氮源和碳源對冬凌草愈傷組織生長及迷迭香酸的積累的影響

1、氮源和碳源對冬凌草愈傷組織生長及迷迭香酸的積累的影響【摘要】目的研究碳源、氮源對冬凌草愈傷組織生長及其內(nèi)迷迭香酸積累的影響。方法改變培養(yǎng)基中蔗糖濃度和碳源種類，考察不同碳源及其濃度對愈傷組織生長和迷迭香酸積累的影響。在總氮源不變的情況下改變N3-/NH4+的比例，考察不同N3-/NH4+比例對愈傷組織生長和迷迭香酸積累的影響。結(jié)果蔗糖是冬凌草愈傷組織培養(yǎng)中的最正確的碳源，其濃度為3%時(shí)，有利于冬凌草愈傷組織的生長和迷迭香酸的積累;N3-/NH4+比例為11時(shí)，愈傷增值倍數(shù)最高；N3-/NH4+比例21時(shí)，迷迭香酸的積累量最大。結(jié)論實(shí)驗(yàn)確定了冬凌草愈傷組織培養(yǎng)的最正確碳源種類、濃度及氮源比例,說

2、明不同碳源、氮源對冬凌草愈傷組織生長和次生代謝物合成有顯著影響。【關(guān)鍵詞】冬凌草；愈傷組織；碳源；氮源；迷迭香酸Abstrat：bjetiveTstudytheeffetsfarbn,nitrgenngrthandrsariniaidauulatinfRabdsiarubesens(Hensl.)Haraallus.ethdsTheallusgrthandrsariniaidauulatinerestudiedbyanipulatinfnentratinsurse,arbnandnitrgen.ResultsSurseasthebestfrtheallusgrthandrsariniaidau

3、ulatin.30g/Lsurseasfavrablefrallusultipliatinandrsariniaidauulated.Theaxiuallusultipliatin,ntentfauulatedrsariniaidereahievedhiletheratifN3-andNH4+as11，21，respetivelyhennentratinfttalnitrgensureaskeptatthesaelevel.nlusinVariusarbn,nitrgenhavesignifianteffetsngrthandrsariniaidauulatinfRabdsiarubesens

4、(Hensl.)Haraallus.Thebestarbnsureanditsnentratin,nitrgensuresfrthegrthfRabdsiarubesens(Hensl.)Haraallusandthesynthesisfsendaryetabliteerenfired.Keyrds：Rabdsiarubesens(Hensl.)Hara;allus;arbn;Nitrgen;Rsariniaid冬凌草Rabdsiarubesens(Hensl.)Hara為唇形科香茶菜屬多年生植物,其入藥部位是地上局部。近年來許多學(xué)者對冬凌草化學(xué)成分、藥理作用及臨床療效進(jìn)展了研究，發(fā)現(xiàn)其中的主

5、要抗癌、抗菌活性成分為二萜類化合物冬凌草甲素、冬凌草乙素和多酚類化合物迷迭香酸，并對其作了較深化的研究1,2。國內(nèi)學(xué)者在冬凌草組織培養(yǎng)方面也開展了相關(guān)工作35，但均不夠系統(tǒng)和完善，且未對影響其愈傷培養(yǎng)物生長及其內(nèi)次生代謝產(chǎn)物積累的因素進(jìn)展研究。迷迭香酸作為冬凌草水溶性局部中主要的有效成分，具有較好的抗菌、消炎、止痛的成效,為此，筆者在本實(shí)驗(yàn)室對冬凌草離體培養(yǎng)研究的根底上6,7，對影響其愈傷組織生長和代謝產(chǎn)物積累的碳、氮源種類及蔗糖濃度進(jìn)展了研究，并考察了這些因素對其內(nèi)主要次生代謝產(chǎn)物迷迭香酸和冬凌草甲素的影響(因在整個(gè)愈傷組織培養(yǎng)過程中未檢測到冬凌草甲素,故其積累規(guī)律在文中未進(jìn)展討論)，為進(jìn)一

6、步進(jìn)步冬凌草培養(yǎng)物內(nèi)有效成分產(chǎn)量、優(yōu)化培養(yǎng)條件提供根據(jù)。1材料與方法1.1愈傷組織的獲得以冬凌草葉片作為外植體，在S附加6-BA2.0g/L，NAA1.0g/L的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，將誘導(dǎo)出的愈傷組織在上述培養(yǎng)基上，經(jīng)過34代的培養(yǎng)，形成質(zhì)地較為均勻的愈傷組織。1.2蔗糖濃度處理將繼代培養(yǎng)獲得的愈傷組織接種到蔗糖濃度為1%，2%，3%，4%，5%的愈傷生長培養(yǎng)基上，每瓶46塊愈傷組織，每個(gè)處理重復(fù)8次，并稱取接種時(shí)的接種量，培養(yǎng)25d后，統(tǒng)計(jì)不同蔗糖濃度下愈傷組織的收獲量，培養(yǎng)過程中觀察愈傷組織的的生長情況。1.3碳源處理分別以蔗糖、葡萄糖、果糖為碳源，濃度為3。將繼代培養(yǎng)獲得的愈傷組織接種

