基因定位課件

1、基因組學 Genomics第四章 基因定位10/13/20221.基因組學 Genomics 4 基因定位4.1 基因的鑒定 4.2 主基因定位 4.3 QTL定位4.4 分子標記輔助選擇 10/13/20222.基因組學 Genomics4 Mapping of genes4.1 基因的鑒定 基因定位（ Mapping of genes ）是指通過遺傳作圖的方法，確定基因與遺傳標記之間的關系。 基因定位的前提，是要準確地鑒定基因。10/13/20223.基因組學 Genomics4.1 基因的鑒定 4.1.1 基因的概念 基因的廣義概念： 基因是具有某種功能的DNA片段，包括結構基因和調控基

2、因，即包括能轉錄和不能轉錄的具有某種功能的DNA序列，其含義非常廣泛。 10/13/20224.基因組學 Genomics4.1 基因的鑒定 4.1.1 基因的概念 分子遺傳學的概念： 基因是DNA的一個轉錄單位。轉錄產(chǎn)物RNA通過反轉錄可以合成cDNA，因此通常認為一個cDNA相當于一個基因。但是，目前大多數(shù)cDNA的功能尚不知道，因此這種基因是通過轉錄來識別的。 DNARNA轉錄10/13/20225.基因組學 Genomics4.1 基因的鑒定 4.1.1 基因的概念 孟德爾遺傳學的概念： 基因是控制某一性狀的遺傳因子?；蚴峭ㄟ^表現(xiàn)型來識別的，即表現(xiàn)型是基因型控制的，通過表現(xiàn)型可以分析

3、基因型。10/13/20226.基因組學 Genomics4.1 基因的鑒定 4.1.1 基因的概念 主效基因和微效基因： 從孟德爾遺傳學的基因概念來看，基因型是通過表現(xiàn)型來認識的，根據(jù)基因對表現(xiàn)型影響的大小，通常把基因劃分為主效基因（major gene）和微效基因（minor gene） 。10/13/20227.基因組學 Genomics4.1 基因的鑒定 4.1.1 基因的概念 主效基因: 又稱主基因，是一類控制質量性狀的基因，其性狀表現(xiàn)為不連續(xù)的變異。微效基因: 是一類控制數(shù)量性狀的基因，因此通常稱為數(shù)量性狀座位（quantitative trait locus，QTL），其性狀表現(xiàn)

4、為連續(xù)的變異。 10/13/20228.基因組學 Genomics4.1 基因的鑒定 4.1.1 基因的概念 基因座位與等位基因： 基因座位（locus）：基因在遺傳圖上的位置。 等位基因（allele）：在相同的基因座上，兩種或多種變異基因之一。 由兩個以上等位基因組成的一組等位基因稱為復等位基因（multiple alleles）。A B CA1 B1 C1A2 B2 C210/13/20229.基因組學 Genomics4.1 基因的鑒定 4.1.2 遺傳分析 判斷某一性狀是否由主基因控制和受多少對基因控制，首先需要對該性狀作遺傳分析。遺傳分析的基本方法是： （1）選擇具有相對性狀的兩個

5、親本雜交； （2）在F1中觀察該性狀屬于完全顯性，還是不完全顯性； （3）在F2中分析分離群體中相對性狀的分離。 10/13/202210.基因組學 Genomics4.1 基因的鑒定 4.1.3 等位性測定 由于有些基因已經(jīng)定位，因此在基因定位之前，需要做基因的等位性（allelism）測定，以明確要定位的基因尚沒有定位?；虻牡任恍詼y定的基本方法是： （1）查閱有關文獻，了解該性狀目前的研究情況，包括該性狀已發(fā)現(xiàn)多少個基因，哪些基因已定位等。 （2）如果不知道要定位的基因與已定位的基因之間的關系，但它們的表現(xiàn)型相同，則存在它們是同一個基因的可能性，需要確定它們之間的關系。 10/13/20

6、2211.基因組學 Genomics4 Mapping of genes4.2 主基因定位 基因定位通常指的是主基因的定位。而微效基因的定位通常用專有名詞QTL定位。10/13/202212.基因組學 Genomics4.2 主基因定位 4.2.1 基因定位的原理 無論是遺傳標記還是基因，都在染色體上占有它們的座位，而這些座位都是DNA的一個片段，因此從座位上看，它們并沒有什么區(qū)別。通過遺傳圖譜的構建，很多分子標記在染色體上的位置已經(jīng)確定，因此只要確定基因與分子標記之間的連鎖關系，就可以確定基因在染色體上的位置。10/13/202213.基因組學 Genomics4.2 主基因定位 4.2.1

7、 基因定位的原理 分子標記是通過它們產(chǎn)生的帶型來識別的，而基因是通過它們產(chǎn)生的表現(xiàn)型來識別的。因此與前面講述的遺傳作圖不同，基因定位既要分析分子標記的帶型，又要分析基因型產(chǎn)生的表現(xiàn)型。基因定位的基本原理是通過分析分子標記與表現(xiàn)型之間的連鎖關系，確定基因在遺傳圖譜中的位置。Zhang et al. 1996, TAG10/13/202214.基因組學 Genomics4.2 主基因定位 4.2.2 表型分析 作圖群體的發(fā)展： 作圖群體是基因定位中不可缺少的試驗材料。作圖群體的基本要求是： （1）雙親具有相對性狀的差異； （2）雙親應具有較高程度的多態(tài)性，以便找到緊密連鎖的分子標記； （3）作圖群

