.995001000150020002500蛋白濃度(ug-mL1)圖4-9牛血清蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 4-9 The standard curve of BSA3.5.2方法回收率表4-2牛血清蛋白的回收率Table 4-2 The recovery of BSA樣品濃度測得濃度 回收 平均回收 SD RSD% TOC o 1-5 h z (p g - mL-1)(p g -

32、 mL-1)率率24196.4025023694.4095.331.011.0623895.2072396.4075071595.3396.441.131.18 TOC o 1-5 h z 73297.60143695.731500144196.0795.530.660.69142294.80結(jié)果表明：RSD%2%,此方法的回收率良好，方法準(zhǔn)確。3.5.3轉(zhuǎn)鐵蛋白含量測定圖4-10轉(zhuǎn)鐵蛋白檢測圖Figure 4-10 The detection of Tf按照上述測定方法測定三批次轉(zhuǎn)鐵蛋白納米粒（左管顯蛋白紫色，右管不顯色），載藥 納米粒平均蛋白含量為2.18 + 0.11%（w/w）。3.5

33、.4轉(zhuǎn)鐵蛋白含量測定方法驗證從圖譜可見，轉(zhuǎn)鐵蛋白的洗脫時間在52min左右，而離心后的納米粒溶液在此時間段上 無峰值，只有22min的納米粒峰，且采用BCA試劑盒檢測蛋白后，出現(xiàn)紫色復(fù)合物，綜合可 見轉(zhuǎn)鐵蛋白共價連接到納米粒上。B圖4-11轉(zhuǎn)鐵蛋白（A）及轉(zhuǎn)鐵蛋白納米粒（B）凝膠滲透色譜圖Figure 4-11 Gel permeation chromatography chart of Tf（A）andTf-DNR/Tet-loaded nanoparticles （B）3.6納米粒載藥量和包封率按照最終處方工藝制備3批次的納米粒，按照測試條件檢測包封率及載藥量如下:表4-3納米粒包封率和載

34、藥量Table 4-3 Entrapment efficiency and drug loading of nanoparticles批號包封率（%）載藥量（%）柔紅霉素漢防己甲柔紅霉素漢防己甲素素2013031172.486.53.64.22013031369.585.83.54.42013031568.887.23.84.2平均70.23 +86.5 +3.63 +4.27 +1.910.70.150.123.7納米粒溶液外觀圖4-12轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的納米粒Figure 4-12 Tf-DNR/Tet-loaded nanoparticles3.8納米粒溶液粒徑Statistic.Giaph

35、 (. measurements)(滲查 Statistic.Giaph (. measurements)(滲查 OJr_圖4-13納米粒的粒徑分布Figure 4-13 Partical distribution of Tf-DNR/Tet-loaded nanoparticles經(jīng)激光粒度儀測定所制納米粒粒徑在213.012nm, PI為0.075, zeta電位為-19.16mv，結(jié) 果表明納米粒大小均一。3.9納米粒微觀形態(tài)考察透射電鏡觀察納米顆粒外觀為規(guī)則球狀，大小均一。q O O0o Hk 圖4-14納米粒電鏡圖nanoparticlesFigure 4-14 Transmissi

36、on electron photomicrograms of Tf-DNR/Tet-loadednanoparticles結(jié)論在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，最終采用自合成的PLGA-PLL-PEG混合載體，利用復(fù)乳化溶劑 揮發(fā)法，同時包封柔紅霉素及漢防己甲素，采用單因素考察優(yōu)化制備工藝，并利用載體 PEG末端的CDI基團(tuán)與轉(zhuǎn)鐵蛋白交聯(lián)，從而提高靶向性。4.1最佳制備工藝漢防己甲素及載體100mg溶于2mL丙酮與二氯甲烷的混合溶劑（1:1）中，形成油相（O）； 柔紅霉素7mg加入0.5mL的6%吐溫80中，形成內(nèi)水相（W1）；將內(nèi)水相（WJ滴加入油相（O） 中，超聲95% （3）2min，形成初乳（W/O）

37、；將初乳迅速滴加至4mL 1%PVA（W2）中， 超聲95% （3）2min，形成復(fù)乳（W/O/ W2），所得溶液滴入60mL 0.3%PVA中，攪拌3h除 去有機(jī)相，高速冷凍離心（15000rpm，4C） 20min，所得納米粒去離子水清洗，使用PBS7.4 的磷酸鹽緩沖液重懸后，超聲30s，與適量的轉(zhuǎn)鐵蛋白混合室溫攪拌3h后，加入5%的凍干保 護(hù)劑，冷凍干燥。自制的轉(zhuǎn)鐵蛋白納米粒，其平均粒徑為213.012nm，PI值為0.075, zeta電 位為-19.16mv，外觀規(guī)則圓形。納米粒柔紅霉素載藥量為3.630.15%，包封率為70.231.91%， 漢防己甲素載藥量為4.270.12%

38、，包封率為86.50.7%，轉(zhuǎn)鐵蛋白含量為2.180.11% （w/w）。4.2蛋白含量及蛋白結(jié)合效率測定方法本課題采用BCA試劑盒測定蛋白含量，這種分析方法簡單快速，重現(xiàn)性好，結(jié)果可靠， 同時高速冷凍離心法檢測轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合率，操作簡便，通過凝膠滲透色譜驗證此方法的可行 性，結(jié)果表明冷凍離心法能除去游離的轉(zhuǎn)鐵蛋白。綜上所述，采用復(fù)乳化溶劑揮發(fā)法和交聯(lián)法制備的轉(zhuǎn)鐵蛋白納米粒，具有較好的載藥量 及蛋白交聯(lián)率，故本課題在以后的研究中使用的實驗藥物均采用該方法制備。參考文獻(xiàn)Brannon-Peppas L, Blanchette JO. Nanoparticle and targeted system

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