圓二色譜報告

1、一、實驗?zāi)康?. 圓二色性；圓二色光譜的原理與應(yīng)用；圓二色光譜的相關(guān)拓展知識；圓二色光譜的實驗技術(shù)與操作。二、實驗原理圓二色性是手性分子在光學(xué)上表現(xiàn)的一種特性。光可視為振動方向與傳播方向垂直的電磁 橫波。當光波的電矢量方向以一個固定的角速度以傳播方向為軸心勻速旋轉(zhuǎn)時，稱之為圓偏振 光。根據(jù)圓偏振光電矢量旋轉(zhuǎn)方向的不同，可以將其區(qū)分為左圓偏振光和右圓偏振光。一束平 面偏振光可以看成是由兩個振幅和速度相同而螺旋前進方向相反的圓偏振光疊加而成(圖 1)。 兩圓偏振光彼此對映，互為鏡像。當手性物質(zhì)在偏振光的波長范圍內(nèi)存在吸收的時候，其對左 右圓偏振光的吸收程度，也就是摩爾吸光系數(shù)，是不同的。此時不但偏

2、振光的偏振平面將被旋 轉(zhuǎn)，構(gòu)成該偏振光的左右圓偏振光的振幅也將不再相等。組成出射光的左右圓偏振光的電矢量 和將沿一個橢圓軌跡移動，此時的出射光就是橢圓偏振光(圖2)。這種光學(xué)現(xiàn)象就稱為手性 物質(zhì)所具有的圓二色性。對于純手性物質(zhì)，其橢圓偏振光的橢圓度6在特定溶劑、濃度、溫度 和光程下，在特定波長處為定值。同時，在特定波長處的橢圓度6與在該波長處對左右圓偏振 光的摩爾吸光系數(shù)之差(As)成正比。將6或M對波長作圖，即得到圓二色光譜。圖1右圓偏振光(a)、左圓偏振光(b)及平面偏振光示意圖，水平箭頭表示光的傳播方向。AAA(a)(b)(c)圖2 (a)平面偏振光的圓組分；(b)平面偏振光的旋轉(zhuǎn)與圓組

3、分；(c)橢圓偏振光的旋轉(zhuǎn)與圓組分被吸收的情況。其中，0B與0C分別表示右、左圓偏振光被吸收后的振幅，OD表示OB與0C的矢量和，0表示橢圓偏振光的橢圓率角，tan/ = OE/OA0。圓二色光譜的英文名稱為Circular Dichroism，簡稱CD光譜。其光譜儀的基本測試原理是 通過入射圓偏振光的波長變化，測定手性樣品的左圓偏振光和右圓偏振光摩爾消光系數(shù)之 差A(yù)s。由于CD光譜反映了光和分子間的能量交換，因而只能在有最大能量交換的共振波長 范圍內(nèi)測。 CD 光譜可用于分析一般電子光譜所不能體現(xiàn)出來的能級躍遷的細節(jié)，是討論手性 化合物電子躍遷性質(zhì)的重要表征手段。當測試條件嚴格一致時，一對對

4、映異構(gòu)體的 CD 光譜呈鏡像對稱。通常采用光學(xué)純的樣品(即僅含單一對映體)進行CD光譜的測定，可由實驗值0根據(jù)濃度c、光程長l求出該純 樣的 As 。在嚴格相同的測試條件下，測定未知樣品的 CD 光譜，可根據(jù)實驗值求出未知樣的 As。根據(jù)上述數(shù)據(jù)可估算未知樣品的對映體過量值(Enantiomeric Excess，簡稱ee%)。當 樣品溶解性差、溶劑背景干擾、溶解過程中絕對構(gòu)型發(fā)生變化時，固相 CD 光譜測試很有必要。 通常對純樣進行 CD 光譜的測試，可在樣品絕對構(gòu)型與 CD 信號間建立關(guān)聯(lián)。對同物質(zhì)未知 ee% 值的樣品，可通過 CD 光譜，簡單判斷其哪種對映體過量。此外，光譜還可結(jié)合其他

5、結(jié)構(gòu)表征 手段用于關(guān)聯(lián)確定手性化合物的絕對構(gòu)型，或檢測靶向分子與 DNA 等生物大分子的相互作用。如圖 3所示，圓二色光譜儀由氙燈光源、單色系統(tǒng)、偏振系統(tǒng)、樣品臺、光電倍增管等部 件組成。具體參數(shù)如下：光源兩種標配燈：150瓦氙燈及15 0瓦汞氙燈可同時裝置。分離式光源裝置，205nm以上測量不需使用氮氣，波長205nm以下氮器使用量3升/每分 鐘。單色器光柵：雙光柵1200條/mm。波長 設(shè)定 范圍： 185 至 800 nm。光學(xué)系統(tǒng)全反射消色差的光學(xué)系統(tǒng)，氟化鎂（MgF2 ）偏振光學(xué)組件，具參比二極管檢測器。數(shù)據(jù)采集及數(shù)據(jù)分析采樣速率：10微秒/每點-1000秒/每點。波長掃描速度： 最

