改進的18Ｏ同位素標記法標記蛋白質多肽

1、改良的18同位素標記法標記蛋白質多肽【摘要】針對18同位素標記反響兩個重要影響因素肽段分散度和胰酶滅活方法，進展了標記條件的改良和滅活方法的優(yōu)化。在h218中參加rapigesttsf助溶劑并微波輔助加熱，使-酪蛋白胰酶酶切肽段的標記效率得到明顯改良18/16峰面積比值99%。標記后，對胰酶進展復原烷基化化學修飾徹底滅活，使標記后的肽段穩(wěn)定性顯著進步，放置6d不發(fā)生回交反響。對標準蛋白質甲狀腺球蛋白酶切肽段混合物標記后的質譜實驗結果說明：優(yōu)化的標記方法能快速穩(wěn)定地標記蛋白質酶切多肽?！娟P鍵詞】18同位素標記；多肽；蛋白質組peptidelabelingithiprved18inrpratine

2、thdzhayan，luzhuang，jiaei，yingan-a，qianxia-hng*(statekeylabfprteis，beijingprteeresearhenter，beijing102206(beijinginstitutefradiatinediine，beijing100850)abstratinrdertptiizethe18labelingethd，tkeyaspets，peptidedispersinandtrypsindeativatineredisussed。theadditinfrapigesttsfinh218andiraveheatingenhanedla

3、belingeffiienyf-aseindigestedpeptides(18/16rati99%).heialdifiatinithtris(2-arbxyethyl)phsphine(tep)andidaetaide(iaa)resultedintrypsindeativatedpletely.nsignifiantbak-exhangefr18t16asbservedafterlabelingin6days.theexperientresultithpeptideixturefrshedthattheiprvedethduldbeeffetivelyusedtlabelprteinan

4、dpeptide.keyrds18stableistpelabeling；peptide；prtee1引言定量蛋白質組學通過批量觀察正常與疾病細胞或組織在蛋白質表達譜上的差異，從整體程度上規(guī)?；暨x和開掘與疾病相關的蛋白，為致病機理研究和臨床應用提供重要參考信息。18同位素標記技術是定量蛋白質組的一種常用技術15。蛋白質酶切后的肽段，在胰蛋白酶的催化下，-末端的兩個16原子被交換成18原子，從而使質譜檢測產(chǎn)生4da的質量差異。通過比擬標記肽段和未標記肽段的峰面積強度，得到一對蛋白樣本的相對定量關系。盡管該標記反響具有條件溫和，標記前后肽段的理化性質不發(fā)生改變，能和肽段的其它別離分析方法兼容等優(yōu)

5、點，但卻由于反響條件極難控制，反響后標記產(chǎn)物不穩(wěn)定而影響其在實驗室的廣泛應用。本研究基于18同位素的標記原理，討論了肽段分散度和胰酶滅活兩個重要因素對標記的影響，并據(jù)此對方法進展了優(yōu)化。相比文獻6采用的水浴孵育標記和沸水加熱滅活技術，本方法標記時間短，標記效率強，抑制回交反響。實驗結果顯示，即便對于復雜的多肽混合物體系，采用本方法也能獲得高效的標記結果18/16峰面積比值99%。2實驗局部2.1儀器與試劑4800基質輔助激光解吸電離飛行時間串聯(lián)質譜儀aldi-tf-tfs，美國appliedbisystes公司。-氰基4-羥基肉桂酸(ha)、甲狀腺球蛋白、-酪蛋白美國siga公司)；測序級胰蛋

6、白酶(美國prega公司)；97%h218(上?；ぱ芯克?；三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽tep，siga公司；碘乙酰胺(iaa，美國nejersey公司)；乙腈(j.t.bake公司)；三氟乙酸(tfa，ars公司)；rapigesttsf美國aters公司。其它試劑為國產(chǎn)分析純。2.2蛋白酶切牛甲狀腺球蛋白和-酪蛋白蛋白用20l/lnh4h3溶解后，參加rapigesttsf終濃度0.1%和tep終濃度5l/l，在56復原1h，再參加iaa終濃度25l/l，放置暗處復原1h。參加胰酶-底物150，/的trypsin酶切過夜。2.3蛋白標記和胰酶的滅活將酶切后的肽段溶液冷凍枯燥后直接參加h21

