《環(huán)境儀器分析》第九章 高效液相色譜法

1、第九章 高效液相色譜法（HPLC）2022/10/5第一節(jié) 概述第二節(jié) 高效液相色譜的基本理論第三節(jié) 高效液相色譜的類型第四節(jié) 高效液相色譜的流動相和固定相第五節(jié) 高效液相色譜儀1. HPLC的特點 一、特點： 高壓、高效、高速、高靈敏度分離分析方法。2022/10/5HPLC與GC法比較2022/10/5共同點：（1）氣相色譜的理論基本上適合HPLC，如塔板理論、保留值、分配系數(shù)、分配比、速率理論等均可應用于液相色譜。（2）定性、定量分析方法完全一樣。高效液相色譜也是根據(jù)保留值定性，根據(jù)峰高和峰面積定量。（3）可與其他儀器聯(lián)用，用以研究復雜的混合物。2022/10/5不同點：（1）氣相色譜法

2、分析對象只限于分析氣體或沸點較低的化合 物，它們僅占有機物總數(shù)的20%。對于占有機物總數(shù)近80%的高沸點、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，均可用HPLC。（2）氣相色譜采用流動相是惰性氣體，它對組分沒有親和力，即不產(chǎn)生作用力，僅起到載氣作用。而HPLC流動相可選用不同極性的液體，對組分產(chǎn)生作用力，流動相對分離起很大作用。（3）氣相色譜固定相多是一般固體吸附劑和以硅藻土為擔體的高沸點有機液體，成本較低。HPLC固定相大都是新型吸附劑，化學鍵合固定相。粒度小，成本較高。樣品容量也較高。HPLC與GC法比較（4）氣相色譜一般都是在高溫下進行，HPLC則經(jīng)常在室溫條件下操作。（5）儀器原理及結構也有所差

3、別，高效液相色譜儀具有高壓輸液泵，色譜柱可以不用恒溫箱。檢測器的原理和結構與氣相色譜也不同。檢測器結構要復雜些，靈敏度要低些。（6）由于流動相性質(zhì)的差別（氣體和液體）使得液相色譜的速率理論使用的參數(shù)與氣相色譜不完全相同。2022/10/52022/10/5高壓：HPLC配備了高壓輸液設備，流動相和進樣壓力一般可高達14.7 29.4MPa，甚至可高達49.03MPa以上高速：由于流動相速率較快， 流速最高可達10 ml/min. 一般樣品的分析時間，可在1h內(nèi)完成。高效：HPLC應用了顆粒極細（幾微米至幾十微米直徑）、規(guī)則、均勻的固定相，傳質(zhì)阻力小，分離效率高。 高靈敏度：配備高靈敏度檢測器，

4、使其分析靈敏度比經(jīng)典色譜有較大提高。2022/10/5第二節(jié) HPLC基本理論渦流擴散項 縱向擴散 流動相傳質(zhì) 滯留區(qū)傳質(zhì) 固定相 內(nèi)傳質(zhì)Dm：分子在流動相中的擴散系數(shù)；u：流動相的線速度；dp：固定相的粒度；Cm：分配比的函數(shù)；Cs：與顆粒孔徑中被流動相所占據(jù)的分數(shù)及分配比有關的數(shù)據(jù)；Ds：分子在固定液內(nèi)的擴散系數(shù)；df：固定液的液膜厚度。第三節(jié) 高效液相色譜法的主要類型及基本原理1、液-固色譜2、液-液色譜3、離子交換色譜4、空間排阻色譜2022/10/5一、液-固吸附色譜（liquid-solid adsorption chromatography） 基本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附

5、與解吸，根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附作用不同來進行分離。 固 定 相：固體吸附劑如硅膠、氧化鋁、活性炭、聚酰胺、硅-鎂吸附劑等，較常使用的是510m的硅膠吸附劑。 在高效液相色譜法中，表面多孔型或全多孔型都可作吸附色譜中的固定相，它們具有填料均勻、粒度小、孔穴淺等優(yōu)點，能極大提高柱效。 但表面多孔型由于試樣容量較小，目前最廣泛使用的還是全多孔型微粒填料。 2022/10/5液-固色譜 流 動 相：各種不同極性的一元或多元溶劑。 在吸附色譜中，極性大的試樣往往采用極性強的洗脫 劑；對極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑。 分離對象：適用于分離相對分子質(zhì)量中等（300 3000）的油溶性試樣，對具有官能團的

6、化合物和異構體有較高選擇性。 缺 點：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾。2022/10/5二、液-液分配色譜（liquid- liquid partition chromatography）固定相與流動相均為液體（互不相溶，極性必須不同）；基本原理：組分在固定相和流動相上的溶解度的不同，即組分在色譜柱中的分配能力不同；固 定 相：由于液液色譜中流動相參與選擇競爭，因此，對固定相選擇較簡單.只需使用幾種極性不同的固定液即可解決分離問題。常用的極性固定液,-氧二丙腈，中等極性的聚乙二醇，非極性的角鯊烷。2022/10/5二、液-液分配色譜（liquid- liquid partition chroma