6、高 1200nm/min （0.05秒 to 20秒/每點） 。圓二色測量噪聲： 0.01 mdeg（2nm， 1sec）。基線穩(wěn)定性： 0.01 mdeg/小時。CD 分辨率： 最低達0.0006mdeg。CD測量范圍： 最高達6500mdeg。三、應(yīng)用案例設(shè)計1、儀器和藥品：、藥品：KC1 (光譜純)、純手性試劑、無水乙醇(A.R.)。、儀器：MOS-450圓二色光譜儀，分析天平，壓片機(包括壓模等)，瑪瑙研缽。2、實驗步驟：電源依次打開ALX-250光源開關(guān)(先開光源盒背后開關(guān)，再開光源盒面板開關(guān))，MM-450電源開關(guān)，計算機電源，預(yù)熱半小時。查看ALX-250面板顯示功率，微調(diào)旋鈕，

7、將功率確定在150W。制備樣品固相壓片樣品：采用KCl壓片法。以光譜純KCl (需自備)為惰性介質(zhì)。壓 制純KCl片為空白樣，待測樣品與KCl分別以1： 25、1： 50、1： 100、1： 200比例混合壓片為試樣片，二者質(zhì)量皆取25mg，以確保厚度一致，透光度 好。開啟程序點擊電腦桌面上的“BioKine”圖標，進入BioKine軟件操作主界面。點擊操作主界面的Device/Scanning Spectrometer，進入光譜掃描界面。安放空白樣固相壓片樣品：取下光電倍增管，將帶有純KCl壓片的模具置于樣品臺上， 凹口向內(nèi)垂直放置，將光電倍增管罩住固體壓片模具，鎖緊螺絲?？瞻讟訏呙?與扣除

8、根據(jù)樣品的最大吸收波長，輸入到操作界面下方的“Ex”處，回車。點擊睡垂按鈕變?yōu)殡?，然后點擊Aut0，自動調(diào)整HV電壓，然后 再點擊 加8按鈕，鎖定此電壓值。點擊主界面上方的Acquisition Setup按鈕，進行測試參數(shù)的設(shè)置：Acquisition mode:選擇測量模式 CD；Begin(n m)：掃描初始波長；End(nm):掃描結(jié)束波長；Scan Repeat :掃描次數(shù)；Acquisition duration：每個nm的測量持續(xù)時間，范圍0.05s-20s。此數(shù) 值越長，則掃描時間越長，信噪比越優(yōu)；Shutter Automatic mode:選擇 Always open；PM

9、 gain*10：當在非常低的信號測量，可選擇此項，進行信號的增益。CD parameters： CD的靈敏度，根據(jù)信號的振幅設(shè)置，有四個不同的 選項，1000、300、100 和 30 mdeg。上述選項，b)、c)項應(yīng)根據(jù)試樣的紫外可見吸收譜帶選定，其他參數(shù)可 選用默認值。以上參數(shù)都設(shè)置好后，點擊OK按鈕，參數(shù)設(shè)置完成，回到主界面。點擊主界面左方Blank spectrum區(qū)域的Record按鈕，進行空白樣的掃描。掃描完成后，在第四步的操作區(qū)域內(nèi)，選中Subtract復(fù)選框，將在隨后進 行的試樣光譜測試中扣除空白值。1.再點擊shuttcr按鈕關(guān)閉擋板，點擊1.再點擊shuttcr按鈕關(guān)閉

10、擋板，點擊-川按鈕變?yōu)閷⒖瞻讟悠诽鎿Q成待測樣品，放置方法與空白樣相同。樣品的測量2.這時再點擊Shutter打開擋板，點擊匪逐：按鈕變?yōu)?n，然后點擊AUtO，自動調(diào)整HV樣品的測量2.這時再點擊Shutter打開擋板，點擊匪逐：按鈕變?yōu)?n，然后點擊AUtO，自動調(diào)整HV電壓，然后再點擊Auro按鈕，鎖定此電壓值。3.點擊主界面Acquisition control區(qū)域的按鈕，進行待測樣品的圓二色光 譜掃描。3.選擇主界面的File菜單下的Save As。譜圖數(shù)據(jù)的_注意選中左下角的“Save As Text”復(fù)選框，則保存的bka文件可由記事本打 保持開。光譜掃描完畢，務(wù)必先取出樣品。關(guān)閉

