錢中直-方法學(xué)驗證-2課件

1、中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則實施細(xì)則的介紹國家藥典委員會錢忠直中國藥典2005版一部新增指導(dǎo)原則中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則中藥注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則中藥分析方法驗證實驗項目現(xiàn)行方法回收率 精密度（儀器精密度） 重復(fù)性專屬性 線性關(guān)系和線性范圍 2005版藥典一部指導(dǎo)原則準(zhǔn)確性（回收率）精密度 重復(fù)性 中間精密度 重現(xiàn)性專屬性檢測限定量限線性范圍耐用性與國際協(xié)調(diào)方法接軌（ICH）規(guī)范中藥分析方法驗證的實驗內(nèi)容中藥方法學(xué)驗證的特點反映被測成分與輔料間的影響與試驗操作誤差反映測定全過程誤差的總和,特別包括其中提取、分離、轉(zhuǎn)化反應(yīng)等前處理過程所帶來的誤差由于中藥所含成分復(fù)雜、含量偏低

2、，試驗步驟較多，測定難度會更大，對精密度等影響會更大，一般難以達(dá)到常見的如化學(xué)藥品的要求，且隨著含量的高低和分離步驟的多少，可達(dá)到的要求會不同。 需驗證的分析方法類型鑒別限量檢查含量測定溶出度、釋放度需控制的殘留物、添加物等需驗證的分析方法類型 準(zhǔn)確度(Accuracy) 系指用該方法測定的結(jié)果與真實值或參考值接近的程度，有時也稱真實度，一般用回收率(%)表示。 以經(jīng)典方法的測定值作為真值，建立方法的測定數(shù)據(jù)與之比較（該法適用于化學(xué)單體藥物） 以加入對照品測定的回收率表示，一般有空白回收（制劑空白）和加樣回收測定的方法（中藥材、復(fù)方制劑等） 準(zhǔn)確度(Accuracy) 試驗方法：同一樣品，制備

3、相同濃度的6份樣品（樣品取樣量減半，以1：1比例加入對照品）同一樣品，制備3個濃度的供試品，每個濃度分別制備3份供試液，對照品的加入有以下3種方式：準(zhǔn)確度(Accuracy)取相同量樣品9份（一般為樣品取樣量的一半），設(shè)計 個濃度，按不同比例加入對照品。中間濃度一般按1：1比例加入，低、高濃度可選0.5：1、1.5：1的比例。加入的對照品的量要適當(dāng)，保證供試品溶液的濃度（或量）在考察的線性范圍內(nèi)。取3個不同量的樣品各3份，每個取樣量分別按1：1比例加入對照品，中間濃度應(yīng)選定在正常測定濃度，其他兩個濃度可以結(jié)合范圍考察的最高、最低點進(jìn)行測定。按標(biāo)示量計算的組分，可參照化學(xué)藥品測定方法，取9份樣品

4、，按0.8：1、1：1、1：1.2的比例加入對照品（樣品取樣量減半）。準(zhǔn)確度(Accuracy) 測定數(shù)據(jù)的精度要求：一般應(yīng)滿足以下規(guī)定 回收率（%） 95105 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%） TLCS5%，HPLC/GC3% 準(zhǔn)確度(Accuracy)感冒清熱顆粒中葛根素含量測定回收率1編號樣品含量(ug)加入葛根素的量(mg)測得葛根素總量回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)18819301853104.5297.223.812877178597.633875176495.594884176794.955883177395.76878176194.95準(zhǔn)確度(Accuracy)感冒清熱顆粒

5、中葛根素含量測定回收率3編號樣品含量(ug)加入葛根素的量(mg)測得葛根素總量回收率(%)平均回收率(%)RSD(%522877930178597.6399.25 4.71 3875176495.591322845396.981422823245396.9897.991.7815229461100161322265695.631713211395264094.5595.030.58181319264394.91將序號1-3，13-18進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果平均回收率為97.42，RSD=3.22%。3種回收率試驗方法比較 精密度（Precision） 精密度系指在規(guī)定的

6、測試條件下，同一個均勻供試品，經(jīng)多次取樣測定所得結(jié)果之間的接近程度(離散程度) 精密度可以從三個層次考慮： 重復(fù)性(Repeatability) 中間精密度(Intermediate precision) 重現(xiàn)性(Reproducibility) 精密度考察應(yīng)使用均勻穩(wěn)定的、可信的樣品。如果得不到，可用人為配制的樣品進(jìn)行研究。重復(fù)性(Repeatability) 重復(fù)性:在相同操作條件下，由同一個分析人員在較短的間隔時間內(nèi)測定所得結(jié)果的精密度 重復(fù)性(Repeatability)實驗要求： 在規(guī)定范圍內(nèi)，取同一濃度的樣品，用6個測定結(jié)果進(jìn)行評價； 或設(shè)3個不同濃度9份樣品，用9個測定結(jié)果進(jìn)行評

