SIM對(duì)人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2誘導(dǎo)大鼠異位成骨的X射線學(xué)研究

1、SIM對(duì)人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2誘導(dǎo)大鼠異位成骨的X射線學(xué)研究【摘要】目的在重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhbp-2)誘導(dǎo)異位成骨過(guò)程中，部分應(yīng)用不同濃度的辛伐他汀(si)，討論si對(duì)rhbp-2誘導(dǎo)成骨的作用。方法以牛松質(zhì)骨為原料經(jīng)過(guò)脫脂、脫蛋白等步驟制備牛骨基質(zhì)明膠載體,將辛伐他汀和rhbp-2分別與bg載體復(fù)合;將45只雄性sd大鼠隨機(jī)分為3組。a組：高劑量實(shí)驗(yàn)組；b組：低劑量實(shí)驗(yàn)組；組：對(duì)照組;將復(fù)合體植入大鼠股后部肌袋中，術(shù)后15d、30d、60d對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)展大體觀察、x線檢測(cè)。結(jié)果大體觀察：各組組織塊均隨著時(shí)間延長(zhǎng)而變硬，范圍變大;x線結(jié)果，各組植入部位術(shù)后15d、30d未見(jiàn)顯影，于術(shù)

2、后60d各組可見(jiàn)不同密度的影像，b組和組鈣化明顯，成高密度影像；a組成低密度影像。成骨區(qū)灰度值a組明顯低于b組和組。結(jié)論高濃度辛伐他汀可明顯抑制rhbp-2的促進(jìn)成骨作用；低濃度辛伐他汀的抑制作用那么不明顯；證實(shí)了rhbp-2在促進(jìn)成骨方面有重要作用。【關(guān)鍵詞】辛伐他??；重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2；誘導(dǎo)；成骨；x射線放射學(xué)骨缺損的修復(fù)一直是臨床的棘手問(wèn)題。1995年rane1系統(tǒng)提出了骨組織工程的概念、引起了廣闊學(xué)者的關(guān)注。近幾年來(lái)，利用骨組織工程的方法構(gòu)建新生骨組織修復(fù)骨缺損成為研究工作的熱點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)采用sd大鼠股部肌袋模型，以牛bg為載體，旨在部分應(yīng)用rhbp-2促進(jìn)成骨的根底上，結(jié)合應(yīng)用不

3、同濃度的辛伐他汀，來(lái)觀察二者之間的異位誘導(dǎo)成骨效應(yīng)，從而為探究辛伐他汀在成骨方面的作用提供實(shí)驗(yàn)根據(jù)促進(jìn)、抑制或無(wú)作用，是否能作為rhbp-2在促進(jìn)成骨方面具有協(xié)同作用的激活物，亦為進(jìn)一步探究rhbp-2在促進(jìn)成骨方面的機(jī)制奠定基矗1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑雄性sd大鼠45只，體重180200g，動(dòng)物由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。sd大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，骨基質(zhì)明膠，系在遼寧醫(yī)學(xué)院完成。rhbp-2(廣州達(dá)暉生物技術(shù))、辛伐他汀浙江江北藥業(yè)。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1牛bg載體的制備取牛股骨下端松植骨去除骨髓、軟組織和關(guān)節(jié)軟骨，用大量蒸餾水清洗,參照urist2的bg制備方法制備牛松質(zhì)骨bg

4、。凍干消毒保存?zhèn)溆谩?.2.2新伐他汀及rhbp-2與bg載體的復(fù)合將辛伐他汀用100%酒精配置成15%、2.5%的溶液，將載體浸入上述的含一定量辛伐他汀的酒精溶液中，使藥物均勻充分吸附到載體上，熱風(fēng)蒸發(fā)酒精，再在室溫下自然揮發(fā)72h，環(huán)氧乙烷消毒2h備用。按照實(shí)驗(yàn)要求，將rhbp-2用三蒸水溶解后，采用定量真空抽吸法獲得復(fù)合材料：含15%辛伐他汀+rhbp-20.25g+bg,含2.5%辛伐他汀+rhbp-20.25g+bg，含rhbp-20.25g+bg3種復(fù)合物,各取15塊,凍干后環(huán)氧乙烷消毒備用。1.2.3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)將45只雄性sd大鼠隨機(jī)分成3組每組15只，a組：高劑量實(shí)驗(yàn)組含15辛伐

5、他汀+rhbp-20.25g；b組：低劑量實(shí)驗(yàn)組含2.5%辛伐他汀+rhbp-20.25g；組：陽(yáng)性對(duì)照組含rhbp-20.25g。水合氯醛麻醉后,每只大鼠右側(cè)股部去毛。常規(guī)消毒后暴露后股部肌袋。a、b、組動(dòng)物分別植入相應(yīng)載體。仔細(xì)縫合肌肉、皮膚,麻醉清醒后送回籠養(yǎng)。于術(shù)后15d、30d、60d處死動(dòng)物，每組每期5只進(jìn)展實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。1.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)1.3.1大體觀察對(duì)術(shù)后第15、30、60天的sd大鼠進(jìn)展組織塊硬度、范圍及肢體運(yùn)動(dòng)情況的觀察。1.3.2x線觀察術(shù)后第15、30、60天，處死sd大鼠后立即采用speienradigraphysyste(faxitrnx-rayrpratin)進(jìn)展

