大連海洋大學(xué)微生物上課講義-第七章

1、第七章 微生物的遺傳變異和育種 遺傳性：指生物體的親代傳遞給其子代的一套遺傳信息的特性遺傳型：基因型，生物體所含有的全部遺傳因子所攜帶的遺傳信息表型：某一生物體所具有的一切外表特征和內(nèi)在特性的總和，是其遺傳型在合適環(huán)境條件下通過代謝和發(fā)育而得到的具體體現(xiàn)變異：指生物體在某種外因或內(nèi)因的作用下所引起的遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)或數(shù)量的改變飾變：指外表的修飾性改變，它不涉及遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變而只發(fā)生在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯水平上的表型變化微生物的獨(dú)特生物學(xué)特性：物種與代謝類型的多樣性；個(gè)體的體制極其簡單；營養(yǎng)體一般都是單倍體；易于在成分簡單的培養(yǎng)基上大量繁殖；繁殖速度快；易于積累不同的中間代謝物或終產(chǎn)物；菌落形態(tài)的可見性與多

2、樣性；環(huán)境條件對微生物群體中各個(gè)體作用的直接性和均一性；易于形成營養(yǎng)缺陷型菌株；各種微生物一般都有其相應(yīng)的病毒；以及多種原始有性生殖方式等第一節(jié)：遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ) 一、 3 個(gè)經(jīng)典實(shí)驗(yàn) （一）轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 用肺炎鏈球菌 Streptococcus pneumoniae 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中有 致病性，有莢膜，菌落表面光滑的菌株，稱為S型；無致病性，無莢膜，菌落表面粗糙的菌株，稱為R型11928年， Griffith 的實(shí)驗(yàn) HYPERLINK file:/D:曙光計(jì)劃大學(xué)基礎(chǔ)課程專業(yè)輔助課程微生物學(xué)微生物課件2012光盤圖images7.1-1Griffith的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn).bmp t _blank 圖

3、21944年， Avery 等人的實(shí)驗(yàn) HYPERLINK file:/D:曙光計(jì)劃大學(xué)基礎(chǔ)課程專業(yè)輔助課程微生物學(xué)微生物課件2012光盤圖images7.1-2Avery的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn).bmp t _blank 圖 （二）噬菌體感染實(shí)驗(yàn) Heishey 和 Chase (1952) 證明T2噬菌體的 DNA 含有整套遺傳信息 (包括編碼蛋白質(zhì)外殼的基因在內(nèi)) 。 HYPERLINK file:/D:曙光計(jì)劃大學(xué)基礎(chǔ)課程專業(yè)輔助課程微生物學(xué)微生物課件2012書中圖和表第七章微生物遺傳-新.jpg t _blank 圖（三）植物病毒的重建實(shí)驗(yàn) Fraenkel-Conrat(1956) 證明RNA是

4、遺傳物質(zhì) HYPERLINK file:/D:曙光計(jì)劃大學(xué)基礎(chǔ)課程專業(yè)輔助課程微生物學(xué)微生物課件2012光盤圖images7.1-3煙草花葉病毒(TMV)的拆開和重組實(shí)驗(yàn).bmp t _blank 圖阮病毒的發(fā)現(xiàn)和思考 亞病毒的一種：具有傳染性的蛋白質(zhì)致病因子，迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)該蛋白內(nèi)含有核酸其致病作用是由于動物體內(nèi)正常的蛋白質(zhì) PrP c 改變折疊狀態(tài)為 PrP sc所致，而這二種蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)并沒有改變蛋白質(zhì)是否可以作為遺傳物質(zhì)？ prion 是生命的一個(gè)特例？還是僅僅為表達(dá)調(diào)控的一種形式？蛋白質(zhì)折疊與功能的關(guān)系，是否存在折疊密碼？ 二、遺傳物質(zhì)在微生物細(xì)胞內(nèi)存在的部位及方式 （一） 7

5、 個(gè)水平 1.細(xì)胞水平 真核生物和原核生物的大部分 DNA 都集中在細(xì)胞核和核區(qū)中。不同種微生物或同種微生物的不同細(xì)胞中，細(xì)胞核的數(shù)目常有不同2.細(xì)胞核水平 真核生物的細(xì)胞核是有核膜包裹、形態(tài)固定的真核，核內(nèi)的 DNA 與組蛋白結(jié)合在一起形成核染色體；原核生物只有原始的、無核膜包裹的呈松散狀態(tài)存在的核區(qū)，其 DNA 呈雙鏈環(huán)狀基因組：指一個(gè)生物體、細(xì)胞器或病毒中的一整套基因核外染色體 HYPERLINK file:/D:曙光計(jì)劃大學(xué)基礎(chǔ)課程專業(yè)輔助課程微生物學(xué)微生物課件2012書中圖和表第七章遺傳物質(zhì)類型.JPG t _blank 表3. 染色體水平 （1）染色體數(shù) 不同生物染色體數(shù)差別很大（

6、2）染色體的倍數(shù) 同一細(xì)胞中相同染色體的套數(shù)。如果一個(gè)細(xì)胞中只有一套染色體，稱單倍體；如果一個(gè)細(xì)胞中含有兩套功能相同的染色體，稱雙倍體4. 核酸水平 （1）核酸種類 DNA、RNA （2）核酸結(jié)構(gòu) 單鏈、雙鏈，雙鏈 DNA ：環(huán)狀、線狀、超螺旋狀 （3） DNA 的長度 即基因組的大小，用 bp、kb、Mb 作單位。不同微生物基因組的大小差別很大。 參見P194195 表 72 5. 基因水平 基因：生物體內(nèi)一切具有自主復(fù)制能力的最小遺傳功能單位，其物質(zhì)基礎(chǔ)是一條以直線排列、具有特定核苷酸序列的核酸片段。它能編碼功能性蛋白質(zhì)或 RNA 分子或僅具有調(diào)空作用等。每個(gè)基因約 10001500bp

