熒光輻射機(jī)理

1、1光致電子轉(zhuǎn)移(PET)遞給熒光基團(tuán)的鍵合基團(tuán)(RecePtor)，負(fù)責(zé)光吸收并產(chǎn)生熒光發(fā) 射信號(hào)的熒光基團(tuán)(Fluorophorc)其熒光發(fā)射強(qiáng)度反映鍵合基團(tuán)的結(jié) 合狀態(tài)，以及連接鍵合集團(tuán)和熒光基團(tuán)的連接基團(tuán)(Spacer)o鍵合基 團(tuán)和熒光基團(tuán)通常為電子給體或者電子受體。光致電子轉(zhuǎn)移是指電子給體或電子受體受光激發(fā)后，激發(fā)態(tài)的電 子給體與電子受體之間發(fā)生電子轉(zhuǎn)移從而導(dǎo)致熒光的淬滅過(guò)程。例 如，當(dāng)熒光分子傳感器的鍵合基團(tuán)是電子給體，熒光基團(tuán)是電子受體 時(shí)，具體PET作過(guò)程如下:在光激發(fā)下，具有電子給予能力的鍵合基 團(tuán)能夠?qū)⑵涮幱谧罡吣芗?jí)的電子轉(zhuǎn)入激發(fā)態(tài)下熒光基團(tuán)空出的電子 軌道，使被光激發(fā)的電

2、子無(wú)法直接躍遷巨到原基態(tài)軌道發(fā)射熒光， 從而導(dǎo)致熒光的淬滅；當(dāng)鍵合基團(tuán)與底物結(jié)合后，降低了鍵合基團(tuán)的 給電子能力，抑制了 PET過(guò)程，熒光基團(tuán)中被光激發(fā)的電子可以直 接躍遷回到原基態(tài)軌道，從而增強(qiáng)了的熒光基團(tuán)的熒光發(fā)射。因此在 未結(jié)合底物前，傳感器分子表現(xiàn)為熒光淬滅，一旦鍵合基團(tuán)與底物相 結(jié)合，熒光基團(tuán)就會(huì)發(fā)射熒光(見(jiàn)圖)由于與客底物結(jié)合前后的熒光強(qiáng)度差別很大，呈現(xiàn)明顯的“關(guān)”、“開(kāi)” 狀態(tài)，因此這類(lèi)熒光化學(xué)傳感器又被稱(chēng)為熒光分子開(kāi)關(guān)。PET熒光分 子傳感器的作用機(jī)制可由前線軌道理論“來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明(見(jiàn)圖1.5)。ICT熒光化學(xué)傳感器由推電子基團(tuán)、吸電子基團(tuán)通過(guò)p電子體系連接 而成，在基態(tài)時(shí)表現(xiàn)

3、為極化結(jié)構(gòu)，一端為缺電子部分，另一端為富電子部分;而在光激發(fā)下，偶極矩增大，強(qiáng)化了這種極化特征，容易發(fā)生ICT過(guò)程（如圖）。A +cKLlmrt dondilmgpsiilp-systemckilruni wuhUra 訕 H穿U 4-1kvG -donuliing pjirtp-sternkclrom wiiihdrf ing;一* 圖】尚分r內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移的產(chǎn)生原理thiojesccnccICT熒光化學(xué)傳感器的工作原理有兩種（見(jiàn)圖l.7a）:當(dāng)?shù)孜锸侨彪娮踊?團(tuán)（陽(yáng)離子）時(shí)，一種是底物與吸電子基團(tuán)結(jié)合，將增大分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn) 移程度，導(dǎo)致熒光光譜紅移;一種是底物與推電子基團(tuán)結(jié)合，則使原 來(lái)向共扼體

4、系轉(zhuǎn)移的孤對(duì)電子用于與陽(yáng)離子形成配位鍵，導(dǎo)致ICT 推一拉電子的特征下降，導(dǎo)致熒光光譜藍(lán)移。當(dāng)?shù)孜锸歉浑娮踊鶊F(tuán)（陰 離子）時(shí)，情況相反。一般情況下，ICT熒光化學(xué)傳感器對(duì)熒光強(qiáng)度 的影響不如PET熒光化學(xué)傳感器顯著。典型例子是同時(shí)含有吸電子取代基、推電子取代基的電子體系，如氨基鄰苯二甲酞亞胺、二苯基 烯、氟代香豆素等。ICT熒光化學(xué)傳感器的缺點(diǎn)是對(duì)外部環(huán)境的變化 十分敏感，有較強(qiáng)的溶劑化效應(yīng)。(b) reaction coordinaie(a) reaction coordinate(b) reaction coordinaie(a) reaction coordinate圖1.7以分子內(nèi)共輒