7、8重溶，混勻后放入微波中反響10in。參加tep終濃度100l/l滅活，37水浴孵育1h后，微波反響10in。再參加iaa終濃度100l/l，于暗處放置1h。2.4質譜分析基質采用ha。儀器控制軟件為4800explrersftare，數(shù)據(jù)處理軟件為gpsexplrersftare2.0。一級質譜數(shù)據(jù)采集使用s-1kv反射形式，加速電壓20kv，掃描范圍/z7003500，激光能量4500，每張譜圖累加1500次。馬心肌紅蛋白胰酶酶切肽段作為標準物對儀器進展外標校正，校準至誤差0.1da，相對標準偏向10。3結果與討論3.1增強蛋白質酶切肽段的標記效率蛋白質酶切肽段18標記方法的原理是基于胰蛋

8、白酶催化產(chǎn)生的兩次酶-肽段復合物水解反響。該反響是快速的動態(tài)可逆反響。因此，經(jīng)常發(fā)生標記效率不完全和標記肽段發(fā)生回交的情況，有效地控制標記和回交抑制這兩個環(huán)節(jié)是實驗成功的關鍵7，。本實驗通過改善肽段在反響體系中的分散程度和輔助加熱，增加反響效率來有效地進步標記效率。肽段在體系中的分散程度增高后，有利于肽段端的完全暴露，增加與胰酶和h218的接觸時機。因此，改善肽段分散程度，能推進標記向正反響方向進展。在實驗中，參加rapigesttsf助溶劑，能增強蛋白質及多肽的溶解性，進步分散程度，有利于h218進展末端羧基的交換反響。在-酪蛋白酶切肽段18標記產(chǎn)物質譜分析結果中，因為參加rapigestt

9、sf助溶劑，/z1660，1267和2316的肽段的標記效率明顯進步圖1a和圖1d。而未參加助溶劑組的3個肽段那么標記不完全，仍然存在大量未標記的16肽段圖1。圖1-酪蛋白酶切肽段18標記前后aldi-tf-tf-s質譜圖略fig.1aldi-tf-tf-sspetruftryptidigestedpeptidesf-aseina.未標記的-asein酶切肽段質譜圖(spetrufunlabeledpeptideixture)；b./z1267，1660和2316的肽段標記前質譜圖(spetrufunlabeledpeptidesith/zf1267，1660and2316)；./z1267，

10、1660和2316的肽段未加rapigesttsf，孵育過夜標記后的質譜圖(spetruflabeledpeptidesith/zf1267，1660and2316ithutrapigesttsf，at37fr24h)；d./z1267，1660和2316的肽段參加rapigesttsf，孵育過夜標記后的質譜圖(spetruflabeledpeptidesith/zf1267，1660and2316ithrapigesttsf，at37fr24h)；e.質荷比為1267，1660和2316的肽段參加rapigesttsf，微波加熱10in標記的質譜圖(spetruflabeledpeptide

11、sith/zf1267,1660and2316ithrapigesttsfandiraveheatingfr10in)。常規(guī)方法中，18標記需要在37水浴中孵育24h,以到達充分反響的目的。但即便如此，溫和的反響條件和較長的反響時間也難以保證標記完全。蛋白質酶切加上標記所消耗的時間超過36h，滯后了實驗的進程。并且由于長時間置于水浴環(huán)境，容易因為密封不嚴等情況引入h216，從而導致標記不完全。本實驗采用微波加熱的方式，不僅隔絕了潮濕的環(huán)境，而且只需要10in即可標記完全。質譜結果見圖1d和圖1e。與傳統(tǒng)的水浴加熱方法相比，由于微波使肽段的受熱更為快速和均勻，因此能在很短時間內(nèi)到達理想的標記效果

