蛋白質(zhì)印跡分析實(shí)驗(yàn)原理和操作步驟

1、蛋白質(zhì)印跡分析實(shí)驗(yàn)原理和操 作步驟蛋白質(zhì)印跡分析實(shí)驗(yàn)原理和操作步驟蛋白質(zhì)印跡法又稱為免疫印跡法，這是一種可以檢測固定在固相載體上蛋白質(zhì)的免疫化學(xué)技術(shù)方法。待測蛋白既可以是粗提物也可以經(jīng)過一定的分離和純化，另外這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用需要利用待測蛋白的單克隆或多克隆抗體進(jìn)行識(shí)別。關(guān)鍵詞：印跡蛋白質(zhì)步驟蛋白質(zhì)印跡分析蛋白質(zhì)印跡Westernblottingimmunoblotting免疫印跡法蛋白質(zhì)印跡法【實(shí)驗(yàn)原理】11蛋白質(zhì)印跡法又稱為免疫印跡法，這是一種可以 檢測固定在固相載體上蛋白質(zhì)的免疫化學(xué)技術(shù) 方法。待測蛋白既可以是粗提物也可以經(jīng)過一定 的分離和純化，另外這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用需要利用待 測蛋白的單克隆或

2、多克隆抗體進(jìn)行識(shí)別。11蛋白質(zhì)印跡法基本操作過程如圖所示，可溶性抗原，也就是待測蛋白首先要 根據(jù)其性質(zhì)，如分子量，分子大小，電荷以及其 等電點(diǎn)等采用不同的電泳方法進(jìn)行分離；通過電 流將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上； 利用抗體（一抗）與抗原發(fā)生特異性結(jié)合的原理, 以抗體作為探針釣取目的蛋白。值得注意的是在 加入一抗前應(yīng)首先加入非特異性蛋白，如牛血清 白蛋白對膜進(jìn)行“封阻”而防止抗體與膜的非特 異性結(jié)合。經(jīng)電泳分離后的蛋白往往需再利用電泳方法將 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體上,我們把這個(gè)過程稱為 電泳印跡。常用的兩種電轉(zhuǎn)移方法分別為:liiJ1.半干法：凝膠和固相載體被夾在用緩沖溶液浸 濕的濾紙之

3、間，通電時(shí)間為10分鐘30分鐘。liiJ2濕法：凝膠和固相載體夾心浸放在轉(zhuǎn)移緩沖溶 液中，轉(zhuǎn)移時(shí)間可從45分鐘延長到過夜進(jìn)行。由于濕法的使用彈性更大并且沒有明顯浪費(fèi)更 多的時(shí)間和原料，因此我們在這里只描述濕法的 基本操作過程。對于目的蛋白的識(shí)別需要采用能夠識(shí)別一抗的 第二抗體。該抗體往往是購買的成品，已經(jīng)被結(jié) 合或標(biāo)記了特定的試劑，如辣根過氧化物酶。這 種標(biāo)記是利用辣根過氧化物酶所催化的一個(gè)比 色反應(yīng)，該反應(yīng)的產(chǎn)物有特定的顏色且固定在固 相載體上，容易鑒別。因此可通過對二抗的識(shí)別 而識(shí)別一抗，進(jìn)而判斷出目標(biāo)蛋白所在的位置。其他的識(shí)別系統(tǒng)包括堿性磷酸酶系統(tǒng)和125 I標(biāo)記 系統(tǒng)。1.實(shí)驗(yàn)器材SD

4、S/PAGE實(shí)驗(yàn)相關(guān)材料；電轉(zhuǎn)移裝置；供電 設(shè)備；PVDF膜(Millipore Immobion-P #IPV H 000 10)； Whatman 3MM 紙；其他工具: 淺盤。鑷子、海綿墊、剪子、手套、小塑料或玻璃容器、nil鑷子、海綿墊、剪子、手套、小塑料或玻璃容器、nil易生物儀器庫：/yp/pro duct-list-42.html易生物試劑庫：/yp/pro duct-list-43.html 2.實(shí)驗(yàn)試劑10 x轉(zhuǎn)移緩沖溶液(1L)： 30.3g Trizma base(0.25M), 144 g 甘氨酸(1.92M),加蒸餾水 至1L,此時(shí)pH約為8.3,不必調(diào)整。1x轉(zhuǎn)移緩