5、的電荷轉(zhuǎn)秒化合物為槌颶器的筮花部件時(shí)，其工作花況的勢(shì)能圖說(shuō)明I在ICT中，有一種情況被稱(chēng)為扭曲的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(TICT twisted Intramolecular charge transfer)。在具有推一拉電子共扼體系的熒光分 子中，如果推電子基(如二甲氨基)通過(guò)可旋轉(zhuǎn)的單鍵與熒光團(tuán)相連 接，當(dāng)熒光團(tuán)被光子激發(fā)時(shí)，由于強(qiáng)烈的分子內(nèi)光致電荷轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致 原來(lái)與芳環(huán)共平面的電子給體繞單鍵旋轉(zhuǎn)，而與芳環(huán)平面處于正交狀 態(tài)，原來(lái)的共轆系統(tǒng)被破壞，部分電荷轉(zhuǎn)移變?yōu)橥耆碾娮愚D(zhuǎn)移，形 成TICT激發(fā)態(tài)(見(jiàn)圖)。當(dāng)形成TICT激發(fā)態(tài)時(shí)，原有的ICT熒光則 被淬滅。TICT態(tài)常常不發(fā)射熒光或者發(fā)射弱的長(zhǎng)

6、波熒光，少數(shù)情況 下會(huì)出現(xiàn)ICT與TICT雙重?zé)晒猬F(xiàn)象。3熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)FRET熒光傳感器分子的組成與其他類(lèi)型傳感器有所不同，除了含有鍵合基團(tuán)(Receptor)彩!連接基團(tuán)(Spacer),還含有兩個(gè)負(fù)責(zé)光吸收井產(chǎn) 生熒光發(fā)射信號(hào)熒光基團(tuán)(FluoroPhore),而這兩個(gè)熒光基團(tuán)一個(gè)是能 量給體(Energy donor， D)，另一個(gè)是能量受體(Energy acceptor， A)。 熒光共振能量轉(zhuǎn)移是指在一定波長(zhǎng)的光激發(fā)下，熒光基團(tuán)中的能量給 體(D)產(chǎn)生熒光發(fā)射，并通過(guò)偶極一偶極之間的相互作用把能量無(wú)輻 射地轉(zhuǎn)移給其附近的處于基態(tài)的能量受體(人)熒光基團(tuán)的過(guò)程。FRE

7、T 過(guò)程的發(fā)生與很多因素如光譜重疊的程度、躍遷偶極的相對(duì)方向，給 體)和受體0)之間的距離等有關(guān)。首先，能量給體)的發(fā)射光譜 與能量受體(A)的吸收光譜有明顯的重疊，能量受體必須能夠在能量 給體的發(fā)射波長(zhǎng)處吸收能量，但能量受體可以是熒光發(fā)射基團(tuán)，也可 以是熒光淬滅基團(tuán)。對(duì)于前一種情形，激發(fā)能量給體時(shí)，可以觀察到 能量受體的熒光發(fā)射;而后一種情形，只能觀察到能量給體的熒光變 化。其次，能量給休與能量受休相隔的距離必須遠(yuǎn)大于它們之間的碰 撞直徑(有時(shí)甚至相距遠(yuǎn)達(dá)70-100A)時(shí)，才可能發(fā)生能量給體與能量 受體的非輻射能量轉(zhuǎn)移，又稱(chēng)為長(zhǎng)距離能量轉(zhuǎn)移。另外，能量給休(。) 與能量受體(A)還必須以適

8、當(dāng)?shù)姆绞脚帕?。利用FRET效率對(duì)距離的 強(qiáng)的依賴(lài)性，F(xiàn)RET廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)和核酸的結(jié)構(gòu)及動(dòng)力學(xué)研究、 分子結(jié)合的測(cè)定等領(lǐng)域。例如，當(dāng)熒光分子傳感器的兩個(gè)熒光基團(tuán)都是熒光發(fā)射基團(tuán)時(shí)，具體 FRET工作過(guò)程如下(見(jiàn)圖1.8):在光激發(fā)下，熒光基團(tuán)中的能量給休(D) 產(chǎn)生熒光發(fā)射;傳感器分子通過(guò)鍵合基團(tuán)鍵合底物來(lái)調(diào)節(jié)能量給體(D) 和能量受體(A)之間的距離以及排列方向。如果底物的加入使這些因素均在適當(dāng)范圍，能量給體)可將能量通過(guò)非輻射轉(zhuǎn)移給能量受體 (A),表現(xiàn)為能量受體(A)的熒光發(fā)射;如果底物的加入使這些因素與 FRET因素不能匹配，則會(huì)抑制FRET過(guò)程，則表現(xiàn)為能量給體(。) 的熒光發(fā)射(

