發(fā)酵產(chǎn)物提取和精制

1、關(guān)于發(fā)酵產(chǎn)物的提取與精制第1頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四概論下游加工過程在發(fā)酵工程中的地位下游加工過程的定義 發(fā)酵產(chǎn)品系通過微生物發(fā)酵過程、酶反應(yīng)過程或動植物細胞大量培養(yǎng)獲得。從上述發(fā)酵液、反應(yīng)液或培養(yǎng)液中分離、精制有關(guān)產(chǎn)品的過程稱為下游加工過程(Down stream processing)。它由一些化學(xué)工程的單幾操作組成，但由于生物物質(zhì)的特性，有其特殊要求，而且其中某些單元操作一般化學(xué)工業(yè)中應(yīng)用較少。第2頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四地位傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)(如抗生素、乙醇、檸檬酸)，分離和精制部份占整個工廠投資費用的60%。對重組DNA發(fā)酵、

2、精制蛋白質(zhì)的費用可占整個生產(chǎn)費用的80%90%。第3頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四下游加工過程的特點1、成分復(fù)雜：細胞、代謝產(chǎn)物、殘余培養(yǎng)基2、產(chǎn)品濃度低：傳統(tǒng)發(fā)酵一般1103、失活問題4、不穩(wěn)定性5、純度和生物安全問題6、收率低：50左右第4頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四發(fā)酵工業(yè)下游技術(shù)的一般工藝過程下游加工過程由各種化工單元操作組成。由于生物產(chǎn)品品種多，性質(zhì)各異，故用到的單元操作很多，其中如蒸餾、萃取、結(jié)晶、吸附、蒸發(fā)和干燥等屬傳統(tǒng)的單元操作，理論比較成熟，而另一些則為新近發(fā)展起來的單元操作，如細胞破碎、膜過程和色層分離等，缺乏完整的理論

3、，介于兩者之間的有離子交換過程等。第5頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四一般工藝過程一般說來，下游加工過程可分為4個階段：培養(yǎng)液(發(fā)酵液)的預(yù)處理和固液分離；初步純化(提取)；高度純化(精制)；成品加工。第6頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四工藝過程的劃分：預(yù)處理和固液分離 ：目的是除去發(fā)酵液中的菌體細胞和不溶性固體雜質(zhì)。初步分離 ：目的是除去與產(chǎn)物性質(zhì)差異較大的雜質(zhì)，為后道精制工序創(chuàng)造有利條件 高度純化 ：去除與產(chǎn)物的物理化學(xué)性質(zhì)比較接近的雜質(zhì)。成品制作 ：成品形式由產(chǎn)品的最終用途決定。 第7頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四

4、選擇下游加工工藝的原則：是胞內(nèi)產(chǎn)物還是胞外產(chǎn)物 原料中產(chǎn)物和主要雜質(zhì)濃度 產(chǎn)物和主要雜質(zhì)的物理化學(xué)特性及差異 產(chǎn)品用途和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 產(chǎn)品的市場價格 廢液的處理方法等 第8頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四第一節(jié) 發(fā)酵醪的預(yù)處理和菌體分離目 的（1）改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，促進懸浮液中分離固形物的速度，提高固液分離器的效率（2）盡可能使產(chǎn)物轉(zhuǎn)入便于后處理的某一相中（多數(shù)是液體）（3）去除發(fā)酵液中部分雜質(zhì)，以利于后續(xù)各步操作。第9頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四一、 發(fā)酵液的預(yù)處理采用理化方法設(shè)法增大虛浮液中固體粒子的大小、或降低粘度，以利于過濾。去除會影

5、響后續(xù)提取的高價無機離子。第10頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四發(fā)酵醪預(yù)處理的要求:（1）菌體的分離（2）固體懸浮物的去除（3）蛋白質(zhì)的去除（4）重金屬離子的去除（5）色素、熱原質(zhì)、毒性物質(zhì)等有機雜質(zhì)的去除（6）改變發(fā)酵醪的性質(zhì)（7）調(diào)節(jié)適宜pH值和溫度第11頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四預(yù)處理的方法1，凝聚和絮凝技術(shù)2，雜蛋白質(zhì)的去除3，高價無機離子的去除方法第12頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四（一）凝聚和絮凝技術(shù)凝聚和絮凝能有效改變細胞、菌體和蛋白質(zhì)等膠體粒子的分散狀態(tài)，破壞其穩(wěn)定性，使它們聚集成可分離的絮凝體，再