7、tography） 流動相：對于親水性固定液，采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定液的極性（正相 normal phase），反之，流動相的極性大于固定液的極性（反相 reverse phase）。2022/10/5三、離子交換色譜（ion-exchange chromatography）利用被分離組分對離子交換劑離子交換能力（或選擇性系數(shù)）的差別而實現(xiàn)分離的色譜分析方法，主要用于離子型化合物的分離分析。2022/10/5三、離子交換色譜（ion-exchange chromatography）固 定 相：陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂；流 動 相：陰離子離子交換樹脂作固定相，采用

8、酸性水溶液；陽離子離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液；基本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復離子交換反應；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關。親和力大，保留時間長。 陽離子交換：RSO3H+M+=RSO3M+H+ 陰離子交換：RNR4OH+X-=RNR4X+OH-應 用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。2022/10/5四、化學鍵合相色譜法（CBPC）采用化學鍵合相的液相色譜法稱為化學鍵合相色譜法?；瘜W鍵合固定相：（將各種不同基團通過化學反應鍵合到硅膠（擔體）表面的游離羥基上。1. 鍵合固定相類型用來制備鍵合固定相的載體，幾乎都用硅膠。利用硅膠表面的硅醇基（S

9、i-OH）與有機分子之間可成鍵，即可得到各種性能的固定相。一般可分為三類：（1）疏水基團：如不同鏈長的烷烴（C18和C8）和苯基等。（2）極性基團：如丙氨基、氰乙基、醚和醇等。（3）離子交換基團 如作為陰離子交換基團的胺基，季銨鹽；作為陽離子交換基團的磺酸等。2022/10/5四、化學鍵合相色譜法（CBPC）反相鍵合相色譜法固定相是采用極性較小的鍵合固定相，如硅膠-C18H37、硅膠-苯基等；流動相是采用極性較強的溶劑，如甲醇-水、乙腈-水、水和無機鹽的緩沖液等。固定相的極性 流動相極性分離對象：極性化合物，用于分離異構體、極性不同的化合物，特別適用于分離不同類型的化合物。2022/10/5五

10、、排阻色譜色譜（size- exclusion chromatography）分離原理：尺寸排阻色譜法又稱凝膠色譜法，主要用于較大分子的分離。與其他液相色譜方法原理不同，它不具有吸附、分配和離子交換作用機理，而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來實現(xiàn)分離。2022/10/5五、排阻色譜色譜 （size- exclusion chromatography）固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)；原 理：按分子大小分離。小分子可以擴散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰?？蓪ο鄬Ψ肿淤|(zhì)量在7102 -1.5 10

11、8范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離。2022/10/5五、排阻色譜色譜（size- exclusion chromatography）流動相：必須溶解樣品，并必須與凝膠本身非常相似，這樣才能潤濕凝膠。溶劑的粘度要小，因為高粘度溶劑往往限制分子擴散作用而影響分離效果。對于具有低擴散系數(shù)的大分子物質(zhì)分離，尤需注意。選擇溶劑還必須與檢測器相匹配。常用的流動相有四氫呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酰胺和水等。分離對象：以水溶液為流動相的凝膠色譜適用于水溶性樣品，以有機溶劑為流動相的凝膠色譜適用于非水溶性樣品。2022/10/5六、親和色譜（Affinity chromatograph）原理：利用生物大分子和固定相表面

12、存在的某種特異性親和力，進行選擇性分離。 先在載體表面鍵合上一種具有一般反應性能的所謂間隔臂(環(huán)氧、聯(lián)胺等)，再連接上配基(酶、抗原等)，這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保留，沒有這種作用的分子不被保留。2022/10/5六、親和色譜（Affinitychromatograph）生物中許多大分子化合物具有這種親和特性。例如酶與底物、抗原與抗體、激素和受體，RNA與它互補的DNA等。當含有親和物的復雜混合試樣隨流動相流經(jīng)固定相時，親和物就與配基結合而與其他組分分離。其他組分先流出色譜柱，然后改變流動相pH值或組成，以降低親和物與配基的結合力，將保留柱上的大分子以純品

13、形態(tài)洗脫下來。親和色譜法也認為是一種選擇性過濾。它選擇性強，純化效率高，往往可以一步獲得純品，是當前解決生物大分子分離和分析的重要手段。2022/10/5第三節(jié) 固定相與流動相一、液相色譜固定相（stationary phases of LC）2022/10/51. 液-液分配及離子對分離固定相 （1）全多孔型擔體 由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；早期采用 100m的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多 見；現(xiàn)采用10m以下的小顆粒，涂漬固定液；（2）表面多孔型擔體 （薄殼型微珠擔體）3040m的玻璃微球，表面附著一層厚度為1 2m的多孔硅膠。 表面積小，柱容量底；（2）化學鍵合固

