DNA的酶切、連接、轉(zhuǎn)化和重組子的篩選與鑒定

1、第二次分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告DNA 的酶切、連接、轉(zhuǎn)化和重組子的篩選與鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)和掌握限制性內(nèi)切酶的分類、特性與作用原理，掌握載 體和外源目的 DNA 酶切的操作技術(shù)。2、學(xué)習(xí)利用 T4 DNA 連接酶把酶切后的載體片段和外源目的 DNA 片段連接起來，構(gòu)建體外重組 DNA 分子的技術(shù)，了解 并掌握幾種常用的連接方法。3、掌握利用 CaCl2 制備感受態(tài)細(xì)胞的方法；學(xué)習(xí)和掌握熱擊 法轉(zhuǎn)化 E. coli 的原理與方法。4、學(xué)習(xí)并掌握使用紅白菌落法篩選獲得重組子以及a互補(bǔ)篩 選法的原理及方法。5、學(xué)習(xí)和掌握使用試劑盒抽提質(zhì)粒的方法；6、復(fù)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳的原理和方法；7、通過對重組子進(jìn)

2、行重組質(zhì)粒 DNA 的抽提與酶切鑒定，進(jìn)一 步確定重組質(zhì)粒中含有外源目的 DNA 片段，并驗(yàn)證重組子 是期望的重組子。二、實(shí)驗(yàn)原理1、限制性內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶是一類能夠識別雙鏈 DNA 分子中的某種特 定核苷酸序列，并由此切割 DNA 雙鏈結(jié)構(gòu)的酶，主要是從原核 生物中分離純化出來的。在限制性核酸內(nèi)切限制酶的作用下，侵 入細(xì)菌的“外源” DNA分子便會被切割成不同大小的片段，而細(xì) 菌自己固有的 DNA 由于修飾酶（通常是一種甲基化酶）的保護(hù)作 用，則可免受限制酶的降解。目前已經(jīng)鑒定出3種不同類型的限制性核酸內(nèi)切酶，即I型 酶、II型酶和III型酶。I型酶切割位點(diǎn)是隨機(jī)的，至少距識別位點(diǎn)lO

3、OObpoIII型限 制酶的切割位點(diǎn)距識別序列3端為2426bpII型限制酶的切 割位點(diǎn)一般在識別序列上或與之靠近，而且具有序列特異性，故 在基因克隆中有特別廣泛的用途。II型核酸內(nèi)切限制酶具有3個(gè)基本的特性：在DNA分子雙 鏈的特異性識別序列部位切割DNA分子，產(chǎn)生鏈的斷裂；2個(gè) 單鏈斷裂部位在 DNA 分子上的分布通常不是彼此直接相對的； 斷裂結(jié)果形成的 DNA 片段往往具有互補(bǔ)的單鏈延伸末端。限制性核酸內(nèi)切酶對 DNA 底物的酶切作用是否完全，直接關(guān) 系到連接反應(yīng)、重組體分子的篩選和鑒定等實(shí)驗(yàn)結(jié)果。核酸內(nèi)切 限制酶活性的充分發(fā)揮受到以下幾個(gè)因素的影響：DNA樣品的純度，可采取措施有純化D

4、NA、加大酶的用量、延長酶催化反應(yīng)的保溫時(shí)間，擴(kuò)大反應(yīng)體積；DNA 的甲基化程度，基因工程中必須使用甲基化酶失活突 變的菌株；酶切消化反應(yīng)的溫度；DNA 的分子結(jié)構(gòu)；限制性核酸內(nèi)切酶的緩沖液。限制核酸內(nèi)切酶是分子克隆中最常用的工具酶，在 DNA 重組 技術(shù)中限制性核酸內(nèi)切酶主要用在一下幾方面：構(gòu)建重組質(zhì)粒; 構(gòu)建基因文庫；DNA分子的雜交；制備DNA放射性探針； 繪制DNA分子的限制酶圖譜DNA序列分析；基因定位及 DNA 同源性研究。2、限制性內(nèi)切酶的酶切反應(yīng)體外構(gòu)建重組 DNA 分子，首先要了解目的基因的酶切圖譜， 選用的限制性核酸內(nèi)切酶都不能在目的基因內(nèi)部有專一的識別 位點(diǎn)，即當(dāng)用一種或

