NGS與感染性疾病年月培訓(xùn)課件

1、NGS與感染性疾病年月培訓(xùn)課件2003年完成了人類(lèi)基因組計(jì)劃2003年完成了人類(lèi)基因組計(jì)劃該計(jì)劃的完成使得人們強(qiáng)烈的意識(shí)到人們需要更多更好的技術(shù)與數(shù)據(jù)分析能力來(lái)回答隨之而來(lái)的一系列生物學(xué)問(wèn)題。然而，通量的限制以及居高不下的測(cè)序成本成為了人們進(jìn)一步了解基因組的一道坎。該計(jì)劃的完成使得人們強(qiáng)烈的意識(shí)到人們需要更多更好的技術(shù)與數(shù)據(jù)下一代測(cè)序（next-generation sequencing，NGS）2000年之后推出的高通量測(cè)序平臺(tái)很好地解決了這個(gè)問(wèn)題，人類(lèi)基因組測(cè)序的成本直接因此下降50000倍產(chǎn)生了一個(gè)新的名詞：NGS下一代測(cè)序（next-generation sequenci一、NGS是什

2、么？（一）傳統(tǒng)的測(cè)序方式大規(guī)模平行簽名測(cè)序（Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、聚合酶克?。≒olony Sequencing）、454焦磷酸測(cè)序（454 pyrosequencing）、Illumina (Solexa) sequencing、ABI SOLiD sequencing、離子半導(dǎo)體測(cè)序（Ion semiconductor sequencing）、DNA 納米球測(cè)序 （DNA nanoball sequencing）等一、NGS是什么？（一）傳統(tǒng)的測(cè)序方式（二）NGS(next generation sequencing)

3、包括二代的大規(guī)模平行測(cè)序和三代的單分子測(cè)序。高通量測(cè)序技術(shù)是對(duì)傳統(tǒng)測(cè)序一次革命性的改變，一次對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定被稱(chēng)為下一代測(cè)序技術(shù)(next generation sequencing)足見(jiàn)其劃時(shí)代的改變（二）NGS(next generation sequenc同時(shí)高通量測(cè)序使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能，所以又被稱(chēng)為深度測(cè)序同時(shí)高通量測(cè)序使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分（三）測(cè)序平臺(tái)1、Illumina公司的Solexa測(cè)序平臺(tái)2、Roche公司的454測(cè)序平臺(tái)3、ABI公司的寡核苷酸連接檢測(cè)平臺(tái)(SOLiD)（三）測(cè)序平臺(tái)1、

4、Illumina公司的Solexa測(cè)序平臺(tái)（四）NGS特點(diǎn)1、不同平臺(tái)測(cè)序方法不同，但原理有著共通之處，都是將基因組DNA隨機(jī)切割成小片段DNA，再通過(guò)構(gòu)建文庫(kù)、PCR擴(kuò)增等技術(shù)流程獲得測(cè)序模板進(jìn)行測(cè)序及數(shù)據(jù)分析，相對(duì)于Sanger測(cè)序來(lái)說(shuō)通量高、速度快、費(fèi)用低（四）NGS特點(diǎn)1、不同平臺(tái)測(cè)序方法不同，但原理有著共通之處（四）NGS特點(diǎn)1、高準(zhǔn)確性，高通量，高靈敏度2、可以同時(shí)完成傳統(tǒng)基因組學(xué)研究（測(cè)序和注釋?zhuān)┮约肮δ芑蚪M學(xué) （基因表達(dá)及調(diào)控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究（四）NGS特點(diǎn)1、高準(zhǔn)確性，高通量，高靈敏度（四）NGS特點(diǎn)2、越來(lái)越多地應(yīng)用第二代測(cè)序技術(shù)來(lái)解決生物學(xué)問(wèn)題。比如