6、攝片，投照條件為球管電壓30kv，曝光時(shí)間3s，電流強(qiáng)度自動(dòng)，并采用ar2000i系統(tǒng)合成數(shù)碼x線圖像，應(yīng)用ais-1000圖像分析軟件對(duì)成骨區(qū)域灰度值進(jìn)展測(cè)量。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差xs表示。采用spss13.0軟件進(jìn)展多樣本均數(shù)的方差分析。p0.05認(rèn)為差異有顯著性。2結(jié)果2.1大體觀察術(shù)后3組sd大鼠均有死亡，其中a組無(wú)死亡，b組死亡2只術(shù)后2d及6d各一只，組死亡5只術(shù)后第2天二只，第3天一只，第5天一只，第20天一只，均按照相應(yīng)實(shí)驗(yàn)條件予以補(bǔ)充。術(shù)后第15天，各組于股后部植入處均可捫及新僵硬組織；術(shù)后第30天，b組、組新僵硬組織范圍變大，硬度增加，a組那么無(wú)明顯變化

7、；第60天，b組、組組織硬度及范圍進(jìn)一步增加，且組組織硬度大于b組，a組硬度有所增加，但不及b、兩組。2.2x線檢查術(shù)后15d、30d各組大鼠的x線均未見(jiàn)任何影像(圖1a)；術(shù)后60d，b組和組兩組sd大鼠右側(cè)股后部均可見(jiàn)明顯高密度影，鈣化明顯，部分接近sd大鼠下肢皮質(zhì)骨密度。其中組對(duì)照組成骨面積較大，占據(jù)股后部間隙，實(shí)驗(yàn)組b組成骨面積較小，同時(shí)成骨區(qū)灰度值組：195.48.4明顯高于b組：152.89.8(p0.01)。a組15只sd大鼠右側(cè)股部肌袋內(nèi)可見(jiàn)低密度鈣化影，其成骨區(qū)灰度值：46.5810.4，明顯低于b組和組(p0.01)。(圖1b、1、1d)。3討論有研究說(shuō)明他汀類(lèi)藥物還具有免

8、疫抑制作用。普伐他汀可以減少移植區(qū)域非特異性炎癥,預(yù)防早期同基因胰島移植的失敗,與環(huán)孢素合用降低慢性肝移植的排異發(fā)生率3。而在同基因心臟移植模型中,普伐他汀4可以抑制胞外基質(zhì)蛋白的合成及隨之的降解,阻止巨噬細(xì)胞對(duì)移植器官的浸潤(rùn),從而抑制導(dǎo)致同基因心臟移植失敗的主要原因之一進(jìn)展性慢性血管排異反響。他汀類(lèi)藥物對(duì)免疫細(xì)胞有較廣泛的抑制作用,可降低排異反響的發(fā)生率。本實(shí)驗(yàn)當(dāng)中雖沒(méi)有對(duì)免疫方面做過(guò)專(zhuān)門(mén)的研究，但實(shí)驗(yàn)中sd大鼠的死亡情況及數(shù)量不排除免疫反映的可能。實(shí)驗(yàn)中組共死亡5只其中一期死亡4只，二其死亡1只，b組共死亡2只且全部在一期，而只有a組無(wú)一例死亡，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可能對(duì)實(shí)驗(yàn)所用的bg載體及rhb

9、p-2產(chǎn)生了排擠反響，而b組、組隨著辛伐他汀的應(yīng)用，且質(zhì)量濃度的進(jìn)步，可能降低了bg載體及rhbp-2所帶來(lái)的排擠反響，這與以前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合，但還需要進(jìn)一步的論證。xlund等5觀察了辛伐他汀對(duì)骨組織在生物力學(xué)強(qiáng)度上的影響。對(duì)雌性成年大鼠辛伐他汀灌胃3個(gè)月后，用顯微鏡t掃描觀察及材料測(cè)試儀測(cè)試腰椎橫斷面，提示辛伐他汀組松質(zhì)骨量及抗壓強(qiáng)度較對(duì)照組明顯增加，對(duì)皮質(zhì)骨那么影響甚微。說(shuō)明辛伐他汀通過(guò)抑制破骨細(xì)胞活性減少了骨量喪失。他汀類(lèi)藥物不僅可以刺激骨形成，而且對(duì)骨吸收及改建也有影響，它參與調(diào)控骨代謝的整個(gè)過(guò)程，進(jìn)而增加骨生成量、增強(qiáng)骨質(zhì)強(qiáng)度。杜建層等6研究指出，他汀類(lèi)藥物進(jìn)步成骨細(xì)胞bp-2表

10、達(dá)和il-6程度，說(shuō)明對(duì)骨代謝有著促進(jìn)生成和抑制吸收雙重作用?？傊?目前對(duì)于他汀類(lèi)藥物對(duì)成骨作用的影響尚存不同觀點(diǎn)。有的實(shí)驗(yàn)認(rèn)為他汀類(lèi)藥物對(duì)成骨有抑制作用；有的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)認(rèn)為,他汀藥物可以促進(jìn)骨形成,可能影響骨吸收,進(jìn)步骨密度及骨代謝指標(biāo)。因此,體內(nèi)給藥研究他汀類(lèi)藥物對(duì)正?；蚬琴|(zhì)疏松模型動(dòng)物骨代謝影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)論同樣存在分歧,但是部分他汀藥尤其是辛伐他汀和洛伐他汀等對(duì)骨代謝確有一定的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)論的不同或許與動(dòng)物的選擇及給藥劑量、時(shí)間、方式的差異有關(guān)。參考文獻(xiàn)1raneg,lshaugsl,iksag,etal.bnetissueengineening.natureediine,1995,1(1

11、2):1322.2uristr.bnefratinbyautindutin.siene,1965,150:893.3kakkisjl,keb,dasns,etal.pravastatininreasessurvivalandinhibitsnkellenhaneentfatrinlivertransplantatinrats.jsurgres,1997,69(2):393-398.4aggarda,keb,angt,etal.effetsfpravastatinnhrnirejetinfratardiaallgrafts.transplantatin,1998,65(2):149-155.5xlundh,dalstra,andreassentt.