7、，分子量在 67 10 5 左右原核生物的基因是通過基因調(diào)空系統(tǒng)而發(fā)揮作用?；蛘{(diào)空系統(tǒng)是由一個(gè)操縱子和它的調(diào)節(jié)基因組成。每一操縱子又包括結(jié)構(gòu)基因、操縱基因和啟動基因6. 密碼子水平 遺傳密碼是指決定 mRNA 鏈中 4 種核苷酸的線性排列順序與由它所編碼的多肽和蛋白質(zhì)中20種氨基酸線性排列順序的特定對應(yīng)性的一套規(guī)則。 密碼子是遺傳密碼的信息單位，每個(gè)密碼子是由3 個(gè)核苷酸組成的序列，構(gòu)成一個(gè)三聯(lián)體，生物界有64個(gè)密碼子，決定20種氨基酸，故有多種氨基酸的密碼子不止一個(gè)，無意義密碼子7. 核苷酸水平 核苷酸單位是一個(gè)最低突變單位或交換單位。大多數(shù)生物的 DNA 含 AMP、TMP、GMP、CM

8、P 。少數(shù)例外，如大腸桿菌的 T 偶數(shù)噬菌體的 DNA 含 HMC（二）原核生物的質(zhì)粒 1. 定義和特點(diǎn) 質(zhì)粒：游離于原核生物核基因組以外，具有獨(dú)立復(fù)制能力的細(xì)胞質(zhì)遺傳因子。通常是共價(jià)閉合環(huán)狀的超螺旋 dsDNA 分子，即 cccDNA 型。質(zhì)粒的大小一般在 1.5300kb, 相對分子質(zhì)量為 106 108 特點(diǎn)：能自我復(fù)制，穩(wěn)定的遺傳；可在不同菌株間轉(zhuǎn)移；質(zhì)粒消除； 質(zhì)粒間具有不相容性。2. 質(zhì)粒在基因工程中的應(yīng)用 質(zhì)粒用于基因工程操作的優(yōu)點(diǎn)： 具有較小的相對分子質(zhì)量，便于 DNA 的分離和操作 具有獨(dú)立復(fù)制起點(diǎn) 具有較高的拷貝數(shù)，使外源 DNA 可大量擴(kuò)增 具有便于選擇的標(biāo)記，如抗藥性基

9、因 易導(dǎo)入細(xì)胞 具有安全性現(xiàn)今所用的克隆載體大多數(shù)是由質(zhì)粒改建而成的。如 E.coli 的 pBR322 質(zhì)粒 HYPERLINK file:/D:曙光計(jì)劃大學(xué)基礎(chǔ)課程專業(yè)輔助課程微生物學(xué)微生物課件2012書中圖和表第七章7-3.JPG t _blank 圖克隆載體：以擴(kuò)增外源 DNA 為目的的載體限制性核酸內(nèi)切酶：指能識別雙鏈 DNA 分子的特定序列，并在其識別位點(diǎn) 或其附近切割 DNA 的一類內(nèi)切酶3. 質(zhì)粒的分離與鑒定 質(zhì)粒的分離一般可包括細(xì)胞的裂解、蛋白質(zhì)和 RNA 的去除以及使質(zhì)粒 DNA 和染色體 DNA 相分離等步驟。鑒定可用電鏡、瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳4. 質(zhì)粒的種類 大致

10、分5類，見p199 表74 5. 典型質(zhì)粒簡介 （1） F質(zhì)粒 （F因子），是大腸桿菌等細(xì)菌決定性別并具有轉(zhuǎn)移能力的質(zhì)粒（2） R質(zhì)粒 攜帶有分解某種抗生素或藥物酶系基因的質(zhì)粒，可以賦予宿主細(xì)胞耐或抗或分解或失活某種抗生素或藥物的性能（3） Col質(zhì)粒 大腸桿菌素質(zhì)粒，攜帶有編碼大腸桿菌素的基因，大腸桿菌素是一類由大腸桿菌某些菌株所產(chǎn)生的細(xì)菌素，具有通過抑制復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯和能量代謝等方式而專一性地殺死它種腸道菌或同種其他菌株的能力許多細(xì)菌能產(chǎn)生抑制或殺死其他近緣細(xì)菌或同種不同菌株的代謝產(chǎn)物，因?yàn)樗怯少|(zhì)粒編碼的蛋白質(zhì)，不象抗生素那樣具有很廣的殺菌譜，所以稱為細(xì)菌素P201 表75 ColE1

11、 已廣泛用于重組DNA的研究和體外復(fù)制系統(tǒng)上（4）Ti 質(zhì)粒 誘癌質(zhì)?；蚬诎`質(zhì)粒，存在于致病菌根癌土壤桿菌中的攜帶有可以導(dǎo)致許多雙子葉植物根系產(chǎn)生冠癭瘤基因的質(zhì)粒（5） Ri 質(zhì)粒 存在于根癌土壤桿菌中的攜帶有可以導(dǎo)致許多雙子葉植物根系產(chǎn)生毛狀根基因的質(zhì)粒（6） mega 質(zhì)粒 巨大質(zhì)粒，存在于根瘤菌中，其上有一系列與共生固氮相關(guān)的基因（7）降解性質(zhì)粒 攜帶有降解某些復(fù)雜有機(jī)物的酶的基因的質(zhì)粒，賦予宿主細(xì)胞降解復(fù)雜有機(jī)物的能力第二節(jié) 基因突變和誘變育種 一、基因突變 基因突變：點(diǎn)突變，由于DNA（RNA 病毒和噬菌體的 RNA）鏈上的一對或少數(shù)幾對堿基被另一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)堿基對取代發(fā)生改變的突變