5、者兩種限制性核酸內(nèi)切酶切割外源供體DNA 時(shí)，能夠得到完整的目的基因。其次，選擇具有相應(yīng)的單一酶切 位點(diǎn)的質(zhì)粒、噬菌體等載體分子作為克隆的載體。常用的酶切方 法有雙酶切法和單酶切法兩種。（1）雙酶切法：如果只在要克隆的目的 DNA 二端具有不同 的限制性核酸內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)，而目的基因內(nèi)部沒有相應(yīng)的識 別序列，可用這二種限制性核酸內(nèi)切酶酶切，則目的 DNA 可產(chǎn)生 二種不同的黏性末端。選擇同樣具有這二種限制性核酸內(nèi)切酶識 別位點(diǎn)的合適載體，酶切后，同樣產(chǎn)生二個(gè)不同的黏性末端，當(dāng) 構(gòu)建重組分子時(shí)，目的 DNA 可以一定的方向插入載體中，這樣 操作效率高，也利于重組子的篩選。（2）單酶切法：:如果

6、目的 DNA 片段只能用一種限制性核酸 內(nèi)切酶切割，酶切后的片段兩端產(chǎn)生相同的粘性末端或者平末端 選擇具有同樣限制性核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的合適載體，在構(gòu)建重 組分子時(shí)，除了形成正常的重組子之外，還可能會出現(xiàn)目的DNA 片段以相反方向插入載體分子中，或者目的 DNA 串聯(lián)后再插入 載體分子中，甚至出現(xiàn)載體分子自連，重新環(huán)化的現(xiàn)象，因此重 組效率較低。如果沒有很好的方法區(qū)分轉(zhuǎn)化子中的重組子，篩選 重組子會比用雙酶切法構(gòu)建重組 DNA 分子的工作量大很多。單酶切法和雙酶切法各有優(yōu)缺點(diǎn)，在實(shí)際操作時(shí)要根據(jù)具體 情況來定。3、DNA 連接酶DNA 連接酶能催化雙鏈 DNA 片段緊靠在一起的 3羥基末端 與

7、 5 磷酸基團(tuán)末端之間形成磷酸二酯鍵，使兩末端連接。目前 用于連接DNA片段的DNA連接酶有E. coli DNA連接酶和T4 DNA連接酶。E. coli DNA連接酶只能催化雙鏈DNA片段互補(bǔ) 黏性末端之間的連接，不能催化雙鏈DNA片段平末端之間的連 接。T4DNA連接酶既可用于雙鏈DNA片段互補(bǔ)黏性末端之間的 連接，也能催化雙鏈 DNA 片段平末端之間的連接，但平末端之 間連接的效率比較低。DNA 連接酶同限制性核酸內(nèi)切酶一樣，都是在體外構(gòu)建重組 DNA 分子所必不可少的基本工具酶。限制性核酸內(nèi)切酶可以將 DNA 分子切割成不同大小的片段，然而要將不同來源的 DNA 片 段組成新的雜交

8、DNA 分子，還必須將它們彼此連接起來。目前 有3種體外連接DNA片段的方法：用DNA連接酶連接具有互 補(bǔ)黏性末端的DNA片段；用T4 DNA連接酶直接將平末端的 DNA 片段連接起來，或是用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶給具平末端的 DNA片poly(dA)-poly(dT)尾之后，再用DNA連接酶連接起來; 先在 DNA 片段末端加上化學(xué)合成的銜接物或接頭，使之形成 黏性末端，再用 DNA 連接酶連接起來。這 3 種方法雖然互有差 異，但共同的一點(diǎn)都是利用 DNA 連接酶所具有的連接和封閉單 鏈 DNA 的功能。4、載體與外源 DNA 的連接反應(yīng)外源 DNA 片段與載體分子的連接，即 DNA 分子體

9、外重組，主 要依賴于DNA連接酶來完成。DNA連接酶催化兩雙鏈DNA片段 相鄰的 5-磷酸和 3-羥基間形成磷酸二酯鍵。在分子克隆中 最有用的DNA連接酶是來自T4噬菌體的DNA連接酶:T4 DNA連 接酶，該酶需要 ATP 作為輔助因子。目的 DNA 片段與載體 DNA 片 段之間的連接方式主要有以下幾種：（1）互補(bǔ)粘性末端片段之間的連接當(dāng)載體和外源 DNA 用同一種限制性內(nèi)切酶切割時(shí)，產(chǎn)生相同 的粘性末端，連接后仍保留原限制性內(nèi)切酶的識別序列；如果用 兩種能夠產(chǎn)生相同的粘性末端的限制酶（同尾酶）切割時(shí)，雖然 可以有效地進(jìn)行連接，但是獲得的重組 DNA 分子消失了原來用 于切割的那兩種限制性