6、進行分離。常用于細小菌體或細胞（分泌胞外產(chǎn)物）、細胞的（分泌胞內(nèi)產(chǎn)物）碎片以及蛋白質(zhì)等膠體粒子的去除。但是應(yīng)當(dāng)注意，凝聚和絮凝是兩種方法，兩個概念，其具體處理過程也是有差別的。第13頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四1、凝聚作用 凝聚是指在某些電解質(zhì)作用下，破壞細胞、菌體和蛋白質(zhì)等膠體粒子的分散狀態(tài)，使膠體粒子聚集的過程。凝聚劑主要是一些無機類電解質(zhì)，由于大部分被處理的物質(zhì)帶負電荷（如細胞或菌體一般帶負電荷），因此工業(yè)上常用的凝聚劑大多為陽離子型，分為無機鹽類、金屬氧化物類。常用的無機鹽類凝聚劑有：Al2（SO4）318H2O（明礬）、AlCl36H2O、FeCl3、Zn

7、SO4、MgCO3：Al(OH)3、FeSO4、Ca(OH)2或石灰等。 第14頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四2、絮凝作用絮凝是指使用絮凝劑（通常是天然或合成的大分子量聚電解質(zhì)），在懸浮粒子之間產(chǎn)生架橋作用而使膠粒形成粗大的絮凝團的過程。常用的絮凝劑聚丙烯酰胺、聚乙烯亞胺、聚胺衍生物、氯化鈣、磷酸氫二鈉第15頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四第16頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四絮凝技術(shù)預(yù)處理發(fā)酵液的優(yōu)點不僅在于過濾速度的提高，還在于能有效地去除雜蛋白質(zhì)和固體雜質(zhì)，如菌體、細胞和細胞碎片等，提高了濾液質(zhì)量第17頁，共118

8、頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四影響絮凝的因素絮凝劑的添加量發(fā)酵液的pH絮凝劑的分子量攪拌轉(zhuǎn)速攪拌時間第18頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四絮凝劑加量對絮凝效果(濾速)的影響料液中，絮凝劑濃度增加有助于架橋充分，但是過多的加量反而會引起吸附飽和，在每個膠粒上形成覆蓋層而使膠粒產(chǎn)生再次穩(wěn)定現(xiàn)象。第19頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四發(fā)酵液pH對陰離子聚丙烯酰胺絮凝效果的影響溶液pH的變化常會影響離子型絮凝劑中功能團的電離度，從而影響分子鏈的伸展形態(tài)。電離度增大，由于鏈節(jié)上相鄰離子基團間的電排斥作用，而使分子鏈從卷曲狀態(tài)變?yōu)樯煺範(fàn)顟B(tài)，所以

9、架橋能力提高。第20頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四（二）雜蛋白質(zhì)的去除方法1等電點沉淀蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最小，能沉淀而除去。 2變性沉淀 使蛋白質(zhì)變性的方法有：加熱、大幅度改變pH，加有機溶劑（丙酮、乙醇等）、加重金屬離子如Ag 、Cu2 、Pb2 等、加有機酸如三氯乙酸、水楊酸、苦味酸、鞣酸、過氯酸等及表面活性劑。 3. 加各種蛋白質(zhì)沉淀劑 加入某些化學(xué)試劑使蛋白質(zhì)與之形成復(fù)合物沉淀4吸附 在發(fā)酵液中，加入一些反應(yīng)劑，它們互相反應(yīng)生成的沉淀物對蛋白質(zhì)具吸附作用而使其凝固。 預(yù)處理的方法第21頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四3，高價無機離子

10、的去除方法鈣離子，可用草酸。鎂離子，可用三聚磷酸鈉它和鎂離子形成可溶性絡(luò)合物，用磷酸鹽處理，也能大大降低鈣離子和鎂離子的濃度。此法可用于環(huán)絲氨酸的提取。鐵離子，可加入黃血鹽，使形成普魯士藍沉淀。第22頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四二、發(fā)酵液的固液分離微生物發(fā)酵液中含有大量菌體、細胞或細胞碎片以及殘余的固體培養(yǎng)基成分。固液分離是指將發(fā)酵液（或培養(yǎng)液）中的懸浮固體，如細胞、菌體、細胞碎片以及蛋白質(zhì)等的沉淀物或它們的絮凝體分離除去 第23頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四（一）影響過濾速度的因素1、發(fā)酵液中粒子的直徑2、發(fā)酵液黏度培養(yǎng)基的組成未用完培養(yǎng)