5、在基因組水平上對(duì)還沒(méi)有參考序列的物種進(jìn)行從頭測(cè)序，獲得該物種的參考序列，為后續(xù)研究和分子育種奠定基礎(chǔ)；對(duì)有參考序列的物種，進(jìn)行全基因組重測(cè)序，在全基因組水平上掃描并檢測(cè)突變位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)個(gè)體差異的分子基礎(chǔ)。（四）NGS特點(diǎn)2、越來(lái)越多地應(yīng)用第二代測(cè)序技術(shù)來(lái)解決生物學(xué)NGS與感染性疾病年月培訓(xùn)課件NGS與感染性疾病年月培訓(xùn)課件中科院動(dòng)物研究所已經(jīng)測(cè)序、組裝和分析了38只野生金絲猴的基因組突變。這項(xiàng)研究結(jié)果發(fā)表在國(guó)際分子生物學(xué)和進(jìn)化領(lǐng)域的權(quán)威期刊Molecular Biology and Evolution中科院動(dòng)物研究所已經(jīng)測(cè)序、組裝和分析了38只野生金絲猴的基因二、NGS可以為感染性疾病做什么？二

6、、NGS可以為感染性疾病做什么？（一）宏基因組學(xué)（Metagenomics）又叫微生物環(huán)境基因組學(xué)、元基因組學(xué)。它通過(guò)直接從環(huán)境樣品中提取全部微生物的DNA,構(gòu)建宏基因組文庫(kù)，研究環(huán)境樣品所包含的全部微生物的遺傳組成及其群落功能。（一）宏基因組學(xué)（Metagenomics）又叫微生物環(huán)境基NGS與感染性疾病年月培訓(xùn)課件對(duì)特定環(huán)境中全部微生物的總DNA（也稱(chēng)宏基因組，metagenomic）進(jìn)行克隆，并通過(guò)構(gòu)建宏基因組文庫(kù)和篩選等手段獲得新的生理活性物質(zhì)，通過(guò)系統(tǒng)學(xué)分析獲得該環(huán)境中微生物的遺傳多樣性和分子生態(tài)學(xué)信息對(duì)特定環(huán)境中全部微生物的總DNA（也稱(chēng)宏基因組，metage宏基因組學(xué)研究的對(duì)象是

7、特定環(huán)境中的總DNA，不是某特定的微生物或其細(xì)胞中的總DNA，不需要對(duì)微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)和純化，這對(duì)我們認(rèn)識(shí)和利用95%以上的未培養(yǎng)微生物提供了一條新的途徑。宏基因組學(xué)研究的對(duì)象是特定環(huán)境中的總DNA，不是某特定的微生不僅能夠從整體上認(rèn)識(shí)微生物群落自身數(shù)量和組成結(jié)構(gòu)，而且可以認(rèn)識(shí)微生物群落自身及其與宿主之間的進(jìn)化關(guān)系，研究不同狀態(tài)對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的影響，分析人類(lèi)正常菌群和疾病狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)和功能特征。不僅能夠從整體上認(rèn)識(shí)微生物群落自身數(shù)量和組成結(jié)構(gòu)，而且可以認(rèn)腸道微生物宏基因組學(xué)與人體代謝、免疫等各方面聯(lián)系緊密，已成為近年來(lái)熱門(mén)的研究主題，腸道菌群和糖尿病、肥胖癥等代謝性疾病的關(guān)系被不斷深

8、入研究，對(duì)于藥物和腸道微生物群落的相互影響也在不斷探索腸道微生物宏基因組學(xué)與人體代謝、免疫等各方面聯(lián)系緊密，已成為NGS與感染性疾病年月培訓(xùn)課件（二）精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)（二）精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)1、第二屆感染性疾病精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)高峰論壇感染性（傳染性）疾病危害嚴(yán)重，精準(zhǔn)診斷是實(shí)現(xiàn)其精準(zhǔn)防控的前提。目前針對(duì)性使用抗生素是一個(gè)重大課題，另外即時(shí)快速病原診斷、未知病原鑒定、混合感染病原診斷、全病程病原監(jiān)測(cè)等問(wèn)題都值得重視和研究。1、第二屆感染性疾病精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)高峰論壇感染性（傳染性）疾病危害針對(duì)感染這一重大醫(yī)學(xué)問(wèn)題，需要將基因檢測(cè)與傳統(tǒng)檢測(cè)相結(jié)合，加快將最新的生物科技轉(zhuǎn)化成先進(jìn)生產(chǎn)力，應(yīng)用于臨床感染精準(zhǔn)診療。基于下一代測(cè)序技術(shù)（N