14、定相 化學鍵合固定相: 目前應用最廣、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳鍵型： SiOC b. 硅氧硅碳鍵型：SiOSi C 穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機溶劑，應用最廣； c. 硅碳鍵型： SiC d. 硅氮鍵型： SiN2022/10/5化學鍵合固定相的特點1）傳質(zhì)快，表面無深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；2）壽命長，化學鍵合，無固定液流失，耐流動相沖擊，提高柱子的穩(wěn)定性和使用壽命；3）耐水、耐光、耐有機溶劑，穩(wěn)定； 4）選擇性好，可鍵合不同官能團，提高選擇性；5）有利于梯度洗脫，柱效高。2022/10/52、液-固吸附分離固定相種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等；結構類型：全多孔型和薄殼型；粒

15、度：510 m。2022/10/53.離子交換色譜分離固定相結構類別：（1）薄殼型離子交換樹脂 薄殼玻璃珠為擔體，表面 涂約1%的離子交換樹脂；（2）離子交換鍵合固定相 薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵 合型（鍵合離子交換基團）樹脂類別：（1） 陽離子交換樹脂（強酸 性、弱酸性）（2） 陰離子交換樹脂（強堿 性、弱堿性）2022/10/54. 空間排阻分離固定相（1）軟質(zhì)凝膠 葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結構； 水為流動相。適用于常壓排阻分離。（2）半硬質(zhì)凝膠 苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機凝膠； 非極性有機溶劑為流動相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑（3）硬質(zhì)凝膠 多孔硅膠、多孔玻珠等； 化學穩(wěn)定

16、性、熱穩(wěn)定性好、機械強度大，流動相性質(zhì)影響小， 可在較高流速下使用。 可控孔徑玻璃微球，具有恒定孔徑和窄粒度分布。2022/10/5 高效液相色譜分離類型選擇 2022/10/5二、液相色譜的流動相（mobile phases of LC）1.、流動相特性 （1）液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況； （2）親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。 （3）若流動相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。 2022/10

17、/52.、流動相類別按流動相組成分：單組分和多組分；按極性分：極性、弱極性、非極性；按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙 腈、水。 采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進分離或調(diào)整出峰時間。2022/10/53、 流動相選擇 在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。 采用正相液-液分配分離時：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時間太短，降低溶劑極性，反之增加。 也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時間縮短。 常用溶劑的極性順序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六環(huán)

18、四氫呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 異丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳環(huán)己烷己烷煤油(最小)2022/10/54.、選擇流動相時應注意的幾個問題（1）盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。（2）避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。不與固定相起化學反應，以免固定相流失。不改變固體吸附劑的吸附活性，不與吸附劑起不可逆吸附。（3）試樣在流動相中應有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積，能很好溶解分析試樣。（4）流動相同時還應滿足檢測器的要求。當使用紫外檢測器時，流動相不應有紫外吸收。（5）溶劑粘度小，擴散系數(shù)大，以減小傳質(zhì)阻力。

19、2022/10/5第五節(jié) 高效液相色譜儀 2022/10/5流 程1.高壓輸液泵2022/10/5主要部件之一，壓力：150350105 Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。應具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性2.梯度淋洗裝置2022/10/5內(nèi)梯度（高壓梯度裝置）將兩種溶劑分別用泵增加后，按電器部件設定的程序，用兩臺泵分別把兩種極性不同的溶劑注入梯度混合室混合，再輸至色譜柱。外梯度（低壓梯度） 溶劑在常溫常壓下混合，用高壓泵, 通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比

20、例抽入高壓泵中混合。僅需一臺泵即可。2022/10/5梯度淋洗的優(yōu)點：（1）縮短總的分析時間，可提高分析速度1 19倍；（2）提高分離度；（3）改善色譜峰形狀，拖尾少；（4）提高柱效，降低最低檢出量。3. 進樣裝置2022/10/5 流路中為高壓力工作狀態(tài)， 通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置， 其結構如圖所示：4.高效分離柱2022/10/5 柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑16 mm，柱長540 cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。5.液相色譜檢測器2022/10/5 a. 紫外檢測器 應用最廣，對大部分有機化合物有響應。 特點： 靈敏度高； 線形范圍高； 流通池可做的很?。?mm 10mm

21、 ，容積 8L）； 對流動相的流速和溫度變化不敏感； 波長可選，易于操作； 可用于梯度洗脫。 5.液相色譜檢測器2022/10/5 a. 紫外檢測器(ultraviolet photometric detector) 原理：朗伯比爾定律。 優(yōu)點：應用最廣，對大部分有機化合物有響應，靈敏度高，線性范圍寬。是高效液相色譜儀的標準配置。它的最重要特征是對流動相的流速（脈沖）和溫度變化不敏感，可用于梯度洗脫。其次，流通池可做的很?。?mm10mm ，容積8L)。固定波長汞燈254、280nm,可變波長氘燈200450nm. 光路長510mm。 缺點：對無紫外吸收的組分不響應，而對紫外吸收較大的溶劑如苯不能作流動相使用。 雙光路紫外檢測器b. 光電二極管陣列檢測器2022/10/5 紫外檢測器的重要進展； 光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，