11、基的數(shù)量消沫油發(fā)酵周期第24頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四菌種對過濾速度影響真菌的菌絲比較粗大，如青霉菌的菌絲直徑可達10m，發(fā)酵液容易過濾，不需特殊處理。其濾渣呈緊密餅狀物，很容易從濾布上刮下來，故可采用鼓式真空過濾機過濾。放線菌發(fā)酵液菌絲細而分枝，交織成網(wǎng)絡(luò)狀。如鏈霉素發(fā)酵液菌絲僅0.51.0m左右，還含有很多多糖類物質(zhì)，粘性強，過濾較困難，一般需經(jīng)預(yù)處理，以凝固蛋白質(zhì)等膠體。細菌發(fā)酵液的菌體更細小，因此，過濾十分因準(zhǔn)，如不用絮凝等方法預(yù)處理發(fā)酵液，往往難以采用常規(guī)過濾的設(shè)備來完成過濾操作。第25頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四培養(yǎng)基的組成

12、對過濾速度影響用黃豆粉、花生粉作氮源、淀粉作碳源會使過濾困難；發(fā)酵后期加消泡油或剩余大量末用完的培養(yǎng)基也會使過濾困難。第26頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四發(fā)酵周期對過濾的影響正確選擇發(fā)酵終了時間對過濾影響很大。在菌體絲自溶前必須放罐，因為細胞自治后的 分解產(chǎn)物一股很難過濾。有時延長發(fā)酵周期雖能使發(fā)酵單位有所提高，但嚴(yán)重影響發(fā)酵液質(zhì)量，使色素和膠狀雜質(zhì)增多、過濾困難，最終造成成品質(zhì)量降低。第27頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四改善過濾性能的方法等電點蛋白質(zhì)變性吸附凝聚和絮凝加入助濾劑直接在發(fā)酵液中形成填充-凝固劑酶解作用第28頁，共118頁，20

13、22年，5月20日，3點1分，星期四（二）固液分離設(shè)備不同性狀約發(fā)酵液應(yīng)選擇不同的固液分離設(shè)備。常用于發(fā)酵液的分離設(shè)備有：板框壓濾機真空鼓式過濾機離心分離機 第29頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四板框壓濾機優(yōu)點：板框壓濾機的過濾面積大；過濾推動力(壓力差)能較大幅度地進行調(diào)整，并能耐受較高的壓力差；結(jié)構(gòu)簡單，價格低，動力消耗少等優(yōu)點。缺點不能連續(xù)操作，設(shè)備笨重，勞動強度大，衛(wèi)生條件差，非生產(chǎn)的輔助時間長，阻礙了過濾效率的提高。 第30頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四鼓式真空過濾機優(yōu)點能連續(xù)操作，能實現(xiàn)自動化控制缺點壓差較小，主要適用于霉菌發(fā)酵液的

14、過濾。 第31頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四離心分離 優(yōu)點分離速度快，效率高， 操作時衛(wèi)生條件好等優(yōu)點， 適合于大規(guī)模的分離過程。 缺點投資費用高， 能耗較大。 第32頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四三、細胞的破碎與分離微生物的代謝產(chǎn)物有的分泌到細胞或組織之外，例如細菌產(chǎn)生的堿性蛋白酶，霉菌產(chǎn)生的糖化酶等，稱為胞外產(chǎn)物。還有許多是存在于細胞內(nèi)，例如青霉素酰化酶，堿性磷酸酯酶等，稱為胞內(nèi)產(chǎn)物。對于胞外產(chǎn)物只需直接將發(fā)酵液預(yù)處理及過濾，獲得澄清的濾液，作為進一步純化的出發(fā)原液，對于胞內(nèi)產(chǎn)物，則需首先收集菌體進行細胞破碎，使代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)入液相中，然后，

15、再進行細胞碎片的分離。第33頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四第34頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四4，微生物細胞的破碎技術(shù)機械方法高壓勻漿器 珠磨法撞擊破碎法 超聲波破碎 非機械方法 酶解滲透壓沖擊凍結(jié)和融化干燥法化學(xué)法第35頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四高壓勻漿器 采用高壓勻漿器是大規(guī)模破碎細胞的常用方法，利用高壓迫使細胞懸浮液通過針形閥，由于突然減壓和高速沖擊撞擊環(huán)造成細胞破裂高壓勻降的排出閥第36頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四第37頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四珠

16、磨法 研磨是常用的一種方法，它將細胞懸浮液與玻璃小珠、石英砂或氧化鋁一起快速攪拌或研磨，使達到細胞的某種程度破碎。這些裝置的主要缺點是在破碎期間樣品溫度迅速升高，通過用二氧化碳來冷卻容器可得到部分解決。第38頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四超聲波法細胞的破碎是由于超聲波的空穴作用，從而產(chǎn)生一個極為強烈的沖擊波壓力，由它引起的粘滯性旋渦在介質(zhì)中的懸浮細胞上造成了剪切應(yīng)力，促使細胞內(nèi)液體發(fā)生流動，從而使細胞破碎。對于不同菌種的發(fā)酵液、超聲波處理的效果不同，桿菌比球菌易破碎、革蘭氏陰性菌細胞比革蘭氏陽性菌細胞容易破碎，對酵母菌的效果級差。該法不適于大規(guī)模操作，因為放大后，要輸