11、操作軟件主界面，關(guān)閉MM-450電源開關(guān)，ALX-250光源開關(guān)（光源盒 儀器的關(guān)閉背后開關(guān)）；關(guān)閉計算機，最后關(guān)閉外部電源插座。每次更換測試樣，請確認如下兩點：a）光電倍增管處于關(guān)閉狀態(tài)：軟件主界面下方的電壓提示處于“用區(qū)垂”狀態(tài);Shutter ”狀b）Shutter ”狀對于固相樣品測試，需移動光電倍增管的情況，光電倍增管需輕拿輕放，注意事項請避免劇烈振動。光譜掃描時，請避免實驗臺面的劇烈震動。實驗結(jié)束后，固相樣品的壓片模具嚴禁在潮濕狀態(tài)下裝入模具盒。為避免 模具生銹，應(yīng)在清洗后紅外燈下烘干。確認干燥后裝入模具盒，置于干燥 器中。實驗數(shù)據(jù)請存放于T:Data”目錄下。為便于管理，建議以導(dǎo)

12、師姓名為文 件夾名稱。每次實驗需拷貝的數(shù)據(jù)，請另存一份在電腦桌面，并將文件（或文件夾）名稱填寫于電腦桌面“需傳遞數(shù)據(jù).X1S ”文檔中。請注明數(shù)據(jù)歸屬者姓名， 電子郵箱及聯(lián)系方式。數(shù)據(jù)拷貝將由管理人員每周傳遞 12 次。請做好實驗登記工作，如實登記所測樣品名稱，儀器運行情況，以及實驗 時間。如需進行上述實驗內(nèi)容以外的測試，敬請聯(lián)系管理人員。四、數(shù)據(jù)處理eergaa200250300350400450500550600650Wavelength/nmO443020101020-30eergaa200250300350400450500550600650Wavelength/nmO44302010

13、1020-30圖 4 CD 譜圖因為波長在200nm至300nm時，電壓大于600V，數(shù)據(jù)不準確，所以，當波長為200nm 至300nm時，數(shù)據(jù)舍去不用。觀察波長在300nm至650nm區(qū)間內(nèi)空白片的摩爾橢圓度0數(shù)值 基本處于0以下，而樣品片在此段波長內(nèi)的摩爾橢圓度0則基本大于0；并且，對于含有不同 濃度的樣品的測量，其摩爾橢圓度 0 隨著濃度的增大而呈現(xiàn)下降趨勢，可以推測出樣品為右旋 手性物質(zhì)，且在紫外可見區(qū)域有吸收特征。五、思考題試用一句話簡述 CD 光譜的原理。答：手性物質(zhì)具有圓二色性（circular dichroism，簡寫作CD），圓二色性的存在使通過該 物質(zhì)傳播的平面偏振光變?yōu)闄E

14、圓偏振光，且只在發(fā)生吸收的波長處才能觀察到。哪些物質(zhì)需要收集CD光譜？ CD光譜可以提供哪些信息？答： CD 光譜的測量條件：在給定波長范圍內(nèi)有較強的 CD 信號和合適吸收值的手性物質(zhì)。CD 光譜提供信息：圓二色譜在有機化合物結(jié)構(gòu)鑒定中有著廣泛的應(yīng)用?？梢娂敖贤庾?為入射光源，這就要求被研究的手性分子要具有發(fā)色基團，通過對發(fā)色基團的研究來獲得分子 結(jié)構(gòu)信息，因此它只能提供分子局部的結(jié)構(gòu)信息。主要用于測定蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu) 圓二色性 R 和 L 兩種圓偏振光吸收程度不同的現(xiàn)象。圓二色譜是一種測定分子不對稱結(jié)構(gòu)的光譜法。在 分子生物學(xué)領(lǐng)域中主要用于測定蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)，也可用來測定核酸和多糖的立體結(jié)構(gòu)。以固相或液相樣品為例，試討論對未知樣品進行 CD 光譜測試，應(yīng)如何設(shè)計實驗方案？ 答：以液相為例：（1） CD測試前進行UV測試，可找出其理想的測試光譜范圍。（2） 選擇超純試劑（光譜純），清潔無暇的比色皿以及合適的溶劑，濃度一般以Abs = 0.8時為宜;（3）配置合適的濃度，在 CD 儀器上選擇合適的狹縫，對最大