12、類型從自然界分離到的菌株一般稱為野生型菌株，簡稱野生型。野生型經(jīng)突變后變成帶有新性狀的菌株，稱突變株或突變型（一）突變類型 按突變后極少數(shù)突變株的表型是否在選擇培養(yǎng)基上迅速選出和鑒別來分，可分為選擇性突變株和非選擇性突變株。前者包括營養(yǎng)缺陷型、抗性突變型和條件致死突變型；后者包括形態(tài)突變型，抗原突變型和產(chǎn)量突變型1. 營養(yǎng)缺陷型 某一野生型菌株由于發(fā)生基因突變而喪失合成一種或幾種生長因子的能力，因而無法在基本培養(yǎng)基上正常生長的變異類型營養(yǎng)缺陷型是微生物遺傳學(xué)研究中重要的選擇標(biāo)記和育種的重要手段2. 抗性突變型 指野生型菌株因發(fā)生基因突變，而產(chǎn)生的對有害理化因素的抗性變異菌株抗藥性突變型（res

13、istant mutant） 基因突變使菌株對某種或某幾種藥物，特別是抗生素，產(chǎn)生抗性特點(diǎn)：正選擇標(biāo)記（突變株可直接從抗性平板上獲得 - 在加有相應(yīng)抗生素的平板上，只有抗性突變能生長。所以很容易分離得到）表示方法：所抗藥物的前三個(gè)小寫斜體英文字母加上 “r” 表示 , str r 和 str s 分別表示對鏈霉素的抗性和敏感性 3. 條件致死突變型 在某一條件下具有致死效應(yīng)，而在另一條件下沒有致死效應(yīng)的突變型常用的條件致死突變是溫度敏感突變，用ts （ temperature sensitive ）表示，這類突變在高溫下（如42 ）是致死的，但可以在低溫（如 25 -30 ）下得到這種突變。

14、( 負(fù)選擇標(biāo)記 ) 4. 形態(tài)突變型 由突變引起的個(gè)體或菌落形態(tài)改變的突變型5. 抗原突變型 由于基因突變引起的細(xì)胞抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的突變型6. 產(chǎn)量突變型 通過基因突變而產(chǎn)生的在代謝產(chǎn)物上產(chǎn)量有別于原始菌株的突變型（二）突變率 突變率：某一細(xì)胞（或病毒粒）在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率（三）基因突變的特點(diǎn) 基因突變有以下 7 個(gè)特點(diǎn)： 自發(fā)性，基因突變可自發(fā)產(chǎn)生 不對應(yīng)性，指突變性狀（如抗青霉素）與引起突變的原因無直接對應(yīng)關(guān)系 稀有性，通常自發(fā)突變的幾率在 10 -610 -9 間 獨(dú)立性，某基因的突變率不受它種基因突變率的影響 可誘變性，自發(fā)突變的頻率可因誘變劑的影響而大為提高（提高

15、10-10 5 倍）倍 穩(wěn)定性，基因突變后的新遺傳性狀是穩(wěn)定的 可逆性，野生型菌株某一性狀可發(fā)生正向突變，也可發(fā)生相反的回復(fù)突變（四）基因突變的自發(fā)性和不對應(yīng)性的證明 1.Luria 等的變量試驗(yàn) HYPERLINK file:/D:曙光計(jì)劃大學(xué)基礎(chǔ)課程專業(yè)輔助課程微生物學(xué)微生物課件2012新建文件夾%20(13)zhou-f8變量試驗(yàn).jpg t _blank 圖 2.Newcombe 的涂布試驗(yàn) HYPERLINK file:/D:曙光計(jì)劃大學(xué)基礎(chǔ)課程專業(yè)輔助課程微生物學(xué)微生物課件2012新建文件夾%20(13)zhou-f8涂布試驗(yàn).jpg t _blank 圖 3.Lederberg

16、的影印平板培養(yǎng)法 HYPERLINK file:/D:曙光計(jì)劃大學(xué)基礎(chǔ)課程專業(yè)輔助課程微生物學(xué)微生物課件2012新建文件夾%20(13)7-5影印培養(yǎng)實(shí)驗(yàn).jpg t _blank 圖 證明突變的性狀與引起突變的原因間無直接對應(yīng)關(guān)系，突變是自發(fā)產(chǎn)生的影印平板培養(yǎng)法： 影印平板培養(yǎng)法不僅在遺傳學(xué)基礎(chǔ)理論的研究中發(fā)揮了重要作用，而且在育種實(shí)戰(zhàn)和其他研究中也具有重要的應(yīng)用（五）基因突變及其機(jī)制 突變機(jī)制 HYPERLINK file:/D:曙光計(jì)劃大學(xué)基礎(chǔ)課程專業(yè)輔助課程微生物學(xué)微生物課件2012光盤圖images7.5-1突變的類型.bmp t _blank 圖1. 誘發(fā)突變 誘變：指通過認(rèn)為的方