17、入很高的能量來提供必要的冷卻，這是困難的。 第39頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四撞擊破碎法一種改進的高壓方法是將濃縮的菌體懸浮液冷卻至-25C至-30 C形成冰晶體，利用500 MPa以上的高壓沖擊，冷凍細胞從高壓閥小孔中擠出。細胞破碎是由于冰晶體的磨損，包埋在冰中的微生物的變形所引起的。該法的優(yōu)點是適用的范圍廣，破碎率高，細胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高，該法對冷凍融解敏感的生化物質(zhì)不適用。 第40頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法，將細胞放在高滲透壓的介質(zhì)中(如一定濃度的甘油或蔗糖溶液)，入達到平衡后，介

18、質(zhì)被突然稀釋，或者將細胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，水迅速進入細胞內(nèi)，引起細胞壁的破裂。滲透壓沖擊的方法僅對細胞壁較脆弱的菌，或者細胞壁預(yù)先用酶處理，或合成受抑制而強度減弱時才是合適的。 第41頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四凍結(jié)-融化法將細胞放在低溫下突然冷凍和室溫下融化，反復(fù)多次而達到破壁作用。對于細胞壁較脆弱的菌體，可采用此法。但通常破碎率很低即使反復(fù)循環(huán)多次也不能提高收率。另外，還可能引起對凍融敏感的某些蛋白質(zhì)的變性。第42頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四干燥法可采用空氣干燥，真空干燥，噴霧干燥和冷凍干燥等。空氣干燥主要適用于

19、酵母菌。真空干燥適用于細菌的干燥。冷凍干燥適用于較不穩(wěn)定的生化物質(zhì)。干燥法條件變化較劇烈，容易引起蛋白質(zhì)或其它組織變性。第43頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四 化學(xué)法用酸堿及表面活性劑處理，可以使蛋白質(zhì)水解，細胞溶解或使某些組分從細胞內(nèi)滲漏出來。某些脂溶性溶劑也能作為化學(xué)處理的方法，如丁醇、丙酮、氯仿及尿素等。但是，這些試劑容易引起生化物質(zhì)破壞，還會帶來分離和回收化學(xué)物質(zhì)的問題。 第44頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四 酶解法利用酶反應(yīng)，分解破壞細胞壁上特殊的鍵，從而達到破壁的目的。優(yōu)點：專一性強，發(fā)生酶解的條件溫和。缺點：酶水解費用較貴，一般只

20、適用于小規(guī)模的實驗室研究。溶菌酶是應(yīng)用最多的酶，它能專一地分解細胞壁上糖蛋白分子的-1，4糖苷鍵，使脂多糖解離，經(jīng)溶菌酶處理后的細胞移至低滲溶液中使細胞破裂。第45頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四自溶作用是酶解的另一種方法，所需溶胞的酶是由微生物本身產(chǎn)生的。影響自溶過程的因素有溫度、時間、pH緩沖液濃度、細胞代謝途徑等。自溶法在一定程度上能用于工業(yè)規(guī)模，但是，對不穩(wěn)定的微生物容易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后的細胞培養(yǎng)液過濾速度也會降低。 第46頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四第47頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四破碎方法的

21、選擇選擇合適的破碎方法需要考慮下列因素：細胞的數(shù)量；所需要的產(chǎn)物對破碎條件(溫度、化學(xué)試劑、酶等)的敏感性；要達到的破碎程度及破碎所必要的速度，盡可能采用最溫和的方法；具有大規(guī)模應(yīng)用潛力的生化產(chǎn)品應(yīng)選擇適合于放大的破碎技術(shù)。 第48頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四第二節(jié) 發(fā)酵產(chǎn)物的提取提取的目的是除去與目標(biāo)產(chǎn)物理化性能有很大差異的物質(zhì)，使產(chǎn)物濃縮，并明顯提高產(chǎn)品的純度，常用的方法有沉淀法、樹脂法、吸附法、蒸餾法、萃取法、膜分離技術(shù)和凝膠層析法等等。第49頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四一、沉淀法沉淀法是最古老的分離和純化生物物質(zhì)的方法。由于其濃縮

22、作用常大于純化作用，因而沉淀法通常作為初步分離的一種方法，用于從去除了菌體或細胞碎片的發(fā)酵液中沉淀出生物物質(zhì)，然后再利用色層分離等方法進一步提高其純度。沉淀法由于成本低、收率高(不會使蛋白質(zhì)等大分子失活)、濃縮倍數(shù)高和操作簡單等優(yōu)點，是下游加工過程中應(yīng)用廣泛的值得注意的方法。第50頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四根據(jù)所加入的沉淀劑的不同，沉淀法可以分為：鹽析法；等電點沉淀法；有機溶劑沉淀法；非離子型聚合物沉淀法；聚電解質(zhì)沉淀法；高價金屬離子沉淀法。第51頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四（一）鹽析法在蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽以破壞蛋白質(zhì)的膠體穩(wěn)