7、價（高低濃度可以結(jié)合范圍的考察設(shè)計，中間濃度為樣品平均濃度，計算9份樣品的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差）重復(fù)性(Repeatability)測定數(shù)據(jù)的精度要求：一般應(yīng)滿足以下規(guī)定 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD%)TLCS5%，HPLC/GC3%。生丹顆粒中補骨脂素測定重復(fù)性2取樣量（mg）補骨脂素量（mg）含量 (mg/g）含量平均值(mg/g）平均值(mg/g）含量（mg/袋）RSD（）2.50780.1509 0.060170.060030.061860.6192.820.1502 0.059892.50420.1472 0.058780.058700.14680.058622.50260.1514 0.0605

8、00.06046 0.1512 0.060425.00540.31150.06223 0.063350.32270.06447 5.00660.31890.06370 0.062980.31170.06226 5.01440.31790.06340 0.063480.31870.06356 7.50200.4570 0.060920.061630.4677 0.062347.5024 0.4748 0.063290.062840.4681 0.062397.51020.4808 0.064020.063260.4695 0.06251取樣量（mg）補骨脂素量（mg）含量 (mg/g）含量平均值

9、(mg/g）平均值(mg/g）含量（mg/袋）RSD（）1.25710.0781 0.062130.062010.063180.6324.430.0778 0.06189 1.25000.0782 0.062560.062080.0770 0.06160 1.25940.0805 0.063920.063880.0804 0.063842.50780.1509 0.060170.060030.1502 0.059892.50420.1472 0.058780.058700.14680.058622.50260.1514 0.060500.06046 0.1512 0.060425.00540.

10、31150.06223 0.063350.32270.06447 5.00660.31890.06370 0.062980.31170.06226 5.01440.31790.06340 0.063480.31870.06356 7.50200.4570 0.060920.061630.4677 0.062347.5024 0.4748 0.063290.062840.4681 0.062397.51020.4808 0.064020.063260.4695 0.06251 12.46280.8309 0.066670.067830.85980.06899 12.64540.8453 0.06

11、6850.065860.8203 0.06487 12.4253 0.8477 0.068220.069330.8752 0.07044生丹顆粒中補骨脂素測定重復(fù)性3中間精密度(Intermediate precision) 在同一個實驗室，不同時間由不同分析人員,用不同設(shè)備測定結(jié)果之間的精密度，稱為中間精密度?？疾斓哪康模嚎疾祀S機變動因素對精密度的影響考察的變動因素: 不同時間 不同分析人員 不同設(shè)備 至少3人采用同一設(shè)備或同一人采用3臺不同設(shè)備，對同一批樣品測定含量。計算不同操作者或不同設(shè)備測定的含量平均值和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。 不能僅考察不同分析時間的結(jié)果，有重現(xiàn)性考察的，可以免做中間精密度。

12、重現(xiàn)性(Reproducibility) 在不同實驗室由不同分析人員、不同設(shè)備測定結(jié)果之間的精密度 考察的目的：當(dāng)分析方法將被法定標(biāo)準(zhǔn)采用時，應(yīng)進(jìn)行重現(xiàn)性試驗?zāi)壳半A段，該項試驗可采用起草和復(fù)核試驗的測定數(shù)據(jù)進(jìn)行評價。但應(yīng)由起草單位根據(jù)復(fù)核所的復(fù)核數(shù)據(jù)，報送兩個實驗室之間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。報告的數(shù)據(jù)：標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差或可信限 由于中藥有些被測成分屬于痕跡量的,因此兩個或兩個以上實驗室測定結(jié)果的偏差允許范圍目前尚難確定。 專屬性（Specificity）系指在一些可能存在的其他成分（包括雜質(zhì)、降解物、基質(zhì)等）存在時，采用的方法能準(zhǔn)確可靠測定出藥材、飲片、提取物及中藥制劑中被測成分的能力。一種分

13、析方法缺乏專屬性時，可由其他輔助的分析方法作補充。 專屬性（Specificity）專屬性有以下含義：鑒別：確證被測物是否符合其特性。檢查：確保采用的分析方法可檢出被測物中雜質(zhì)或應(yīng)控制物的準(zhǔn)確含量，如有關(guān)物質(zhì)、有毒成分、重金屬、溶劑殘留量等。含量測定：提供樣品中被測物含量的準(zhǔn)確結(jié)果。專屬性（Specificity）鑒別 應(yīng)能與可能共存的物質(zhì)或結(jié)構(gòu)相似化合物區(qū)分。不含被測成分的供試品，以及結(jié)構(gòu)相似或組分中的有關(guān)化合物，均不得干擾測定 顯微鑒別、色譜光譜鑒別等應(yīng)附相應(yīng)的代表性圖象或圖譜。 專屬性（Specificity）含量測定和限量檢查 色譜法和其他分析方法，應(yīng)附代表性圖譜，以不含被測成分的供試