17、法，利用物理、化學(xué)或生物因素顯著提高基因自發(fā)突變頻率的手段。誘發(fā)突變并非是用誘變劑產(chǎn)生新的突變，而是通過不同的方式提高突變率誘變劑：具有誘變效應(yīng)的任何因素，都稱誘變劑堿基的置換 HYPERLINK file:/D:曙光計(jì)劃大學(xué)基礎(chǔ)課程專業(yè)輔助課程微生物學(xué)微生物課件2012光盤圖images7.5-1突變的類型.bmp t _blank 圖堿基的置換：是染色體的微小損傷，只涉及一對堿基被另一對堿基所置換轉(zhuǎn)換： DNA 鏈中一個(gè)嘌呤被另一嘌呤或是一個(gè)嘧啶被另一個(gè)嘧啶所置換顛換： DNA 鏈中一個(gè)嘌呤被另一嘧啶或是一個(gè)嘧啶被另一個(gè)嘌呤所置換由堿基置換而引起的密碼子突變和多肽鏈合成的可能影響 HYPE

18、RLINK file:/D:曙光計(jì)劃大學(xué)基礎(chǔ)課程專業(yè)輔助課程微生物學(xué)微生物課件2012書中圖和表第七章7-10.JPG t _blank 圖錯(cuò)義突變：堿基序列的改變引起了產(chǎn)物氨基酸的改變。有些錯(cuò)義突變嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)的活性甚至使之完全無活性，從而影響表型無義突變：某個(gè)堿基的改變，使代表某種氨基酸的密碼子變成蛋白質(zhì)合成的終止密碼子。蛋白質(zhì)的合成提前終止，產(chǎn)生不完整蛋白質(zhì)同義突變：某個(gè)堿基的變化沒有改變產(chǎn)物氨基酸序列的密碼子變化 直接引起置換的誘變劑 可直接與核酸的堿基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。 亞硝酸：引起含 NH2 基的堿基 (A.G.C) 產(chǎn)生氧化脫氨反應(yīng)，造成堿基置換 HYPERLINK file:/D

19、:曙光計(jì)劃大學(xué)基礎(chǔ)課程專業(yè)輔助課程微生物學(xué)微生物課件2012光盤圖images7.5-3嚴(yán)硝酸引起ATGC轉(zhuǎn)換簡圖.bmp t _blank 圖 HYPERLINK file:/D:曙光計(jì)劃大學(xué)基礎(chǔ)課程專業(yè)輔助課程微生物學(xué)微生物課件2012光盤圖flash7.5-4.swf t _blank Flash1 HYPERLINK file:/D:曙光計(jì)劃大學(xué)基礎(chǔ)課程專業(yè)輔助課程微生物學(xué)微生物課件2012光盤圖flash7.5-5.swf t _blank Flash2羥胺: 幾乎只和胞嘧啶發(fā)生反應(yīng)，因此只引起 GCAT 的轉(zhuǎn)換 間接引起置換的誘變劑 堿基類似物，通過活細(xì)胞的代謝活動摻與到DNA分子

20、中去以 5-溴尿嘧啶為例 HYPERLINK file:/D:曙光計(jì)劃大學(xué)基礎(chǔ)課程專業(yè)輔助課程微生物學(xué)微生物課件2012光盤圖flash7.5-6.swf t _blank Flash（2）移碼突變 移碼突變：由于DNA序列中一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)核苷酸發(fā)生增添或缺失，從而使該處后面的全部遺傳密碼的閱讀框架發(fā)生改變，并進(jìn)一步引起轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯錯(cuò)誤的一類突變能引起移碼突變的因素是一些吖啶類染料。 HYPERLINK file:/D:曙光計(jì)劃大學(xué)基礎(chǔ)課程專業(yè)輔助課程微生物學(xué)微生物課件2012書中圖和表第七章7-11.JPG t _blank 圖 （3）染色體畸變 DNA 鏈上大段發(fā)生變化或損傷，包括染色體結(jié)構(gòu)

21、上的缺失、重復(fù)、插入、易位和倒位，也包括染色體數(shù)目的變化轉(zhuǎn)座： DNA 序列通過非同源重組的方式，從染色體某一部位轉(zhuǎn)移到同一染色體上另一部位或其他染色體上某一部位的現(xiàn)象轉(zhuǎn)座因子： 位于染色體或質(zhì)粒上的一段能改變自身位置的 DNA 序列，廣泛分布于原核和真核細(xì)胞中原核生物的轉(zhuǎn)座因子有三種類型：插入序列、轉(zhuǎn)座子和 E.coli 的 Mu 噬菌體等轉(zhuǎn)座噬菌體轉(zhuǎn)座因子的特點(diǎn)：在轉(zhuǎn)座時(shí)，通過轉(zhuǎn)座因子的復(fù)制，可將新形成的拷貝以非同源重組的方式轉(zhuǎn)移到染色體的新部位上；在轉(zhuǎn)座因子的兩端各有一段一定長度的末端重復(fù)序列；每個(gè)轉(zhuǎn)座因子帶有一個(gè)對轉(zhuǎn)座有特異功能的轉(zhuǎn)座酶基因轉(zhuǎn)座因子的插入引起受體 DNA 上靶序列的復(fù)制