9、圖)。4 激基締/ 復(fù)合物(exeimer/exciplex)基于激基締/復(fù)合物(excimer/exciplex)的熒光化學(xué)傳感器分子的 特點(diǎn)是在一個(gè)分子中含有兩個(gè)熒光基團(tuán)，如多環(huán)芳烴蔡、蒽和花等， 并且兩個(gè)基團(tuán)處于分子的合適位置。當(dāng)兩個(gè)熒光基團(tuán)相同時(shí)，其中一 個(gè)熒光基團(tuán)(單體)被激發(fā)后，會(huì)和另一個(gè)處于基態(tài)的熒光基團(tuán)形成分 子內(nèi)激基締合物(excimer)。激基締合物的熒光發(fā)射光譜取代了單體的 發(fā)射峰，呈現(xiàn)出一個(gè)新的強(qiáng)而寬的、長(zhǎng)波長(zhǎng)的、無(wú)精細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光發(fā) 射峰。當(dāng)兩個(gè)熒光基團(tuán)不同時(shí)，則稱(chēng)之為激基復(fù)合物(exciplex)。激基 締/復(fù)合物形成與否的關(guān)鍵是兩個(gè)熒光基團(tuán)之間的距離，只有激發(fā)態(tài)分子

10、與基態(tài)分子之間的距離約為3.5A時(shí)，才能形成激基締/復(fù)合物?；诩せ?復(fù)合物(excimer/exciplex)的熒光化學(xué)傳感器就是利 用受體結(jié)合底物后導(dǎo)致激基締/復(fù)合物構(gòu)型的形成或破壞，使激基締/ 復(fù)合物的熒光增強(qiáng)或消失，通過(guò)單體、激基締/復(fù)合物的熒光光譜變 化表達(dá)底物識(shí)別的信息。因此，構(gòu)型的變化是此類(lèi)信息產(chǎn)生的原因， 圖給出了加入底物后可以形成激基締合物的熒光化學(xué)傳感器的工作 原理。蔡、花、蒽等熒光團(tuán)由于具有較長(zhǎng)的激發(fā)單線態(tài)壽命，容易形 成激基締/復(fù)合物，常常被用于此類(lèi)熒光化學(xué)傳感器中。monomer exciBueremission due lo proximity the【理fluo

11、rophorcsmonomer emission.signalingbindingRyhilindl5；ite圖.9基于激基締合物的芝出學(xué)傳感器的工作原理雜原子對(duì)熒光的影響比較復(fù)雜，有時(shí)增強(qiáng)熒光，有時(shí)減弱熒光。主要 看雜原子化合物的結(jié)構(gòu)。簡(jiǎn)單雜環(huán)化合物的熒光量子產(chǎn)率很小，幾乎 為0，但當(dāng)他們與苯環(huán)相并后的產(chǎn)物熒光大大增強(qiáng)。含氮雜環(huán)化合物 的分子中含有N原子。在非極性介質(zhì)中它們的熒光很弱，隨著介質(zhì) 極性的提高，其熒光強(qiáng)度亦隨之提高。取代基的影響取代基的性質(zhì)對(duì)熒光體的熒光特性和強(qiáng)度均有強(qiáng)烈影響，芳烴和雜環(huán)化合物熒光光譜和熒光產(chǎn)率常隨取代基而改變，取代基對(duì)熒光體的激 發(fā)和發(fā)射光譜以及熒光效率的影響規(guī)