10、核酸內(nèi)切酶的識別序列，這樣不利于從重 組子上完整地將插入片段重新切割下來。定向克隆：根據(jù)核酸內(nèi) 切限制酶的性質(zhì)，用兩種不同的限制酶同時(shí)消化一種特定的 DNA 分子，將會產(chǎn)生出具有兩種不同粘性末端的 DNA 片段。十分明 顯，如果載體分子和待克隆的 DNA 分子都是用同一對核酸內(nèi)切 酶切割，然后混合起來，那么載體分子和外源 DNA 片段將按一 種取向退火形成重組 DNA 分子?；パa(bǔ)粘性末端連接方案中還有一個(gè)問題：片段的多拷貝插入。 當(dāng)需要表達(dá)蛋白質(zhì)產(chǎn)物時(shí)，多拷貝的插入，在沒有拼連剪切信號 的情況下，將會導(dǎo)致表達(dá)困難或紊亂。所以需要用內(nèi)切酶圖譜對 單拷貝插入片段進(jìn)行鑒定和篩選。適當(dāng)?shù)牟迦肫闻c載體

11、分子比 率能減少多拷貝插入片段的形成，一般比例為2:1（插入片段摩 爾數(shù):載體摩爾數(shù)）。（2）平末端及非互補(bǔ)黏性末端片段之間的連接載體分子和外源 DNA 插入片段并不一定總能產(chǎn)生出互補(bǔ)的粘 性末端。實(shí)際上有許多情況都是例外的，因?yàn)橛行┫拗泼盖懈?DNA 分子之后所形成的都是平末端的片段；有的實(shí)驗(yàn)要用兩種不 同的限制酶分別切割載體分子和外源DNA,形成的也多半是非互 補(bǔ)的粘性末端或平末端；再如用機(jī)械切割法制備的 DNA 片段， PCR 擴(kuò)增的和化學(xué)合成的 DNA 片段或由 RNA 為模板反轉(zhuǎn)錄合成 的 cDNA 片段，也不會具有互補(bǔ)的粘性末端。既然在一定反應(yīng)條件下，用 T4 DNA 連接酶可以將

12、平末端的 DNA 片段有效地連接起來，那么對于上面提到的非互補(bǔ)粘性末端 的兩種 DNA 片段之間，經(jīng)過專門作用于單鏈 DNA 的 S1 核酸酶 處理變成平末端或用大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的 Klenow 片段填 補(bǔ)后變成平末端，一樣也可以使用 T4 DNA 連接酶進(jìn)行有效地連 接。不過，平末端 DNA 片段間的連接作用不僅在效率上明顯地低于粘性末端間的連接作用，而且重組之后一般不能從原位刪除 下來。影響DNA連接的因素有溫度、時(shí)間、酶量、緩沖體系、DNA 末端的性質(zhì)及濃度、 DNA 判斷的大小等。溫度，理論上最佳溫度是37C，此時(shí)酶的活性最高，但37C 時(shí)粘性末端分子形成的氫鍵配對極不穩(wěn)

13、定，因此我們選擇在 1216C進(jìn)行連接。時(shí)間，在最適溫度下，一般粘性末端連接 30min 即可取得較 好的效果，連接60min則更完全些，為了實(shí)驗(yàn)方便有時(shí)也在4C 下連接過夜。而對于平末端建議在4C下連接，并且時(shí)間適當(dāng)延 長。更為普遍的條件是：16C連接過夜酶單位（Takara）在20ml的連接反應(yīng)體系中，6mg的A DNA-Hind III的分解產(chǎn)物在16C下fanying30分鐘時(shí)，有90%以 上的DNA片段進(jìn)行連接的酶量為1U。酶量，連接實(shí)驗(yàn)中DNA的 濃度比酶量定義狀態(tài)下低很多倍，所以酶是過量的。 Takara 的 T4-DNA 連接酶濃度是 350U/ml。緩沖體系（buffer）,