22、 HYPERLINK file:/D:曙光計(jì)劃大學(xué)基礎(chǔ)課程專業(yè)輔助課程微生物學(xué)微生物課件2012書中圖和表第七章7-12.JPG t _blank 圖 2. 自發(fā)突變 自發(fā)突變：指生物體在無人工干預(yù)下自然發(fā)生的低頻率的突變自發(fā)突變的原因： 由背景輻射和環(huán)境因素引起 由微生物本身有害代謝產(chǎn)物引起 由 DNA 復(fù)制過程堿基配對錯(cuò)誤引起自發(fā)突變的原因：DNA 聚合酶產(chǎn)生的錯(cuò)誤；DNA 的物理損傷； 重組 ； 轉(zhuǎn)座等。 由于修復(fù)系統(tǒng)使突變率降到最低點(diǎn) 主要原因：堿基的互變異構(gòu)；移碼突變；轉(zhuǎn)座因子插入突變（六）紫外線對 DNA 的損傷及其修復(fù) UV 對 DNA 的損傷 HYPERLINK file:/D

23、:曙光計(jì)劃大學(xué)基礎(chǔ)課程專業(yè)輔助課程微生物學(xué)微生物課件2012光盤圖flash7.5-2.swf t _blank Flash1. 光復(fù)活作用 光解酶在黑暗中專一性識別嘧啶二聚體，并與之結(jié)合，形成酶 -DNA 復(fù)合物，當(dāng)有光照時(shí)，酶利用光能將二聚體拆開，恢復(fù)原狀，酶再釋放出來 AKelner 1949 年在灰色鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)2. 切除修復(fù) 內(nèi)切核酸酶、外切核酸酶、DNA聚合酶和連接酶3. 重組修復(fù)越過損傷而進(jìn)行的修復(fù)。4. SOS 修復(fù) DNA 分子受到較大范圍的重大損傷時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種應(yīng)急反應(yīng)二、突變與育種 （一）自發(fā)突變與育種 1. 從生產(chǎn)中育種 2. 定向培育優(yōu)良菌株 定向培育：是一種利用微

24、生物的自發(fā)突變，并采用特定的選擇條件，通過對微生物群體不斷移植以選育出優(yōu)良菌株的古老方法（二）誘變育種 誘變育種：利用物理化學(xué)因素處理均勻分散的微生物細(xì)胞群，在促進(jìn)其突變率顯著提高的基礎(chǔ)上，采用簡便、快速和高效的篩選方法，從中挑選出少數(shù)符合育種目的的突變株在誘變育種過程中，誘變和篩選是兩個(gè)主要環(huán)節(jié)，由于誘變是隨機(jī)的，而篩選是定向的，故相比之下，后者更為重要1. 誘變育種的基本環(huán)節(jié) 2. 誘變育種中的幾個(gè)原則 （1）選擇簡便有效的誘變劑 物理誘變劑：有非電離輻射類的 紫外線 、激光和離子束等，能引起電離輻射的射線、射線和快中子等化學(xué)誘變劑：烷化劑、堿基類似物和吖啶類化合物誘變劑與致癌物質(zhì)Ames

25、 試驗(yàn)（參見 P 212 ） 美國加利福尼亞大學(xué)的 Bruce Ames 教授于 1966 年發(fā)明，因此稱為 Ames 試驗(yàn) 具體操作：檢測鼠傷寒沙門氏菌 ( Salmonella typhmurium ) 組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株 (his) 的回復(fù)突變率回復(fù)突變 (reverse mutation 或 back mutation)： 突變體失去的野生型性狀，可以通過第二次突變得到恢復(fù)，這種第二次突變稱為回復(fù)突變由于生物體內(nèi)、體外可能存在的差異，可在體外加入哺乳動物（如大鼠）微粒體酶系統(tǒng)，使待測物活化，使 Ames 試驗(yàn)的準(zhǔn)確率達(dá) 8090% HYPERLINK file:/D:曙光計(jì)劃大學(xué)基礎(chǔ)

26、課程專業(yè)輔助課程微生物學(xué)微生物課件2012書中圖和表第七章7-15.JPG t _blank 圖物理誘變劑中紫外線最簡便，誘變效果也較理想?；瘜W(xué)誘變劑中應(yīng)用較廣泛的是“超誘變劑” NTG（ N- 甲基 -N- 硝基 -N- 亞硝基胍），EMS （甲基磺酸乙酯）紫外輻射的誘變劑量和照射方法： （2）挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株 出發(fā)菌株就是用于育種的原始菌株（3）處理單細(xì)胞或單孢子懸液 有些微生物細(xì)胞是多核的；表型延遲均可導(dǎo)致不純菌落的出現(xiàn)，所以誘變育種的菌株，應(yīng)選用均勻分散的單細(xì)胞懸液狀態(tài)，以便使每個(gè)細(xì)胞均勻接觸誘變劑并防止出現(xiàn)不純菌落（4）選用最適的劑量 化學(xué)誘變劑劑量以在一定條件下誘變劑的濃度和處理

27、時(shí)間來表示在產(chǎn)量性狀的誘變育種中，凡在提高誘變率的基礎(chǔ)上，既能擴(kuò)大變異幅度，又能促進(jìn)變異移向正變范圍的劑量，就是合適的劑量（5）充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng) （6）利用和創(chuàng)造形態(tài)、生理與產(chǎn)量間相關(guān)的指標(biāo) 利用鑒別性培養(yǎng)基的原理或其他途徑，可有效地把原先肉眼無法觀察的生理性狀或產(chǎn)量性狀轉(zhuǎn)化為可見的形態(tài)性狀。如蛋白酶水解圈大小、抗生素抑菌圈大小等（7）設(shè)計(jì)高效篩選方案 篩選分初篩和復(fù)篩，前者以量為主，后者以質(zhì)為主。 （8）創(chuàng)造新型篩選方法 初篩以粗測為主，可采用瓊脂平板或搖瓶培養(yǎng)后測定。復(fù)篩是對突變株的生產(chǎn)性能進(jìn)行較精確的測定，一般用搖瓶或臺式發(fā)酵罐進(jìn)行3. 營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選 與篩選營養(yǎng)缺陷型

