定量PCR技術(shù)原理及其應(yīng)用-GeneLife課件

1、實時熒光定量PCR技術(shù)原理及其應(yīng)用楊文斌 20071. 原理及其應(yīng)用2.應(yīng)用ABI 7000 sybrgreen方法進(jìn)行樣品檢測Real-time quantitative PCRA method to measure the quantity of a nucleic acid target using the Polymerase Chain Reaction (PCR)The PCR amplification reaction is monitored in every cycle as it happens (i.e. “in real-time”)The target may be

2、 DNA or RNA（CDNA)1.熒光擴(kuò)增曲線分成三個階段：熒光背景信號階段熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段平臺期2. Rn 一個反應(yīng)管經(jīng)n 次熱循環(huán)后，測得的熒光強(qiáng)度熒光定量分絕對定量和相對定量每個模板的CT 值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，CT 值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中縱坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，橫坐標(biāo)代表Ct值因此，只要獲得未知樣品的Ct 值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。絕對定量內(nèi)標(biāo)基因的選擇檢測樣品間表達(dá)一致基因選擇時應(yīng)考慮組織，時期，以及處理方法引起的差異多基因同時反應(yīng)時內(nèi)標(biāo)基因表達(dá)量應(yīng)高于目的基因相對定量相對定量的計算方

3、法相對定量的計算方法定量一般是在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期進(jìn)行的PCR 指數(shù)擴(kuò)增的公式是： Xn=X0(1+EX)n Xn是第n 個循環(huán)后目標(biāo)分子數(shù)。X0 是初始目標(biāo)分子數(shù)。Ex 是目標(biāo)分子擴(kuò)增效率。n 是循環(huán)數(shù)實時熒光定量PCR 的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩種探針類是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，特異性高非探針類則是利用熒光染料或者特殊設(shè)計的引物來指示擴(kuò)增的增加，簡便易行。SYBR Green ISYBR Green I是一種與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)光的熒光染料。所以可以根據(jù)SYBR Green I的熒光信號強(qiáng)度檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量 SYBR Green I的最大吸收

4、波長約為497NM，發(fā)射波長最大約為520NM優(yōu)點：通用性較好，價格相對低廉，國內(nèi)外科研中使用比較普遍。缺點：由于SYBR Green I不能識別特異的雙鏈，對PCR反應(yīng)中的非特異性擴(kuò)增及引物二聚體也會產(chǎn)生熒光，本底較高，臨床應(yīng)用時會有假陽性出現(xiàn)。TaqMan 探針TaqMan 探針是一種寡核苷酸探針，它設(shè)計與目標(biāo)序列上游引物和下游引物之間的序列配對。常用的熒光由FAM,TET,VIC,HET，熒光淬滅基團(tuán)如TAMRA 熒光基團(tuán)連接在探針的5末端，而淬滅劑則在3末端。當(dāng)完整的探針與目標(biāo)序列配對時，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進(jìn)行延伸反應(yīng)時，聚合酶的5外切酶活性將探針進(jìn)行

5、酶切，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團(tuán)不斷積累。因此熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系。 TaqMan 探針TaqMan MGB探針 Taqman探針檢測的是積累熒光。當(dāng)探針完整的時候，由于3端的熒光淬滅基團(tuán)在吸收5端報告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量，本身會發(fā)射波長不同的熒光而導(dǎo)致本底高，因此TaqMan探針近來又有新的發(fā)展TaqMan MGB探針。MGB探針的淬滅基團(tuán)采用非熒光淬滅基團(tuán)(Non-Fluorescent Quencher)，本身不產(chǎn)生熒光，可以大大降低本底信號的強(qiáng)度。同時探針上還連接有MGB (Minor Groove Binder)修飾基團(tuán)，可以將探針的Tm值提高10C左右。因此為了獲得同樣的Tm值，MGB探針可以比普通TaqMan探針設(shè)計得更短，既降低了合成成本，也使得探針設(shè)計的成功率大為提高因為在模板的DNA堿基組成不理想的情況下，短的探針比長的更容易設(shè)計。實驗證明，TaqMan MGB探針對于富含A/T的模板可以區(qū)分得更為理想。 TaqMan MGB探針實時熒光定量PCR 技術(shù)的應(yīng)用1. DNA 或RNA 的絕對定量分析。包括病原微生物或病毒含量的檢測,轉(zhuǎn)基因動植物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測，RNAi 基因失活率的檢測等2. 基因表達(dá)差異分析。例如比較經(jīng)