14、 Tris-HCl提供連接所需的合適的ph 值， DTT 提供還原力， ATP 促進(jìn)連接反應(yīng)的有效進(jìn)行。DNA濃度，連接反應(yīng)中DNA的濃度一般為0.11pmol/ml。其 中載體濃度過高會增加載體間分子的環(huán)化，而過低則獲得重組分 8 / 24子的效率低，甚至導(dǎo)致載體分子的自身環(huán)化，外源 DNA 則依據(jù)連 接類型的不同加入載體濃度的 110 倍。5、感受態(tài)細(xì)胞的制備與質(zhì)粒轉(zhuǎn)化體外連接的 DNA 重組分子導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞才能大量地進(jìn) 行復(fù)制、增殖和表達(dá)，將外源重組體分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的途徑， 包括轉(zhuǎn)化(或轉(zhuǎn)染)、轉(zhuǎn)導(dǎo)、顯微注射和電穿孔等多種不同的方 式。重組質(zhì)粒 DNA 分子通過與膜蛋白結(jié)合進(jìn)入受

15、體細(xì)胞，并在 受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)的過程稱之為轉(zhuǎn)化(transformation)。細(xì)菌轉(zhuǎn)化的本質(zhì)是受體菌直接吸收來自供 體菌的游離 DNA 片段，即轉(zhuǎn)化因子，并在細(xì)胞中通過遺傳交換 將之組合到自身的基因組中，從而獲得供體菌的相應(yīng)遺傳性狀的 過程。大腸桿菌是一種革蘭氏陰性菌，自然條件下很難進(jìn)行轉(zhuǎn)化， 其主要原因是轉(zhuǎn)化因子的吸收較為困難，尤其是那些與其親緣關(guān) 系較遠(yuǎn)的 DNA 分子更是如此。通常的做法是采用人工的方法制 備感受態(tài)細(xì)胞，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)化處理，其中代表方法之一是 CaCl2 誘導(dǎo)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化法。感受態(tài)是指宿主細(xì)胞最容易接受外源 DNA 片段并實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的 一種生理狀態(tài)，由受體菌的遺傳

16、性狀決定，同時(shí)也受菌齡和環(huán)境 因子的影響。感受態(tài)的細(xì)胞一般出現(xiàn)在對數(shù)生長期。重組 DNA 轉(zhuǎn)化細(xì)菌的技術(shù)操作關(guān)鍵就是通過化學(xué)方法，人工 誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)入一個(gè)敏感的感受態(tài)，以便外源 DNA 進(jìn)入細(xì)菌 內(nèi)。CaCl2誘導(dǎo)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化的原理是將處于對數(shù)生長期的細(xì) 菌置于0C, CaCl2低滲溶液中，細(xì)菌細(xì)胞膨脹成球形，同時(shí)鈣 離子使細(xì)胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)，使得位于外膜與內(nèi)膜間隙中 的部分核酸酶離開所在區(qū)域，這就構(gòu)成了大腸桿菌人工誘導(dǎo)的感 受態(tài)。此時(shí)加入DNA,鈣離子又與DNA結(jié)合形成抗脫氧核糖核酸 酶(Dnase)的羥野磷酸鈣復(fù)合物，并粘附在細(xì)菌細(xì)胞膜的外表 面上。經(jīng)短暫的42C熱脈沖處理后，細(xì)

17、菌細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā) 生劇烈擾動，隨之出現(xiàn)許多間隙，致使通透性增加， DNA 分子便 趁機(jī)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。影響感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化的因素有細(xì)胞的狀態(tài)、DNA的質(zhì) 量和濃度、試劑的純度等。細(xì)胞的生長狀態(tài)和密度：從甘油管中新鮮活化而不是多 次轉(zhuǎn)接的菌；培養(yǎng)至指數(shù)前期到指數(shù)期；應(yīng)為限制-修飾系統(tǒng)缺 陷菌株；感受細(xì)胞和所轉(zhuǎn)化的載體性質(zhì)應(yīng)匹配。質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和濃度：超螺旋構(gòu)想的質(zhì)粒DNA，較其 線性構(gòu)想的轉(zhuǎn)化率高 10100 倍；加入 DNA 的體積不應(yīng)超過感受 態(tài)細(xì)胞的5%，Ing的cccDNA即可使50 “ l的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽 和；對于同一類型的載體而言，分子量越大轉(zhuǎn)化率越低。（3）其他藥品、試劑質(zhì)