28、突變株有關(guān)的 3 類培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基（ MM ，符號 ）：僅能滿足某微生物的野生型菌株生長所需要的最低成分的組合培養(yǎng)基，稱基本培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基（ CM ，符號 + ）：凡可滿足一切營養(yǎng)缺陷型菌株?duì)I養(yǎng)需要的天然或半組合培養(yǎng)基，稱完全培養(yǎng)基補(bǔ)充培養(yǎng)基（ SM ，符號 AB 等）：凡能滿足相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型突變株生長需要的天然或半組合培養(yǎng)基，稱補(bǔ)充培養(yǎng)基 與營養(yǎng)缺陷型有關(guān)的 3 類遺傳型個(gè)體 野生型：指從自然界分離到的任何微生物在其發(fā)生認(rèn)為營養(yǎng)缺陷突變前的原始菌株。能在基本培養(yǎng)基上生長。遺傳型為 A+B+ 營養(yǎng)缺陷型：野生型菌株經(jīng)誘變劑處理后，由于發(fā)生了喪失某酶合成能力的突變，因而只能在加有該酶合成

29、產(chǎn)物的培養(yǎng)基中才能生長，這類突變菌株稱為營養(yǎng)缺陷型突變株，簡稱營養(yǎng)缺陷型。只能在完全培養(yǎng)基或相應(yīng)的補(bǔ)充培養(yǎng)基上生長。遺傳型為 A-B+ 或 A+B-原養(yǎng)型：一般指營養(yǎng)缺陷型突變株經(jīng)回復(fù)突變或重組后產(chǎn)生的菌株，其營養(yǎng)要求在表型上與野生型相同，均為 A+B+ 營養(yǎng)缺陷型的篩選方法 營養(yǎng)缺陷型的篩選一般要經(jīng)過誘變、淘汰野生型、檢出和鑒定營養(yǎng)缺陷型4個(gè)步驟。 第一步，誘變劑處理：與一般誘變處理相同。 第二步，淘汰野生型：抗生素法 - 青霉素法適用于細(xì)菌，制霉菌素法適用于真菌，菌絲過濾法 第三步，檢出缺陷型：夾層培養(yǎng)法 HYPERLINK file:/D:曙光計(jì)劃大學(xué)基礎(chǔ)課程專業(yè)輔助課程微生物學(xué)微生物課

30、件2012書中圖和表第七章7-19.JPG t _blank 圖，限量補(bǔ)充培養(yǎng)法，逐個(gè)檢出法，影印平板法 HYPERLINK file:/D:曙光計(jì)劃大學(xué)基礎(chǔ)課程專業(yè)輔助課程微生物學(xué)微生物課件2012書中圖和表第七章7-20.JPG t _blank 圖 第四步，鑒定缺陷型：生長譜法 第三節(jié) 基因重組 基因重組：兩個(gè)獨(dú)立基因組內(nèi)的遺傳基因，通過一定的途徑轉(zhuǎn)移到一起，形成新的穩(wěn)定基因組的過程一、原核生物的基因重組 特 點(diǎn)： 片段性 單向性 轉(zhuǎn)移機(jī)制獨(dú)特而多樣 （一）轉(zhuǎn) 化 概 念：受體菌直接吸收供體菌的 DNA 片段而獲得后者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的受體菌稱轉(zhuǎn)化子感受態(tài)與感受態(tài)因子

31、：感受態(tài)是指受體菌最易接受外源DNA片段并能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的生理狀態(tài)。調(diào)節(jié)感受態(tài)的一類特異蛋白稱感受態(tài)因子，包括膜連DNA結(jié)合蛋白、細(xì)胞壁自溶素、和幾種核酸酶轉(zhuǎn)化因子的本質(zhì)是離體的DNA片段。不同微生物中轉(zhuǎn)化因子的形式不同，如嗜血桿菌屬的細(xì)胞吸收dsDNA 形式的轉(zhuǎn)化因子，而鏈球菌屬的細(xì)胞只吸收ssDNA 形式的轉(zhuǎn)化因子。質(zhì)粒也是良好的轉(zhuǎn)化因子，但它們通常不與核染色體組發(fā)生重組轉(zhuǎn)化過程：肺炎鏈球菌 供體菌的dsDNA 片段與感受態(tài)受體菌細(xì)胞表面的膜連DNA結(jié)合蛋白結(jié)合，其中一條鏈被核酸酶降解，另一條進(jìn)入細(xì)胞 來自供體菌的ssDNA 片段被細(xì)胞內(nèi)的特異蛋白結(jié)合，并使其與受體菌核染色體上的同源區(qū)段配對、