5、沖溶液(2L):在1.4L蒸餾水中 加入400 ml甲醇及200 ml10 x轉(zhuǎn)移緩沖溶 液。TBS緩沖溶液:將1.22g Tris (10 mM)和8. 78g NaCl(150 mM)加入到1L蒸餾水中，用H Cl調(diào)節(jié)pH至7.5。TTBS buffer：在1L TBS緩沖溶液中加入 0.5ml Tween 20 (0.05%)。一抗：兔抗待測蛋白抗體(多克隆抗體)。(6)二抗：辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔。匕田3%封阻緩沖溶液(0.5L):牛血清白蛋白1 5mg加入TBS緩沖溶液并定容至0.5L，過濾， 在4C保存以防止細(xì)菌污染。匕田0.5%0.5%封阻緩沖溶液(0.5L)：牛血清白蛋白hi

6、2.5mg加入TTBS緩沖溶液并定容至0.5L，過濾，在4C保存以防止細(xì)菌污染。 顯影試劑：1ml氯萘溶液(30mg/ml甲醇配 置)，加入10 ml甲醇，加入TBS緩沖溶液至50 ml，加入 30 ul 30% H2O2。 染色液：1g氨基黑18B (0.1%)，250ml異丙醇(25%)及100ml乙酸(10%)用蒸餾水定容至1L。Q1)脫色液：將350ml異丙醇(35%)和20 ml乙酸(2%)用蒸餾水定容至1L?！緦?shí)驗(yàn)操作】1 .蛋白質(zhì)的分離 根據(jù)目的蛋白的性質(zhì)，利用電泳方法將其進(jìn)行分 離。為提高電轉(zhuǎn)移的效率，通常采用SDS/PAG E技術(shù)。分離實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，首先將樣品墻的上邊緣用小刀

7、去除，然后在膠板的右上角切一個(gè)小口以便定 位，小心放入轉(zhuǎn)移緩沖溶液中待用。2.電轉(zhuǎn)移 準(zhǔn)備PVDF膜in?根據(jù)膠的大小剪出一片PVDF膜，膜的大小應(yīng)略 微小于膠的大小。將膜置于甲醇中浸泡1分鐘， 再移至轉(zhuǎn)移緩沖溶液中待用。in?l】口l】口I箱墊紙膜紙墊色始VDF肢虬綿X海3MPV攝 a 海:夾心放置順序宛忍歌以宜座溷I制作膠膜夾心在一淺盤中打開轉(zhuǎn)移盒，將一個(gè)預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖 溶液浸泡過的海綿墊放在轉(zhuǎn)移盒的黑色篩孔板 上，在海綿墊的上方放置經(jīng)轉(zhuǎn)移緩沖溶液浸濕的 3MM紙，小心地將膠板放在3MM紙上，并注意 排除氣泡。將PVDF膜放在膠的上方同時(shí)注意排 除氣泡，再在膜的上方放上一張同樣用轉(zhuǎn)移緩沖

8、溶液浸濕過的3MM紙并趕出氣泡，放置另一張 浸泡過的海綿墊，關(guān)閉轉(zhuǎn)移盒。將轉(zhuǎn)移盒按照正 確的方向放入轉(zhuǎn)移槽中，轉(zhuǎn)移盒的黑色篩孔板貼 近轉(zhuǎn)移槽的黑色端，轉(zhuǎn)移盒的白色篩孔板貼近轉(zhuǎn) 移槽的白色端，填滿轉(zhuǎn)移緩沖溶液同時(shí)防止出現(xiàn) 氣泡。電轉(zhuǎn)移連接電源，在4C條件下維持恒壓100v，1小時(shí)。3.免疫檢測膜染色斷開電源，將轉(zhuǎn)移盒從轉(zhuǎn)移槽中移出，將轉(zhuǎn)移盒 的各個(gè)部分分開。用鑷子將PVDF膜小心放入一 個(gè)干凈的容器中，用TBS緩沖溶液進(jìn)行短暫清 洗，從膜上剪下一條寬約5mm的膜放入另一個(gè) 干凈的容器中。將這條膜在染色液中浸泡1分 鐘，然后在脫色液中脫色30分鐘,確定蛋白質(zhì)已 經(jīng)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。膜的封閉和清洗 對于沒有進(jìn)行染色的膜，首先倒出TBS緩沖溶 液,加入3%封閉緩沖溶液,輕輕搖動(dòng)至少1小時(shí)。 倒掉3%封閉緩沖溶液，并用TBS緩沖溶液清洗 3次，每次5分鐘。一抗 倒掉TBS緩沖溶液，加入10 ml 0.5%封閉緩沖溶液及適量的一抗，輕輕搖動(dòng)1小時(shí)以上。從 容器中倒出一抗及封閉緩沖溶液，用TTBS緩沖 溶液清洗兩次，每次10分鐘。二抗倒出TTBS緩沖溶液，加入5 ml 0.5%封閉緩沖溶液及適量的二抗。輕輕搖動(dòng)30沖溶液及適量的二抗。輕輕搖動(dòng)30分鐘，倒出|三二抗及封閉緩沖溶液，用TT