12、律和機(jī)理，是人們甚為光注的領(lǐng) 域，可惜人們對(duì)激發(fā)態(tài)分子的性質(zhì)了解甚少，影響規(guī)律多出自實(shí)驗(yàn)總 結(jié)和猜測(cè)。（a）推電子取代基增加熒光 屬于這類(lèi)基團(tuán)的有O環(huán)外的前幾或氨基上的非鍵電子（n電子）激發(fā)轉(zhuǎn)移到環(huán)上而產(chǎn)生的。 由于他們的n電子云幾乎與芳環(huán)上的軌道成品活性，實(shí)際上共享了共 軛而電子結(jié)構(gòu)，擴(kuò)大了共軛雙鍵體系。因此，這類(lèi)化合物的吸收光譜 與發(fā)射光譜的波長(zhǎng)，都比未取代的芳族化合物的波長(zhǎng)長(zhǎng)，熒光效率也 提高很多，但在應(yīng)用這類(lèi)熒光體是要特別小心，因?yàn)檫@類(lèi)基團(tuán)都含有 未鍵和的n電子。他們?nèi)菀着c極性溶劑生成氫鍵。當(dāng)取代基是酸基或 堿基是，在酸堿性介質(zhì)中容易轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的鹽或質(zhì)子化，使熒光強(qiáng)度 減弱甚至消失。（

13、b）吸電子取代基含有吸電子基團(tuán)的熒光化合物，其熒光強(qiáng)度一般都會(huì)減弱，屬于這類(lèi) 取代基的有羰基 鹵素和 基 等，這類(lèi)取代基也含有n電子，然而其m電子的電子云并不與芳環(huán) 上的n電子云共平面，這類(lèi)化合物的n n *躍遷是屬于禁戒躍 遷，摩爾吸收系數(shù)很?。s為102），最低單線激發(fā)態(tài)S1為n，n *， S1 的系間跨越強(qiáng)烈，因?yàn)闊晒鈴?qiáng)度都很弱，而磷光強(qiáng)度相 應(yīng)的增強(qiáng)。氰基是一個(gè)很有意思的基團(tuán)，是不飽和的取代基，它應(yīng)使取代的化合 物的熒光減弱，但實(shí)際結(jié)果是表現(xiàn)為退電子的效果一一熒光強(qiáng)度。它 的取代9, 10-二氰基蒽的f不但大于蒽，而且9-氯-10-二氰基蒽的 f也高達(dá)0.95，遠(yuǎn)大于9-氯代蒽的f (

14、0.11)(C)重原子的取代熒光體取代上重原子之后，熒光減弱，二磷光往往相應(yīng)增強(qiáng)。所謂重 原子取代，一般指的是鹵素(Cl,Br和I)取代芳烴取代上重原子后熒 光強(qiáng)度一般隨鹵素原子量增加而減弱，這一效應(yīng)稱(chēng)為“重原子效應(yīng)”。 這種效應(yīng)被解釋為：由于重原子的存在，使得熒光體中的電子自選一 軌道偶合作用加強(qiáng)、S1T1的系間跨越顯著增大，結(jié)果導(dǎo)致熒光強(qiáng)度極愛(ài)你若、磷光強(qiáng)度增加。飽和烷烴的取代此類(lèi)取代基對(duì)熒光體的熒光強(qiáng)度影響不大，可是，由于可動(dòng)的飽和 烴基的引入，增加了熒光體的振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)自由度，因而消弱了熒光激 發(fā)光譜和發(fā)射光譜振動(dòng)結(jié)構(gòu)的分辨率，同時(shí)激發(fā)峰和發(fā)射峰略為紅 移。取代基數(shù)量及其所處位置的影響取代基在試劑分子上的位置及取代基的數(shù)量對(duì)試劑的熒光量子產(chǎn)率 的影響視具體情況而定，是有一個(gè)退電子取代基，處于空間位阻最小 火空間位阻的位置可使熒光增強(qiáng)。對(duì)于不同的發(fā)光母體，同類(lèi)取代基 所處位置不同所表達(dá)的熒光強(qiáng)度變化規(guī)律也不相同。另外對(duì)熒光的影響還要看取代基的種類(lèi)，校體積取代基所貢獻(xiàn)的共軛效應(yīng)小，只是體現(xiàn)出其電荷影響，若一個(gè)大的取代基如苯或乙炔基苯 其共軛效應(yīng)大，取代后擴(kuò)大了試劑共軛體系，使熒光增強(qiáng)的效應(yīng)大于 其吸電子是熒光減弱的效應(yīng)，結(jié)果是取代后熒光強(qiáng)度不是減弱二十大 大增強(qiáng)。（f）芳香環(huán)中雜原子的影響雜原子對(duì)熒光的影響比較復(fù)雜，有時(shí)增強(qiáng)熒光，有時(shí)減弱熒