9、GS）的宏基因組學(xué)檢測(cè)技術(shù)發(fā)展迅猛，將有力推動(dòng)感染性疾病精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)發(fā)展。針對(duì)感染這一重大醫(yī)學(xué)問(wèn)題，需要將基因檢測(cè)與傳統(tǒng)檢測(cè)相結(jié)合，加NGS在感染性疾病中的應(yīng)用NGS在感染性疾病中的應(yīng)用NGS技術(shù)應(yīng)用于細(xì)菌感染檢測(cè)，明確是否存在細(xì)菌感染對(duì)菌株進(jìn)行分型，獲得分子血清型、耐藥基因譜等信息，分析其菌株進(jìn)化歷史、感染源及感染路徑，有助于疾病預(yù)防、診療和疫苗研發(fā)等。NGS技術(shù)應(yīng)用于細(xì)菌感染檢測(cè)，明確是否存在細(xì)菌感染結(jié)核桿菌耐藥菌株培養(yǎng)難度高，時(shí)間長(zhǎng)，臨床檢測(cè)受到極大限制。但基因測(cè)序技術(shù)在檢測(cè)其菌株毒力和耐藥性上有著極大的優(yōu)勢(shì)，可以快速檢測(cè)病原體感染及其耐藥性有望取代現(xiàn)有的培養(yǎng)和分子診斷法結(jié)核桿菌耐藥病毒NG

10、S技術(shù)主要應(yīng)用于基因型分析、耐藥突變檢測(cè)及病毒在宿主體內(nèi)演化，以及暴發(fā)感染病毒的快速檢測(cè)時(shí)以協(xié)助預(yù)防、診斷治療及疫苗研究等方面。病毒真菌通過(guò)建立本地真菌基因組學(xué)數(shù)據(jù)并對(duì)比分析，不僅可以進(jìn)行真菌感染快速準(zhǔn)確診斷，還能夠發(fā)現(xiàn)不同真菌特有的功能性基因，研究其致病機(jī)制及藥物耐藥位點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶位點(diǎn)，從而開(kāi)發(fā)具有廣譜、不良反應(yīng)低、無(wú)交叉耐藥性的抗真菌藥物。真菌通過(guò)建立本地真菌基因組學(xué)數(shù)據(jù)并對(duì)比分析，不僅可以進(jìn)行真菌2011年5月以德國(guó)為中心，歐洲暴發(fā)了一次嚴(yán)重的出血性腸道感染，科學(xué)家對(duì)病菌菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)致病元兇為致死性的大腸埃希菌O104：H4，通過(guò)對(duì)序列的分析推斷其感染人體的途

11、徑和致病機(jī)制，溯源追蹤了其感染路徑，為疫病的診斷和治療提供了重要信息。2011年5月以德國(guó)為中心，歐洲暴發(fā)了一次嚴(yán)重的出血性腸道感同年6月法國(guó)也發(fā)生了類(lèi)似感染，NGS序列分析發(fā)現(xiàn)德國(guó)大腸埃希菌菌株基因多樣性遠(yuǎn)低于法國(guó)菌株，由此確認(rèn)其為法國(guó)暴發(fā)病原體的演化支，明確了感染源同年6月法國(guó)也發(fā)生了類(lèi)似感染，北京協(xié)和醫(yī)院在International Journal of Infectious Diseases發(fā)表了國(guó)內(nèi)mNGS用于臨床中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS) 感染患者布氏桿菌檢出的文章。2016年6月1日至2017年6月1日臨床懷疑CNS感染患者的腦脊液樣本。mNGS快速檢出4例患者布氏桿菌感染，結(jié)合臨