7、于附加6-BA2.0g/L，NAA1.0g/L的S培養(yǎng)基，每瓶46塊愈傷組織，每個(gè)處理重復(fù)8次，并稱取接種時(shí)的接種量，培養(yǎng)25d后，稱重不同碳源下愈傷組織的收獲量，計(jì)算愈傷組織的增殖倍數(shù)，培養(yǎng)過程中觀察愈傷組織在不同碳源上的生長情況。1.4氮源處理在總氮量不變的情況下，將繼代培養(yǎng)獲得的愈傷組織接種到改變N3-/NH4+比例的S培養(yǎng)基上。每瓶接種46塊愈傷組織，每個(gè)處理重復(fù)8次，并稱取接種時(shí)的接種量，培養(yǎng)25d后，統(tǒng)計(jì)不同氮源下愈傷組織的收獲量，培養(yǎng)過程中觀察愈傷組織的生長情況。1.5迷迭香酸含量的測定1.5.1樣品的處理將各個(gè)處理的冬凌草愈傷組織，置于烘箱中，80烘至恒重，用研缽研成粉末。精細(xì)

8、稱定粉末0.25g，置于50l的三角瓶中，每次加甲醇20l，超聲提取30in，提取兩次，合并濾液，回收溶劑，用甲醇溶解殘?jiān)ㄈ萦?l的容量瓶中，用0.45微孔濾膜過濾，備用。1.5.2色譜條件日本島津L-20A，色譜柱：DS柱184.6250，流動(dòng)相：甲醇-0.5%磷酸水溶液4060，檢測波長：335n，流速：1.0l/in，柱溫：25。迷迭香酸為Y=2447526.68X7443410.80，r=0.999，迷迭香酸進(jìn)樣量2.558.925g時(shí)，線性良好。2結(jié)果2.1不同蔗糖濃度對冬凌草愈傷組織生長和迷迭香酸積累的影響冬凌草愈傷組織在不同蔗糖濃度上的生長情況見表1。由表1可知，隨著蔗糖濃度

9、的增加，愈傷組織的顏色由淡黃綠色變?yōu)樯罹G色，質(zhì)地由疏松狀態(tài)逐漸變得較為致密，愈傷增殖倍數(shù)也逐漸增加，但當(dāng)蔗糖濃度為5時(shí)，其增殖倍數(shù)有又所降低。從愈傷生長及其增殖來看，以3、4蔗糖濃度培養(yǎng)愈傷時(shí)其生長情況較好，此時(shí)愈傷組織質(zhì)地較為致密，顏色為翠綠色且未見褐化現(xiàn)象或褐化率較低，愈傷增殖倍數(shù)較高，分別為1.58，1.69倍。而從迷迭香酸的積累來看，5的蔗糖濃度最有利于迷迭香酸的合成，此時(shí)其含量最高，為1.52，其次為3%的蔗糖濃度。2蔗糖濃度最不利于迷迭香酸的積累，此時(shí)其含量最低，為0.68。綜合經(jīng)濟(jì)本錢、愈傷生長情況、迷迭香酸積累來看，冬凌草愈傷組織培養(yǎng)時(shí)以3%的蔗糖濃度為最正確。表1不同蔗糖濃度

10、對愈傷組織生長和迷迭香酸積累的影響略轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2.2不同碳源對冬凌草愈傷組織生長和迷迭香酸積累的影響分別以蔗糖、葡萄糖及果糖作為碳源培養(yǎng)冬凌草愈傷組織，發(fā)現(xiàn)碳源種類對其生長情況有明顯的影響。結(jié)果見表2。從表2中可以看出，以蔗糖作為碳源時(shí)愈傷組織顏色為翠綠色，質(zhì)地最為致密，沒有褐化現(xiàn)象且愈傷組織的增殖倍數(shù)最大，為14.5倍。迷迭香酸的含量為1.41%。以葡萄糖作為碳源時(shí)愈傷組織顏色為黃綠色，質(zhì)地比擬致密，培養(yǎng)過程中愈傷組織外表出現(xiàn)褐化斑點(diǎn)，愈傷褐化率為0.10%，愈傷組織的增殖倍數(shù)為8.72，迷迭香酸的含量最低，為1.06%，當(dāng)以果糖作為碳源時(shí)愈傷組織顏色為淡黃白色，質(zhì)地比擬疏松，培