18、量：氯化鈣應(yīng)用高純度藥品、超純水 配制，過濾除菌、分裝保存；所有試劑、容器、耗材等均需無菌 處理；感受態(tài)細(xì)胞制備過程均需無菌、冰浴操作。5、a互補(bǔ)利用0 -半乳糖苷酶篩選系統(tǒng)，跟據(jù)菌落顏色篩選含有重組質(zhì) 粒的轉(zhuǎn)化子。載體上插入了0 -半乳糖苷酶的調(diào)控序列和0 -半乳 糖苷酶 N 端 146 個(gè)氨基酸的編碼序列，而其對應(yīng)的宿主菌染色體 上整合有0 -半乳糖苷酶 C 端序列的遺傳信息。當(dāng)質(zhì)粒載體導(dǎo)入 相應(yīng)宿主菌后，通過a互補(bǔ)作用，形成完整的0 -半乳糖苷酶。 在加有氨芐青霉素的麥康凱培養(yǎng)基平板上，不含質(zhì)粒 pUC19 的 E. coli DH5a 無法生長；含有質(zhì)粒 pUC19 的 E. coli

19、 DH5a 利 用0 -半乳糖苷酶分解培養(yǎng)基中的乳糖產(chǎn)生有機(jī)酸， pH 降低，培 養(yǎng)基中的指示劑變紅，菌落變?yōu)榧t色；含有重組質(zhì)粒的 E. coli DH5a 具有氨芐青霉素抗性可以生長，但質(zhì)粒 pUC19 中有外源基 因插入到多克隆位點(diǎn)，使0 -半乳糖苷酶 N 端的基因不能表達(dá)， 無法實(shí)現(xiàn)a互補(bǔ)作用，所以其菌落為白色。利用這種篩選方法 可方便地將含目的基因的重組子篩選出來。6、重組質(zhì)粒的鑒定重組質(zhì)粒是外源基因通過單酶切（或雙酶切）與用相同的（或 二種）限制性核酸內(nèi)切酶切割的質(zhì)粒載體理解后獲得的，因此在 連接處仍保留原限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列，用該酶（或二種 酶）再次切割重組質(zhì)粒，能把插入片段

20、切離載體，根據(jù)瓊脂糖凝 膠電泳檢測可見有載體片段和插入的外源 DNA 片段，并可知插入 片段的大小。7、麥康凱培養(yǎng)基蛋白胨、胨提供碳氮源、維生素和生長因子；牛膽鹽和結(jié)晶 紫可抑制革蘭氏陽性菌的生長；氯化鈉維持均衡的滲透壓；瓊脂 是培養(yǎng)基的凝固劑；乳糖為可發(fā)酵的糖類；中性紅是 pH 指示劑， 細(xì)菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸時(shí)菌落呈粉紅色并在菌落周圍出現(xiàn)膽鹽沉淀 的渾濁圈。三、主要儀器和實(shí)驗(yàn)試劑1、儀器與材料LB培養(yǎng)基，NaOH溶液，氨芐青霉素母液（20mg/mL），無水 乙醇，超純水，限制性核酸內(nèi)切酶Hindlll及其相應(yīng)的Buffer, T4-DNA連接酶及其Buffer，麥康凱培養(yǎng)基，100mmol/L

21、CaCl2 溶液，Omega質(zhì)粒抽提試劑盒，瓊脂糖，TAE電泳緩沖液（50X）， 上樣緩沖液（10X），溴化乙錠（EB）。2、實(shí)驗(yàn)試劑恒溫振蕩培養(yǎng)箱，高速冷凍離心機(jī)，漩渦振蕩器，恒溫水浴 鍋，Eppendorf管，微量移液器，培養(yǎng)皿，三角瓶，酒精燈，量 筒，牛皮紙，接種環(huán)，涂布器，電子天平，微波爐，電泳儀，制 膠槽，電泳槽，凝膠成像檢測儀，瓊脂糖凝膠梳子，手套。3、實(shí)驗(yàn)材料coli DH5a (pUC19)； pUC19 質(zhì)粒；入 DNA。四、實(shí)驗(yàn)步驟1 、酶切在無菌Ep管中按ddHO、buffe、DNA、限制性內(nèi)切酶的順序2 依次加入酶切反應(yīng)的各種成分(各組分的量見 Figure 1)，混