12、床癥狀和RT-PCR結(jié)果驗(yàn)證，患者確診為神經(jīng)型布氏桿菌病。mNGS檢出序列數(shù)從11-104不等，覆蓋度從0.0043%-0.4%不等。4例布氏桿菌感染的確診，展現(xiàn)了mNGS在臨床疑難感染病原檢測(cè)應(yīng)用的突出優(yōu)勢(shì)。北京協(xié)和醫(yī)院在International Journal 8月齡患兒 “發(fā)熱12天，間斷抽搐8天，睡眠增多6天”就診，持續(xù)間歇性高熱和抽搐。通過(guò)mNGS技術(shù)檢出單純皰疹病毒1型 (HSV-1) 序列數(shù)高達(dá)35078條，占比99.66%，覆蓋度為95%，在相對(duì)比例和病毒基因組覆蓋度方面都達(dá)到了明確診斷HSV-1感染的強(qiáng)度。8月齡患兒 “發(fā)熱12天，間斷抽搐8天，睡眠增多6天”就診，隨后甘露

13、醇降顱壓后，阿昔洛韋抗病毒及其他對(duì)癥治療后患兒痊愈出院。本文表明除不容易發(fā)現(xiàn)的病原外，mNGS針對(duì)較為常見(jiàn)的皰疹病毒具有明確診斷意義，為臨床不明原因的CNS感染性疾病提供了重要的病原學(xué)診斷方法。隨后甘露醇降顱壓后，阿昔洛韋抗病毒及其他對(duì)癥治療后患兒痊愈出2014年西非暴發(fā)了記錄中最大的一次埃博拉病毒感染，暴發(fā)時(shí)間長(zhǎng)，感染和死亡人數(shù)高，在世界范圍內(nèi)引起了極大恐慌。2014年西非暴發(fā)了記錄中最大的一次埃博拉病毒感染，暴發(fā)時(shí)間通過(guò)NGS技術(shù)結(jié)合數(shù)據(jù)分析，研究者明確了其基因多樣性和易突變性及流行病學(xué)特征，追蹤其感染起始源及感染路徑，預(yù)估了病毒感染人體和機(jī)體免疫反應(yīng)的過(guò)程，詳細(xì)闡述了其在宿主體內(nèi)通過(guò)逐漸

14、適應(yīng)性突變發(fā)生的演化從而減小被免疫細(xì)胞識(shí)別的機(jī)會(huì)，對(duì)疫情的預(yù)防、控制，疾病的診斷、治療和疫苗的研發(fā)都起到了極大的促進(jìn)作用通過(guò)NGS技術(shù)結(jié)合數(shù)據(jù)分析，研究者明確了其基因多樣性和易突變?nèi)?、三代測(cè)序美國(guó)太平洋生物的單分子實(shí)時(shí)技術(shù)及英國(guó)牛津納米孔公司的納米孔單分子測(cè)序技術(shù)特點(diǎn)是不需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)不同手段區(qū)分堿基信號(hào)差異，直接讀取序列信息，其讀長(zhǎng)長(zhǎng)、高通量，可以對(duì)RNA和甲基化DNA序列進(jìn)行直接測(cè)序三、三代測(cè)序美國(guó)太平洋生物的單分子實(shí)時(shí)技術(shù)及英國(guó)牛津納米孔公四、缺點(diǎn)目前還存在錯(cuò)誤率高、成本較高和生物信息分析軟件不夠豐富等缺點(diǎn)。高通量測(cè)序會(huì)產(chǎn)生大批量的數(shù)據(jù)，需要進(jìn)行龐大的數(shù)據(jù)分析，如果缺乏本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)，運(yùn)算工作的成本和時(shí)間難以控制；四、缺點(diǎn)目前還存在錯(cuò)誤率高、成本較高和生物信息分析軟件不夠豐四、缺點(diǎn)對(duì)于疾病，測(cè)序得到的基因組數(shù)據(jù)