12、。3.2標記肽段回交的抑制18標記反響的另一個常見問題是標記肽段容易發(fā)生回交。由于該標記反響是一種可逆反響，因此假如將18標記完全的肽段溶于h216中，仍能使18標記肽段回復到16標記狀態(tài)。胰酶是造成回交的主要因素，目前文獻報道抑制回交的方法有酸中止法、超濾胰酶法和微波胰酶滅活法，都不能完全抑制胰酶的活性，置于h216中仍能發(fā)生一定程度的回交7。本研究采用化學滅活法，通過高濃度的復原試劑和烷基化試劑，對溶液中殘留的胰酶徹底滅活。如圖2所示，胰酶滅活后，18標記肽段在液相色譜流動相2%乙腈-98%水-0.5%甲酸中保存6d仍沒有觀察到明顯的回交產(chǎn)物，穩(wěn)定的標記肽段能在液相色譜中進展后續(xù)別離分析。

13、圖218標記后的-酪蛋白酶切肽段在2%乙腈-98%水-含0.5%甲酸溶液中穩(wěn)定性考察略fig.2stabilityflabeled-aseinpeptidesin2%an-98%ater-0.5%friaid(fa)slutina-酪蛋白酶切肽段標記后aldi-tf-tf質譜圖(aldi-tf-tf-sspetruflabeled-asein)；-asein酶切肽段/z1267，1660和2316標記后的aldi-tf-tf質譜圖(afterlabelingaldi-tf-tf-sspetruflabeled-aseinpeptides/z1267，1660and2316):b.0d；.1d；

14、d.3d；e.6d。3.3復雜肽段混合物標記結果牛甲狀腺蛋白分子量為660kda。酶切后aldi-tf-tf質譜能檢測到其中24條肽段。將優(yōu)化后的方法用于該蛋白質酶切肽段的標記，以考察方法在復雜肽段混合物中應用的有效性和耐受性。結果如圖3所示，本方法對于復雜肽段混合物仍能產(chǎn)生令人滿意的標記效率。圖3牛甲狀腺球蛋白酶切肽段18標記效率圖標記效率計算用18標記肽段的單同位素質譜峰面積與16肽段的單同位素峰面積比值略fig.3labelingeffiienyfthyrglbinpeptidesith18(18inrpratineffiienyasalulatedby18/16ratifthefirs

15、tistpipeakarea)小結18標記反響是定量蛋白質組學中應用最為廣泛的同位素標記方法之一。但由于該反響是一種動態(tài)可逆反響，18交換受到多種因素影響，標記效率和抑制回交一直是實驗過程中的棘手問題，目前仍不能穩(wěn)定地在多個實驗室廣泛應用9，。本研究在標記和抑制回交兩個關鍵點上對18標記方法進展了優(yōu)化。通過增強肽段的分散度，改變輔助加熱方式，結合化學方法徹底滅活胰酶，阻斷回交反響的發(fā)生，減少了標記時間，標記效率顯著進步，增強了標記產(chǎn)物的耐用性，滿足差異蛋白質組分析的需要?！緟⒖嘉墨I】1hingse，pauldv，stuartgd，erir.prteis，2022，8:164516602jins，peterg，nathane，atherinef.jprteeres.,2022，6:460146073atherinesl，yuq，rihardb，illiajg，laurenehp.l.ellprteis，2022，6:9539624suisha-hui(隋少卉)，angjing-lan(王京蘭)，jiaei(賈偉)，luzhuang(盧莊)，liujin-feng(劉金鳳)，sngli-na(宋麗娜)，aiyun(蔡耘)，qiaxia-hng(錢小紅).hinesej.anal.he.(分析化學)，2022，36(8):1017102