22、勻，4000rpm離心1min，將液體集中于管底。37C, 12小時(shí)， 在-20 C冰箱保存。酶切產(chǎn)物電泳檢測酶切效率，各小組向EP觀眾加8p l上周 得到的酶切反應(yīng)液，并加2p l Loading buffer。加樣序號體系組成I自己提取的pUC19II商品2DNAIII商品pUC191ddHO (ul)213.070.064.0210*Buffer( ul )2.010.08.03DNA (ul)4.015.04.04Hind III(5M/ul)1.05.04.0總計(jì)(ul)20.0100.080.0Figure 1 pUC19質(zhì)粒及入DNA酶切反應(yīng)體系2、連接在無菌 Ep 管中依次加入

23、連接反應(yīng)的各種成分(見 Figure 2)，混勻；4000tpm離線1min，集液于管底;在16C的恒溫水浴鍋中反應(yīng)過夜。組份ddH2010*LigaseBufferpUC19DNA/HindI入DNA/HindIT4-DNA 連 接酶(30U/ul)合計(jì)含3.21.02.03.00.810.量0(ulFigure 2連接反應(yīng)體系3、感受態(tài)細(xì)胞的制備倒LB平板，劃線活化E. coli DH5a 。從LB平板上挑取E. coli DH5a單菌落至5mL LB液體培 養(yǎng)基里，37C振蕩培養(yǎng)過夜。以1%的接種量將過夜培養(yǎng)的E. coli DH5a接種于20mL 新鮮LB液體培養(yǎng)基，220rpm培養(yǎng)2

24、-2.5h。將菌液之于冰浴中。分別取1.5mL菌液于2個(gè)無菌的1.5mL Ep管中，4000rpm 離心5min，棄上清液，收集菌體。每支離心管中加入用冰預(yù)冷的800p l 0.1mol/LCaCl，輕2輕懸浮細(xì)胞，冰上放置10min， 4000rpm離心5min。棄上清液，加入100p LCaCl2溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，冰 上放置20min，即為感受態(tài)細(xì)胞，分裝至50p l/管。4、轉(zhuǎn)化步 1234567驟感受 態(tài)細(xì) 胞DNA冰浴熱擊冰浴復(fù)蘇培養(yǎng)基涂平板I-100連接10mi90s5mLB：含amp麥康凱培實(shí)物nin0.9ml/養(yǎng)基，50p l*2、驗(yàn)5.0管，100p l*2、 150組0.

25、5-1h|J l*2、200ul*|J l*2II-50pUC1910mi90s5mLB：含amp麥康凱培轉(zhuǎn)1.0nin0.9ml/養(yǎng)基， 50J l*1化管，對0.5-1h照m-5010mi90s5mLB：含amp麥康凱培細(xì)nin0.9ml/養(yǎng)基，50J l*1；胞管，麥康凱培養(yǎng)基，對0.5-1h50J l*l照Figure 3 重組質(zhì)粒及轉(zhuǎn)化對照表平板至置于操作臺上10分鐘后，導(dǎo)致于37C溫箱中培養(yǎng)1620h。5、轉(zhuǎn)化子和重組質(zhì)粒的篩選（1）轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在含有氨芐青霉素的 LB 培養(yǎng)基上為白色 菌落，選取六個(gè)白色菌落在另一 LB 培養(yǎng)基上劃線，過夜培養(yǎng)。（2）六個(gè)菌落中選取三個(gè)轉(zhuǎn)接到 3m

26、L 含氨芐青霉素的 LB 培 養(yǎng)基中，37C振蕩培養(yǎng)過夜。6、重組質(zhì)粒的驗(yàn)證（1）取菌液 3.0mL 用試劑盒提取質(zhì)粒。將帶有重組質(zhì)粒的菌體接種5ml于含amp的LB培養(yǎng)基上，37 C搖床過夜；取15ml菌液，室溫下lOOOOrpm離心lmin收集菌體；棄培養(yǎng)基，加入250mp l solutionl/RNaseA混合液，渦旋震蕩使細(xì)胞完全懸?。煌旌弦褐屑尤?50p l solutionll，輕輕顛倒混勻，裂 解時(shí)間不要超過 5min；加入350p lsolution III，溫和顛倒數(shù)次至形成白色絮狀沉淀；室溫， 10000rpm 離心 10min；轉(zhuǎn)移上清液到套有 2ml 收集管的 Hi