11、養(yǎng)過程中愈傷組織褐化比擬嚴(yán)重，褐化率為57.34%。其愈傷組織增殖倍數(shù)也最低，僅為7.2倍。但此時(shí)迷迭香酸的含量最高，為1.54%。但綜合愈傷生長、增殖倍數(shù)及迷迭香酸含量來看，蔗糖是冬凌草愈傷組織培養(yǎng)時(shí)的最正確碳源。表2不同碳源對愈傷組織生長及迷迭香酸積累的影響略2.3不同氮源對愈傷組織生長和迷迭香酸積累影響培養(yǎng)基中N3-/NH4+的比例對冬凌草愈傷組織的生長有很大的影響，由表3可知，當(dāng)以N3-作為唯一氮源時(shí)，愈傷組織顏色為黃綠色，質(zhì)地致密，且僅頂端有少量的褐化斑點(diǎn)，褐化率為4.5%，隨著NH4+的參加N3-/NH4+為31，愈傷顏色變?yōu)榈G色，質(zhì)地較致密，但褐化斑點(diǎn)幾乎遍布整個(gè)愈傷組織，褐化

12、率到達(dá)了42.62%。當(dāng)N3-/NH4+進(jìn)一步降低為21時(shí)，愈傷顏色為淡黃綠色，質(zhì)地致密，僅頂端偶見褐化斑點(diǎn)，褐化率為0.05%，當(dāng)N3-/NH4+為11時(shí)，顏色變?yōu)辄S褐色，質(zhì)地很疏松，愈傷根本全部褐化，褐化率為100。從愈傷組織的增殖倍數(shù)來看，N3-/NH4+為31時(shí)，愈傷增殖倍數(shù)最低，為10.37倍。N3-/NH4+為11時(shí)，愈傷增殖倍數(shù)最高，為16.92倍，但該配比下愈傷嚴(yán)重褐化。其次為N3-/NH4+21時(shí)。從次生代謝物的積累來看，當(dāng)以N3-作為唯一氮源和N3-/NH4+為21時(shí)，有利于迷迭香酸的積累，其他處理下的含量均較低。綜合生長情況、愈傷增殖及迷迭香酸的合成來看，N3-/NH4+

13、為21時(shí)是最正確培養(yǎng)基。表3氮源對愈傷組織生長及迷迭香酸積累的影響略3討論糖是培養(yǎng)基中不可缺少的碳源，在植物組織培養(yǎng)時(shí)主要起到提供物質(zhì)能量和維持浸透壓的作用。其種類和濃度對培養(yǎng)物的生長和次生代謝產(chǎn)物的積累起著主要的作用。在植物組織培養(yǎng)中通常采用蔗糖、葡萄糖。盡管有些研究說明葡萄糖對植物細(xì)胞的生長和次生代謝產(chǎn)物的積累有利，但多數(shù)實(shí)驗(yàn)證明組織培養(yǎng)時(shí)，以采用蔗糖作為碳源最好。本研究也說明綜合冬凌草愈傷組織的生長和次生代謝物的積累來看，以蔗糖作為碳源是最為有利。并且發(fā)現(xiàn)蔗糖濃度的上下對愈傷生長及代謝產(chǎn)物的積累有著明顯的影響。從1%4%，愈傷增殖倍數(shù)隨蔗糖濃度增加而增加，蔗糖濃度為3時(shí)，無褐化現(xiàn)象，且增

14、殖略低于4。4時(shí)，雖愈傷增殖倍數(shù)最高，但有褐化現(xiàn)象，但當(dāng)蔗糖濃度進(jìn)一步增加時(shí)5%，愈傷增殖倍數(shù)反而降低，這可能與蔗糖濃度過高，培養(yǎng)基的浸透壓大，不利于愈傷生長有關(guān)。高濃度的蔗糖濃度雖然抑制了愈傷組織的生長但有利于次生代謝產(chǎn)物的積累，本研究說明，迷迭香酸含量在蔗糖濃度到達(dá)5%時(shí)，到達(dá)最高。說明適當(dāng)進(jìn)步浸透壓有利于迷迭香酸的合成,這一點(diǎn)與前人對唇形科植物彩色紫蘇、紫草科植物紫草的細(xì)胞相一致8。但綜合經(jīng)濟(jì)本錢、愈傷生長及迷迭香酸的積累來看，認(rèn)為冬凌草愈傷培養(yǎng)時(shí)采用3%蔗糖濃度最正確。氮源在培養(yǎng)基的表現(xiàn)形式主要是氨態(tài)氮和硝態(tài)氮，有關(guān)氮源對有效成分的積累影響報(bào)道很多。如在長春花細(xì)胞培養(yǎng)的研究中發(fā)現(xiàn)，氮源的參加可以促進(jìn)細(xì)胞的生長，在雷公藤培養(yǎng)中，增加KN3的濃度有利于細(xì)胞內(nèi)二萜內(nèi)酯的積累。氨態(tài)氮