23、定性而使其析出，這種方法稱為鹽析。 鹽析法成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備；操作簡單、安全；不會引起蛋白質(zhì)變性，經(jīng)透析去鹽后，能得到保持生物活性的純化蛋白質(zhì)。但是效果不理想，通常只是作為初步的分離純化，還需要結(jié)合其它的純化。第52頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四鹽離子與蛋白質(zhì)分子爭奪水分子，降低了用于溶解蛋白質(zhì)的有效水量，減弱了蛋白質(zhì)的水合程度，破壞了蛋白表面的水化膜，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度下降；鹽離子電荷的中和作用，使蛋白質(zhì)溶解度下降；鹽離子引起原本在蛋白質(zhì)分子周圍有序排列的水分子的極化，使水活度降低。鹽析的機理第53頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四鹽析

24、機理示意圖 第54頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四第55頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四第56頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四2、影響蛋白質(zhì)鹽析效果的主要因素1）鹽析劑的選擇2）鹽析劑的加入量3）溫度和pH4）操作方式第57頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四（二）等電點沉淀法兩性電解質(zhì)分子上的凈電荷為零時溶解度最低，不同的兩性電解質(zhì)具有不同的等電點，以此為基礎(chǔ)進行分離的方法既等電點沉淀法。利用等電點法沉淀蛋白時必須了解制備物對酸堿的穩(wěn)定性，不然盲目使用十分危險。不少蛋白質(zhì)與金屬離子結(jié)合后，等電點會發(fā)生

25、偏移，故溶液中含有金屬離子時，必須注意調(diào)整pH值。等電點法常與鹽析法、有機溶劑沉淀法或其他沉淀方法聯(lián)合使用，以提高其沉淀能力。第58頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四（三）有機溶劑沉淀法利用蛋白質(zhì)在一定濃度的有機溶劑中的溶解度差異而分離的方法，稱有機溶劑沉淀法。有機溶劑能降低溶液的電解常數(shù)，從而增加蛋白質(zhì)分子上不同電荷的引力，導(dǎo)致溶解度的降低；另外，有機溶劑與水的作用，能破壞蛋白質(zhì)的水化膜，導(dǎo)致蛋白質(zhì)相互聚集沉淀析出。 第59頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四有機溶劑沉淀法的優(yōu)缺點該法優(yōu)點在于：分辨能力比鹽析法高，即蛋白質(zhì)或其它溶劑只在一個比較窄的有

26、機溶劑濃度下沉淀；沉淀不用脫鹽，過濾較為容易；在生化制備中應(yīng)用比鹽析法廣泛。其缺點是對具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作要求在低溫下進行?？傮w來說，蛋白質(zhì)和酶的有機溶劑沉淀法不如鹽析法普遍。第60頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四有機溶劑沉淀法的影響因素有機溶劑的選擇首要條件是能和水混溶，使用較多的有機溶劑是乙醇、甲醇、丙酮，還有二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、乙腈和2-甲基-2,4戊二醇等。使用的有機溶劑多為乙醇和丙酮。蛋白質(zhì)和酶的沉淀大多采用乙醇,由于甲醇、丙酮均有一定毒性,故使用時必須謹慎溫度 低溫可保持生物大分子活性，同時降低其溶解度，提高提取效率；樣品濃度和p

27、H 與鹽析法中的作用基本相同；第61頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四二、樹脂法和吸附法樹脂法和吸附法在生化物質(zhì)的提取、濃縮、純化、分離、脫鹽、轉(zhuǎn)化、中和及脫色等操作單元上有著廣泛的應(yīng)用（一）樹脂法原理：利用樹脂與產(chǎn)物結(jié)合，讓產(chǎn)物保留在樹脂上與雜質(zhì)分開，再從樹脂上洗脫產(chǎn)物第62頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四離子交換樹脂法離子交換作用：是指一個溶液中的某一種離子與一個固體中的另一種具有相同電荷的離子互相調(diào)換位置，即溶液中的離子跑到固體上去，把固體上的離子替換下來。這里溶液稱流動相，而固體稱固定相。蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸、酶、抗生素。第63頁，共118