32、重組，形成一小段雜合 DNA 區(qū)段 受體菌染色體組復(fù)制，雜合區(qū)也得到復(fù)制 細(xì)胞分裂后，形成一個(gè)轉(zhuǎn)化子 HYPERLINK file:/D:曙光計(jì)劃大學(xué)基礎(chǔ)課程專業(yè)輔助課程微生物學(xué)微生物課件2012光盤圖images7.2-1轉(zhuǎn)化過程示意圖.bmp t _blank 圖轉(zhuǎn) 染：用提純的噬菌體或其他病毒的DNA（或RNA）去感染其宿主細(xì)胞或其原生質(zhì)體，可增殖出一群正常噬菌體或病毒后代的現(xiàn)象（二）轉(zhuǎn)導(dǎo) 轉(zhuǎn) 導(dǎo)：通過缺陷噬菌體的媒介，把供體細(xì)胞的DNA片段攜帶到受體細(xì)胞中，通過交換與整合，后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象。由轉(zhuǎn)導(dǎo)而獲得部分新性狀的重組細(xì)胞，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)子能將一個(gè)細(xì)菌宿主的部分染色體或質(zhì)粒DN

33、A帶到另一個(gè)細(xì)菌的噬菌體稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體 細(xì)菌轉(zhuǎn)導(dǎo)的二種類型：普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)，局限轉(zhuǎn)導(dǎo) 1. 普遍轉(zhuǎn)導(dǎo) 普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)：通過完全缺陷噬菌體對供體菌基因組上的任何小片段 DNA 進(jìn)行誤包，而將其遺傳性狀傳遞給受體菌的現(xiàn)象(1) 意外的發(fā)現(xiàn) HYPERLINK file:/D:曙光計(jì)劃大學(xué)基礎(chǔ)課程專業(yè)輔助課程微生物學(xué)微生物課件2012光盤圖flash7.2-2.swf t _blank Flash (2) 轉(zhuǎn)導(dǎo)模型 HYPERLINK file:/D:曙光計(jì)劃大學(xué)基礎(chǔ)課程專業(yè)輔助課程微生物學(xué)微生物課件2012光盤圖flash7.2-3.swf t _blank Flash2. 局限轉(zhuǎn)導(dǎo) 局限轉(zhuǎn)導(dǎo)：通過部分缺陷的

34、溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中，并與后者的基因組整合，形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子的現(xiàn)象特點(diǎn)： 只局限于傳遞供體菌核染色體上的個(gè)別特定基因 該特定基因由部分缺陷的溫和噬菌體攜帶 缺陷噬菌體的形成方式是由于它在脫離宿主染色體過程中，發(fā)生立頻率的誤切或由于雙重溶源菌的裂解后形成 HYPERLINK file:/D:曙光計(jì)劃大學(xué)基礎(chǔ)課程專業(yè)輔助課程微生物學(xué)微生物課件2012光盤圖images7.2-5局限轉(zhuǎn)導(dǎo)澨菌體的形成.bmp t _blank 圖 局限轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的產(chǎn)生要通過UV等因素對溶源菌的誘導(dǎo)并引起裂解后才產(chǎn)生（1）低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（LFT） 通過一般溶源菌釋放的噬菌體所進(jìn)行的轉(zhuǎn)導(dǎo)。因其只能形成極少數(shù)

35、的轉(zhuǎn)導(dǎo)子，故稱低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（2）高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（HFT） 在局限轉(zhuǎn)導(dǎo)中，若對雙重溶源菌進(jìn)行誘導(dǎo)，就會產(chǎn)生 50% 左右的局限轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)裂解物，用這種裂解物去轉(zhuǎn)導(dǎo)受體菌，就可獲得 50% 左右的轉(zhuǎn)導(dǎo)子，故稱高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)雙重溶源菌：同時(shí)感染有正常噬菌體和缺陷噬菌體的受體菌3. 溶源轉(zhuǎn)變 當(dāng)正常的溫和噬菌體感染其宿主而使其發(fā)生溶源化時(shí)，因噬菌體基因整合到宿主的核基因組上，而使宿主獲得了新遺傳性狀的現(xiàn)象。如白喉棒桿菌只有在被溫和噬菌體感染而發(fā)生溶源化時(shí)才產(chǎn)生白喉毒素（三）接 合 通過細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸而產(chǎn)生的遺傳信息的轉(zhuǎn)移和重組過程 1.實(shí)驗(yàn)證據(jù)1946 年，Joshua Lederberg 和 Edw

36、ard L.Tatum 細(xì)菌的多重營養(yǎng)缺陷型雜交實(shí)驗(yàn): 中間平板上長出的原養(yǎng)型菌落是兩菌株之間發(fā)生了遺傳交換和重組所致！證實(shí)接合過程需要細(xì)胞間的直接接觸的 “U” 型管實(shí)驗(yàn)（ Bernard Davis，1950 ） HYPERLINK file:/D:曙光計(jì)劃大學(xué)基礎(chǔ)課程專業(yè)輔助課程微生物學(xué)微生物課件2012光盤圖flash7.2-6.swf t _blank Flash2. 機(jī)制 ( 大腸桿菌的接合機(jī)制 ) 接合作用是由一種被稱為F因子的質(zhì)粒介導(dǎo)， F因子的分子量通常為 5107( 94.5kb)，上面有編碼細(xì)菌產(chǎn)生性菌毛（ sex pili ）及控制接合過程進(jìn)行的 20 多個(gè)基因。 F

37、因子是一種屬于附加體的質(zhì)粒，也即它既可脫離核染色體組而在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)游離存在，也可插入即整合在染色體組上；它既可經(jīng)接合作用而獲得，也可通過吖啶類化合物、溴化乙錠等的處理，使其 DNA 的復(fù)制受抑制后而從細(xì)胞中消除；是合成性菌毛基因的載體，也是決定細(xì)菌性別的物質(zhì)基礎(chǔ)F因子的四種細(xì)胞形式 HYPERLINK file:/D:曙光計(jì)劃大學(xué)基礎(chǔ)課程專業(yè)輔助課程微生物學(xué)微生物課件2012光盤圖flash7.2-7.swf t _blank FlashF+菌株：細(xì)胞內(nèi)含有一至幾個(gè)F因子，游離存在，并在細(xì)胞表面著生一至幾條性菌F菌株：細(xì)胞內(nèi)不含有F因子，細(xì)胞表面沒有性菌毛Hfr菌株：細(xì)胞內(nèi)含有整合態(tài)的F因子，細(xì)