14、品（除去含待測成分藥材或不含待測成分的模擬復(fù)方）試驗說明方法的專屬性。并標(biāo)明相關(guān)成分在圖中的位置，色譜法中的分離度應(yīng)符合要求。必要時可采用二極管陣列檢測或質(zhì)譜檢測進(jìn)行驗證專屬性（Specificity） 常用的試驗方法: 空白陰性對照試驗 比較同一分析系統(tǒng)對照品與供試品相應(yīng)色譜峰的吸收光譜的一致性 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用驗證待測成分空白陰性對照試驗的試驗要求 TLC：目測觀察，空白陰性對照應(yīng)不得顯與供試品檢測成分相應(yīng)的斑點。 HPLC/GC/TLCS：空白陰性對照色譜中，在與相應(yīng)對照品保留時間相應(yīng)的位置應(yīng)無色譜峰或其峰面積小于5%空白陰性對照試驗 除去待測藥味，按規(guī)定的制法制成空白樣品，按測定方法同法

15、制備空白陰性對照溶液 測定成分為2種以上藥材含有的，應(yīng)分別制備每一藥味的空白，及減去含有共同成分藥味制備的空白檢測限（Limit of Detection，LOD) 檢測限系指供試品中被測物能被檢測出的最低量。試驗方法：直觀法儀器法（信噪比法） 檢測限試驗方法采用已知濃度的對照品進(jìn)行試驗直觀法 如薄層色譜檢測成分的檢出量或毒性成分檢出限量的確定。在薄層板上，以已知濃度的對照品點樣，依法展開、顯色后目測觀察，可檢出的最小量為檢測限。信噪比法 信噪比（S/N）為3：1的樣品的濃度（或量）。以已知濃度（或量）的對照品溶液進(jìn)樣，峰高值為3倍噪音時的對照品濃度為檢測限。噪音的測量，可以空白溶劑進(jìn)樣，記錄

16、相應(yīng)長度的色譜基線，測量相當(dāng)于對照品保留時間前后適當(dāng)距離的噪音高度即可。定量限（Limit of Quantitative, LOQ） 定量限系指供試品中被測成分能被定量測定的最低量，其測定結(jié)果應(yīng)具一定準(zhǔn)確度和精密度。 試驗方法：一般以10倍于噪音的對照品溶液重復(fù)點樣或進(jìn)樣5-6次，計算重復(fù)點樣或進(jìn)樣的峰面積值的RSD%。當(dāng)RSD%3%（薄層掃描法）或2%（高效液相色譜法/氣相色譜法）的濃度（或量）為方法的定量限。若RSD%較大，應(yīng)重新調(diào)整對照品溶液的濃度，進(jìn)行測定。線性（Linearity） 線性系指在設(shè)計的范圍內(nèi)，測試結(jié)果與供試品中被測物濃度直接呈正比關(guān)系的程度。 試驗方法制備梯度濃度對照

17、品溶液，以相同體積點樣或進(jìn)樣測定峰面積值，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，并以峰面積值與對照品濃度（或量）作線性回歸，計算線性方程和相關(guān)系數(shù)。制備同一濃度的對照品溶液，以不同體積點樣或進(jìn)樣測定，同法處理。線性測定的濃度應(yīng)盡量在一較寬的范圍，至少應(yīng)大于范圍中的高低限濃度區(qū)間。計算相關(guān)系數(shù)，要求： TLCS：R0.99，HPLC-UV：R0.999，HPLC-ELSD：R0.995。 范圍（Range） 范圍系指能達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性，測試方法適用的高低限濃度或量的區(qū)間。 考察的區(qū)間應(yīng)盡可能覆蓋日后樣品可能的含量范圍驗證試驗過程中除取樣量和進(jìn)樣量可改變外，一般不得改動實驗操作過程中規(guī)定的如溶劑體積、提取時間

18、、萃取次數(shù)等。范圍（Range）可結(jié)合準(zhǔn)確度試驗進(jìn)行，并以高、低限濃度的精密度進(jìn)行評價。一般可在準(zhǔn)確度試驗的高低兩個濃度點各加測3份樣品，分別計算高、低濃度點6份樣品的RSD%值，并滿足以下規(guī)定TLCS法RSD% 5%，HPLC/GC法 RSD% 3%。范圍（單體藥物）實驗項目限度范圍含量測定標(biāo)示量90-110%80-120%雜質(zhì)檢查限度值限度值的50-120%溶出度限度值限度值的20% 含量均勻度測試濃度測試濃度的70-130% 范圍（中藥和復(fù)方制劑）含量限度有上下限的，一般設(shè)定范圍低限為含量限度下限的5070，范圍的高限為含量限度上限的130150。含量限度僅有低限的，一般設(shè)定范圍為含量限度的5070至含量限度的25倍以上。以標(biāo)示量規(guī)定含量限度的，可參照化學(xué)藥， 一般設(shè)定范圍為標(biāo)示量的80120。 耐用性（Robustness） 耐用性系指在測定條件有小的變動時，測定結(jié)果不受影響的承受程度，為把方法用于常規(guī)檢驗提供依據(jù) 開始研究分析方法時，就應(yīng)考慮其耐用性。如果測試條件要求苛刻，則應(yīng)在方法中寫明 耐用性（Robustness）典型的變動因素 被測溶液的穩(wěn)定性 樣品提取方式 時間 典型的變動因素（液相色譜法）不同品牌或不同批號的同類型色譜柱 （至少采用3根不同商品規(guī)格的色譜柱，測定同一批樣品溶液的含量，計算含量值和RSD%。應(yīng)提供不同柱分離的色譜圖，計算理