28、頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四該法可以同時分析多種離子化合物，具有靈敏度高，重復(fù)性、選擇性好，分析速度快等優(yōu)點， 第64頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四離子交換樹脂的基本概念離子交換劑通常是一種不溶性高分子化合物，它的分子中含有可解離的基團，這些基因在水溶液中能與溶液中的其它陽離子或陰離子起交換作用。陽離子型 陰離子型第65頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四2、樹脂的選擇及其操作方法要恰當(dāng)?shù)剡x擇離子交換劑，必須對被分離物的性質(zhì)和所處溶液組分及酸堿度等因素進行全面分析 。取決于被分離的物質(zhì)在其穩(wěn)定的pH下所帶的電荷，如果帶正電，則選擇陽

29、離子交換劑；如帶負電，則選擇陰離子交換劑。 一般分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)常用弱酸型或弱堿型離子交換劑。第66頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四基本操作 緩沖液的選擇 層析柱的選擇 洗脫流速加樣 洗脫洗脫液的監(jiān)測收集及組分鑒定 離子交換劑的清洗、再生和保存 離子交換劑的處理 離子交換劑的選擇 第67頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四（二）吸附法在發(fā)酵工業(yè)的下游加工過程中，吸附法應(yīng)用于發(fā)酵產(chǎn)品的除雜、脫色、有毒物質(zhì)和抗生素的提純精制。第68頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四吸附法的原理吸附法是利用吸附劑與雜質(zhì)、色素物質(zhì)、有毒物質(zhì)、產(chǎn)品

30、之間分子引力的差異，從而起到分離的作用。第69頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四吸附的目的將產(chǎn)品吸附濃縮于吸附劑上；將雜質(zhì)、色素等需要從發(fā)酵液中去除的物質(zhì)吸附于吸附劑上。第70頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四吸附法的優(yōu)缺點優(yōu)點：可不用或少用有機溶劑；操作簡便、安全、設(shè)備簡單；生產(chǎn)過程中pH變化小，適用于穩(wěn)定性較差的生化物質(zhì)。缺點：吸附法選擇性差、收率不高。無機吸附劑性能不穩(wěn)定，不能連續(xù)操作，勞動強度大。炭粉等吸附劑影響環(huán)境衛(wèi)生。凝膠類吸附劑、大網(wǎng)格聚合物吸附劑第71頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四吸附的類型物理吸附：吸附劑和

31、吸附物通過分子力(范德華力)產(chǎn)生的吸附?；瘜W(xué)吸附： 化學(xué)吸附是由于吸附劑在吸附物之間的電子轉(zhuǎn)移，發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生的，屬于庫侖力 范圍。交換吸附： 吸附劑表面如為極性分子或離子所組成則它會吸引溶液中帶相反電荷的離子而形成雙電層。這種吸附又稱為極性吸附。第72頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四第73頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四吸附劑的基本要求吸附劑要求顆粒密度小，表面積大，但孔隙也不能太多，否則被吸附物質(zhì)不易被洗脫。吸附劑的顆粒大小要均勻。吸附劑的吸附能力要大，但不能影響洗脫。第74頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四吸附劑的

32、種類有機吸附劑（活性炭）無機吸附劑（硅膠、氧化鋁）第75頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四活性炭 是使用較多的一種非極性吸附劑。層析用的活性炭，最好選用顆?；钭⑻?，若為活性炭細粉，則需加入適量硅藻土作為助濾劑一并裝柱，以免流速太慢?；钚蕴康奈阶饔?，在水溶液中最強，在有機溶劑中則較低弱。故水的洗脫能力最弱，而有機溶劑則較強。例如以醇-水進行洗脫時，則隨乙醇濃度的遞增而洗脫力增加?；钚蕴繉Ψ枷阕寤衔锏奈搅Υ笥谥咀寤衔?，對大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。利用這些吸附性的差別，可將水溶性芳香族物質(zhì)與脂肪族物質(zhì)分開，單糖與多糖分開，氨基酸與多肽分開。目前，多用于在純

33、化過程中進行脫色和脫臭等操作中的簡單吸附過程 第76頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四2. 硅膠 是最常用的吸附劑，通常用SiO2.xH2O表示，是具有硅氧交聯(lián)結(jié)構(gòu)，表面有許多硅醇基的多孔性微粒。硅醇基可與極性化合物或不飽和化合物形成氫鍵而使硅膠具較強的吸附力。 水能與硅膠表面羥基結(jié)合而使其失去活性，經(jīng)加熱可被除去的水稱自由水，若自由水含量達17%以上，則吸附力極低，此時，硅膠只能用于分配層析。若將硅膠在105-110加熱30min ，吸附能力顯著增強，這一過程稱為活化。如果將硅膠加熱到500，硅醇基結(jié)構(gòu)會變成硅氧烷結(jié)構(gòu)，吸附能力顯著下降。 硅膠具有微酸性，適用于分離酸性