38、胞表面有性菌毛。 F 菌株：細(xì)胞內(nèi)含有游離存在但攜帶一小段核染色體基因的 F因子（ F 因子），細(xì)胞表面有性菌毛（1） F+ F 雜交 HYPERLINK file:/D:曙光計(jì)劃大學(xué)基礎(chǔ)課程專業(yè)輔助課程微生物學(xué)微生物課件2012光盤圖flash7.2-9.swf t _blank FlashF+ 菌株的 F 因子向 F 細(xì)胞轉(zhuǎn)移，但含 F 因子的宿主細(xì)胞的染色體 DNA 一般不被轉(zhuǎn)移雜交的結(jié)果：給體細(xì)胞和受體細(xì)胞均成為 F+ 細(xì)胞 理化因子的處理可將F因子消除而使 F+ 菌株變成 F菌株 （2） Hfr F 雜交 HYPERLINK file:/D:曙光計(jì)劃大學(xué)基礎(chǔ)課程專業(yè)輔助課程微生物學(xué)微

39、生物課件2012書中圖和表第七章7-28.JPG t _blank 圖（參見 P 217 ） Hfr 菌株的 F 因子插入到染色體 DNA 上，因此只要發(fā)生接合轉(zhuǎn)移過程，就可以把部分甚至全部細(xì)菌染色體傳遞給 F細(xì)胞并發(fā)生重組，由此而得名為高頻重組菌株Hfr菌株仍然保持著 F+ 細(xì)胞的特征，具有性菌毛，并象F+ 一樣與 F 細(xì)胞進(jìn)行接合。所不同的是，當(dāng) OriT 序列被缺刻螺旋酶識別而產(chǎn)生缺口后， F因子的先導(dǎo)區(qū) (leading region) 結(jié)合著染色體 DNA 向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移， F 因子除先導(dǎo)區(qū)以外，其余絕大部分是處于轉(zhuǎn)移染色體的末端，由于轉(zhuǎn)移過程常被中斷，因此 F 因子不易轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞

40、中，故 HfrF 雜交后的受體細(xì)胞 ( 或接合子 ) 大多數(shù)仍然是 F（3） F F 雜交 Hfr 菌株內(nèi)的 F 因子因不正常切割而脫離染色體時(shí)，形成游離的但攜帶一小段染色體基因的 F 因子，特稱為 F因子 HYPERLINK file:/D:曙光計(jì)劃大學(xué)基礎(chǔ)課程專業(yè)輔助課程微生物學(xué)微生物課件2012光盤圖flash7.2-8.swf t _blank FlashF F 與 F+F 的不同：給體的部分染色體基因隨 F 一起轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞 HYPERLINK file:/D:曙光計(jì)劃大學(xué)基礎(chǔ)課程專業(yè)輔助課程微生物學(xué)微生物課件2012光盤圖flash7.2-10.swf t _blank Flash

41、 與染色體發(fā)生重組 繼續(xù)存在于 F因子上，形成一種部分二倍體細(xì)胞基因的這種轉(zhuǎn)移過程又常稱為性導(dǎo) (sexduction），F(xiàn)因子轉(zhuǎn)導(dǎo)（F-duction），F(xiàn) 因子媒介的轉(zhuǎn)導(dǎo)（F-mediated transduction）（四）原生質(zhì)體融合 兩個(gè)親本菌株去除細(xì)胞壁后的一種體細(xì)胞雜交育種方法 1. 親本及其遺傳標(biāo)記選擇 營養(yǎng)缺陷、抗性標(biāo)記、熒光染色標(biāo)記等 2. 原生質(zhì)體制備 高滲溶液：無機(jī)鹽（KCl, NaCl, MgSO4）、 有機(jī)物 (蔗糖、甘露醇、山梨醇) 水解酶： 溶菌酶、蝸牛酶、纖維素酶、葡聚糖酶） 3. 原生質(zhì)體融合 化學(xué)融合法： 30%50%PEG(10006000) 誘導(dǎo)，滲透

42、壓，低速離心 1000-2000g 電融合: 細(xì)胞在電場作用下 , 細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生偶極化 , 促使細(xì)胞排列成串，外加瞬間高頻直流強(qiáng)電壓作用，原生質(zhì)膜穿孔復(fù)原 4. 原生質(zhì)體再生 再生培養(yǎng)基高滲，無機(jī)鹽 / 有機(jī)物，防止機(jī)械損傷 5. 融合子選擇 營養(yǎng)缺陷型，抗性，熒光染色標(biāo)記，鈍化選擇(親本一方融合前 50 23h)，連續(xù)傳代幾次 HYPERLINK file:/D:曙光計(jì)劃大學(xué)基礎(chǔ)課程專業(yè)輔助課程微生物學(xué)微生物課件2012光盤圖flash7.2-12.swf t _blank Flash 第四節(jié) 基因工程 一、概 念 是指對遺傳信息的分子操作和施工，即把分離到的或合成的基因經(jīng)過改造，插入載體中，導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)，使其擴(kuò)增和表達(dá)，從而獲得大量基