27、Bind DNA 結(jié)合柱中，室溫下，lOOOOrpm離心lmin，倒去濾液；柱子重新裝回收集管，加500p l HB Buffer，按上述條件 離心，棄去濾液；柱子重新裝回收集管，加700p lDNA Wash Buffer，按上 述條件離心，棄去濾液；柱子重新裝回收集管， 10000rpm 離心空柱 2min；把柱子裝在干凈的Ep管上，加入50p l Elution Buffer 到柱子基質(zhì)中， 10000rpm 離心 1min 洗脫出 DNA。（2）對有外源基因插入的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶切割，進(jìn)行進(jìn) 一步鑒定。（3）37C保溫 0.5lh。（4）利用空載體 pUC19 片段和目的基因片段為對

28、照，對沒切 后的重組質(zhì)粒的片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，從酶切后片段的數(shù)目 及大小上進(jìn)行確認(rèn)。處理：2p l ddH20, 2p l 質(zhì)粒，1p l loading buffer，輕 彈/用槍吹吸混勻，快速離心集液于管底。五、結(jié)果分析 1、酶切結(jié)果電泳檢驗(yàn)泳道1234567樣品VH 1UXDNA勸II(Test；pUC19(商品)囚（商品HIIIpUCL*J/11IH樣量CpL)5100 ng5.0100 ng5,0川川丨皿作用M對照T對照對照TT(2)Figure 4 酶切檢驗(yàn)上樣順序在電泳圖中，我們第 9 小組的酶切產(chǎn)物在第 14 泳道，主要的 亮帶有兩條。先從位置上看，較近的一條和第5泳道的p

29、UC19（商 品）/Hindlll對齊，說明是這條帶是切開的質(zhì)粒，是線性DNA； 較遠(yuǎn)的一條帶和第 4 泳道的亮帶對齊，說明這條帶是未被切開的 質(zhì)粒，是環(huán)狀DNA。環(huán)狀DNA電泳速率比線性DNA快，這也驗(yàn)證 了“近處條帶是酶切成功的質(zhì)粒，遠(yuǎn)處條帶是未切開的質(zhì)?！钡?說法。再從亮度上看，酶切開的質(zhì)粒的條帶亮度遠(yuǎn)遠(yuǎn)亮于未酶切 開的質(zhì)粒，相比其他組，我們組酶切效果是比較好；但相比商品 化質(zhì)粒的酶切效，我們小組的效果不是很好。在第 6 條帶以后的條帶的遠(yuǎn)處都有寬而暗的模糊條帶，而在 商品化PUC19的泳道里，沒有，這應(yīng)該是未分離干凈的RNA；點(diǎn) 樣槽處亮帶可能是附著蛋白質(zhì)的 DNA 片段、染色體片段等

30、。Figure 5 質(zhì)粒酶切電泳結(jié)果（我們小組的是第 14 泳道的，第4泳道是未酶切的pUC19,第5泳道是酶切的商品化質(zhì)粒，第1、3泳道為酶切的2DNA）2、轉(zhuǎn)化結(jié)果觀察與分析實(shí)驗(yàn)設(shè)組丄寺辛甘 培養(yǎng)基涂布平板培養(yǎng)結(jié)果I -試驗(yàn)組含amp的 麥康凱培 辛甘養(yǎng)基50p *2平均每個(gè)平板17個(gè)菌落，其中2個(gè)白斑100p *2平均每個(gè)平板40個(gè)菌落，其中3個(gè)白斑150p *2平均每個(gè)平板65個(gè)菌落，其中5個(gè)白斑200p *2平均每個(gè)平板100個(gè)菌落II -轉(zhuǎn)化對照含amp的 麥康凱培 辛甘養(yǎng)基50p *1多于100個(gè)菌落，均為紅斑III-細(xì)胞對照含amp的 麥康凱培 辛甘養(yǎng)基50p *1沒有菌落不含amp 的麥康凱丄寺辛甘 培養(yǎng)基50p *1菌洛數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于100個(gè)，培養(yǎng)基變?yōu)殚冱S色Figure 6 轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析氨芐青霉素（amp）用于篩選轉(zhuǎn)化進(jìn)質(zhì)粒PUC19的大腸桿菌。 細(xì)胞對照組中的大腸桿菌沒有轉(zhuǎn)入PUC19，而氨芐青霉素抗性存 在于 pUC19 上，所以細(xì)胞對照組無法在含 amp