34、和中性物質(zhì)，如有機酸、氨基酸、甾體等。 第77頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四3.氧化鋁 分酸性、堿性和中性三種，酸性氧化鋁(pH4-5)適合于分離酸性化合物，堿性氧化鋁(pH9-10)適合于分離堿性化合物，中性氧化鋁(pH7)適合于分生物堿、揮發(fā)油、萜類、甾體及在酸、堿中不穩(wěn)定的甙類、酯類等化合物。 氧化鋁用前也需脫水活化，通常于400高溫下加熱6h，使氧化鋁的含水量在0%-3%之間， 可得到級或級氧化鋁，但溫度過高也會破壞氧化鋁的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。4.大孔吸附樹脂和聚酰胺近年用于中藥活性成分的分離。 第78頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四三、萃取溶劑

35、萃取法是20世紀(jì)40年代興起的一項化工分離技術(shù)，它是用一種溶劑將產(chǎn)物自另一種溶劑(如水)中提取出來，達到濃縮和提純的目的。溶劑萃取法比化學(xué)沉淀法分離程度高，比離子交換法選擇性好，傳質(zhì)快，比蒸餾法能耗低且生產(chǎn)能力大，周期短，便于連續(xù)操作、容易實現(xiàn)自動化等。第79頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四（一）萃取的基本概念1、萃取：利用物質(zhì)在兩種成相的溶劑中溶解度的不同，使所需的目的物質(zhì)從一種溶劑中轉(zhuǎn)移到另一種溶劑中，從而達到分離純化的目的。溶劑萃取法是以分配定律為基礎(chǔ)的。在萃取中，被提取的溶液稱為料液，其中欲提取的物質(zhì)稱為溶質(zhì)。第80頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1

36、分，星期四2、反萃取 蛋白質(zhì)進入反膠團溶液是一協(xié)同過程。在有機溶劑相和水相兩宏觀相界面間的表面活性劑層 ,同鄰近的蛋白質(zhì)分子發(fā)生靜電吸引而變形 ,接著兩界面形成含有蛋白質(zhì)的反膠團 ,然后擴散到有機相中 ,從而實現(xiàn)了蛋白質(zhì)的萃取。改變水相條件 (如pH值、離子種類或離子強度 ) ,又可使蛋白質(zhì)從有機相中返回到水相中 ,實現(xiàn)反萃取過程。 第81頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四3、物理萃取和化學(xué)萃取第82頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四（二）乳化和破乳化乳化：液體分散在另一不相溶的液體中的分散體系乳濁液的形式：水包油、油包水常用的去乳化的方法：過濾和離

37、心、加熱、稀釋法、加電解質(zhì)、吸附法、頂替法、轉(zhuǎn)型法第83頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四（三）常用去乳劑陽離子表面活性劑（溴代十五烷基吡啶） 陰離子表面活性劑（十二烷基硫酸鈉）第84頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四（四）萃取方式混合器溶劑發(fā)酵液分離器提取液殘余液第85頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四多次提煉法混合器溶劑發(fā)酵液分離器提取液混合器溶劑分離器提取液混合器分離器提取液殘余液溶劑殘余液殘余液第86頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四多級對流萃取第一混合器分離器第二混合器分離器第三混合器分離器最后提

38、取液提取液殘余液殘余液最后殘余液提取液溶劑發(fā)酵液一級二級三級A 90%A 70%A 50%第87頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四四、蒸餾分離提取法蒸餾是分離液體混合物的一種有效方法常用的蒸餾方法：簡單蒸餾、精餾和特殊精餾操作方式：間歇式、連續(xù)式壓力：常壓蒸餾、加壓蒸餾、真空蒸餾第88頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四酒精蒸餾選擇蒸餾流程依據(jù)：1）生產(chǎn)原料和成熟醪特性、2）產(chǎn)品質(zhì)量的實際要求3）節(jié)約蒸汽4）節(jié)約用水第89頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四五、凝膠層析常出現(xiàn)多種名稱 ：如凝膠過濾、分子篩層析、排阻層析、凝膠滲透層析

39、等。凝膠層析的定義： 凝膠是一種具有多孔、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的分子篩。利用這種凝膠分子篩對大小、形狀不同的分子進行層析分離，稱凝膠層析 。第90頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四凝膠層析的應(yīng)用范圍： 凝膠層析法適用于分離和提純蛋白質(zhì)、酶、多肽、激素、多糖、核酸類等物質(zhì)。分子大小彼此相差25%的樣品，只要通過單一凝膠床就可以完全將它們分開。利用凝膠的分子篩特性，可對這些物質(zhì)的溶液進行脫鹽、濃縮、去熱源和脫色。凝膠層析的優(yōu)點 凝膠層析具有設(shè)備簡單、操作方便、分離迅速及不影響分子生物學(xué)活性等優(yōu)點。目前已被廣泛應(yīng)用于各種生化產(chǎn)品的分離和純化。第91頁，共118頁，2022年，5月20日，3

40、點1分，星期四凝膠層析的基本原理 凝膠層析的原理 l 分子大小不同混合物上柱； 2 洗脫開始，小分子擴散進人凝膠顆粒內(nèi)，大分子被排阻于顆粒之外；3 大小分子分開： 4大分子行程較短，已洗脫出層析柱，小分子尚在進行中第92頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四 凝膠是一類多孔性高分子聚合物，每個顆粒猶如一個篩子。當(dāng)樣品溶液通過凝膠柱時，相對分子質(zhì)量較大的物質(zhì)由于直徑大于凝膠網(wǎng)孔而只能沿著凝膠顆粒間的孔隙，隨著溶劑流動，因此流程較短，向前移動速度快而首先流出層析柱；反之，相對分子質(zhì)量較小的物質(zhì)由于直徑小于凝膠網(wǎng)孔，可自由地進出凝膠顆粒的網(wǎng)孔，在向下移動過程中，它們從凝膠內(nèi)擴散到膠

41、?？紫逗笤龠M入另 第93頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四一凝膠顆粒，如此不斷地進入與逸出，使流量增長，移動速率慢而最后流出層析柱。而中等大小的分子，它們也能在凝膠顆粒內(nèi)外分布，部分進入顆粒，從而在大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)之間被洗脫。這樣，經(jīng)過層析柱，使混合物中的各物質(zhì)按其分子大小不同而被分離。 Vt=Vo+Vi+Vg Vt=R2h第94頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四 V。簡稱為外水體積，Vo等于被完全排阻的大分子的洗脫體積?？梢杂靡粋€已知相對分子質(zhì)量遠超過凝膠排阻極限的有色分子，如常用的藍色葡聚糖-2000溶液通過柱床，即可測出柱床的外水體積Vo

42、。 Vi簡稱內(nèi)水體積，可由gWr求得（g為干凝膠質(zhì)量，單位為g，Wr為凝膠吸水量，以mLg表示）。Vi也可以從洗脫一種完全不受凝膠微孔排阻的小分子溶質(zhì)（如重鉻酸鉀）的洗脫體積Ve計算，即 VeVoVi第95頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四 層析柱（a）自制簡易層祈柱（1玻璃管；2.橡皮塞；3尼龍網(wǎng)）；（b）普通商品柱；（c）雙底板層析柱（1.洗脫液進出口；2.多孔底板；3柱床；4恒溫水進口；5恒溫水出口；6可調(diào)節(jié)的塞子） 第96頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四 層析系統(tǒng)連接示意圖 1密封橡皮塞；2恒壓管，3，恒壓瓶；4，層析流出液，5可調(diào)蜾旋夾；

43、6.自動收集器； 7.核酸一蛋白質(zhì)檢測儀第97頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四 BS100自動部分收集器安裝圈1反全閥；2換管臂；3滴管；4，5換管臂固定螺絲；6.豎桿；7.豎桿囤定螓絲；8報警板；9.試管；10收集盤；11.時間選揮旋鈕；12.時間選擇固定螺釘；13自動開關(guān)；14、指示燈；15.電源開關(guān)；16換向開關(guān)（逆、順）；17手動開關(guān)第98頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四六、 膜分離過程1748年法國學(xué)者Abbe Nollet首次提出了膜分離現(xiàn)象，經(jīng)過近二個世紀(jì)的摸索、研究，20世紀(jì)50年代膜分離技術(shù)才逐漸發(fā)展成為一門新興高技術(shù)邊緣學(xué)科。

44、 1963年第一個膜滲析器的誕生開創(chuàng)了膜分離技術(shù)的新紀(jì)元，二、三十年來得到了迅猛的發(fā)展，在各個工業(yè)領(lǐng)域及科研中得到大規(guī)模應(yīng)用，出現(xiàn)了各種有價值的微濾、超濾、納濾和反滲透等分離膜 。第99頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四膜分離技術(shù)的優(yōu)點適用范圍廣； 膜分離過程為物理過程，不需加入化學(xué)藥劑； 膜分離技術(shù)分離裝置簡單，占地面積小，系統(tǒng)集成容易 ；膜分離過程系統(tǒng)簡單、操作容易，且易控制，便于維修，有利于生產(chǎn)自動化的推廣與普及。第100頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四一、膜分離方法的分類透析超濾反滲透微濾電滲析液膜技術(shù)氣體滲透滲透蒸發(fā)第101頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四第102頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四第103頁，共118頁，2022年，5月20日，3點1分，星期四（一）膜分離過程