8、體的大小應符合要求； （4）作圖群體中相對性狀的分離應符合孟德爾規(guī)律。 10/13/202215.基因組學 Genomics4.2 主基因定位 4.2.2 表型分析 表型測定： 在基因定位中，目的基因的基因型是通過它的表現(xiàn)型來確定的，因此表現(xiàn)型測定是決定基因定位質量的關鍵。表型測定要求： （1）由于作圖群體較大，表型分析通常在自然條件下進行，必須使作圖群體生長正常，并且應減少個體間的試驗誤差； （2）應以雙親和F1為對照，并統(tǒng)一標準； （3）表型測量要準確。表型在測量和辨別過程中通常容易出現(xiàn)誤差，必須統(tǒng)一測量標準，并由熟練的人員操作； （4）必須采取基因專一性的檢測方法，如特定的菌種、花粉育性

9、等。 10/13/202216.基因組學 Genomics4.2 主基因定位 4.2.2 表型分析 表型數(shù)據(jù)的整理： 原始的表現(xiàn)型數(shù)據(jù)都是通過一定的測量方法獲得的，具有特定的單位，如長度、重量、百分比等。由于質量性狀的特點，作圖群體一般表現(xiàn)為不連續(xù)的分布，因此可以將作圖群體分成若干個組。為了滿足作圖軟件的需要，分別用不同的數(shù)字代表不同組的表現(xiàn)型，并與標記基因型的數(shù)值相一致。 10/13/202217.基因組學 Genomics4.2 主基因定位 4.2.2 表型分析 表現(xiàn)型數(shù)字化轉換的規(guī)定是： 1-親本1的純合基因型（aa） 2-雜合體（ab） 3-親本2的純合基因型（bb）對于顯性帶型而言：

10、 4-非親本1純合基因型（ab或bb），即親本2的表現(xiàn)型為顯性； 5-非親本2純合基因型（ab或aa），即親本1的表現(xiàn)型為顯性； 0-缺資料10/13/202218.基因組學 Genomics4.2 主基因定位 4.2.3 分子標記的分析 已定位標記的利用： 通過遺傳圖譜的構建，很多分子標記在染色體上的位置已經(jīng)確定，因此只要找到與基因連鎖的分子標記，就可以確定基因在染色體上的位置。這類標記有RFLP標記和SSR標記等。 已定位標記的利用，通常是從現(xiàn)有的遺傳圖譜中，按一定距離均勻選取分子標記。 1）親本多態(tài)性的分析，篩選出具有多態(tài)性的分子標記； 2）作圖群體的標記基因型分析，找到與目的基因連鎖的

11、分子標記。 10/13/202219.基因組學 Genomics4.2 主基因定位 4.2.3 分子標記的分析 未定位標記的利用： 有些分子標記是隨機標記，如RAPD和AFLP標記等， 這類標記通常沒有確定在染色體上的位置，因此每次使用都是隨機的。利用隨機標記只能以隨機的方式，從大量的標記中篩選出與目的基因連鎖的分子標記。 10/13/202220.基因組學 Genomics4.2 主基因定位 4.2.3 分子標記的分析 混合池分析： 混合池（bulk）分析是快速篩選出與目的基因連鎖的分子標記的一種方法。這是Michelmore RW, etal. （1991）首創(chuàng)的。無論是已定位標記還是未定

12、位標記，都要利用作圖群體才能確定它們與目的基因的連鎖關系，而作圖群體通常都比較大，因此篩選與目的基因連鎖的分子標記的工作量非常大。利用混合分析，可以大大地減少這方面的工作量。 10/13/202221.基因組學 Genomics4.2 主基因定位 4.2.3 分子標記的分析 混合池的組成： “混合池”由作圖群體中具有相同相對性狀個體的DNA組成。在作圖群體中，通常選擇具有同一相對性狀的10-20個體的DNA組成一個混合池。這樣，在一個作圖群體中，兩個相對性狀各自組成一個混合池。理論上，兩個不同相對性狀的混合池除了目的基因的基因型不同外，其余基因型是相同的。因此有些人把相對性狀的兩個混合池稱為“

13、近等基因池” 。組成混合池的個體，應具有典型的表型。 10/13/202222.基因組學 GenomicsR/Rr/rRrP:F2:F1:Rr10/13/202223.基因組學 Genomics4.2 主基因定位 4.2.3 分子標記的分析 混合池的利用： 在實際利用中，兩個混合池通常與兩個親本一起做分子標記的分析。當兩個親本的帶型有差異，而兩個混合池的帶型無差異時，表明該標記與目的基因不連鎖；當兩個親本的帶型有差異，而兩個混合池的帶型也有相應的差異時，表明該標記與目的基因可能存在連鎖關系。 通過混合池的利用篩選出可能與目的基因存在連鎖關系的標記后，還要利用整個作圖群體做連鎖分析，才能確定它們

14、之間的連鎖關系。 10/13/202224.基因組學 GenomicsRr P1 P2 R S P1 P2 R S分子標記與基因無連鎖分子標記與基因連鎖or10/13/202225.基因組學 Genomics4.2 主基因定位 4.2.3 分子標記的分析 近等基因系的利用：近等基因系的建立：近等基因系的建立通常采用連續(xù)回交的方法進行。選擇具有相對性狀差異的兩個親本雜交，然后用帶有隱性性狀的親本作輪回親本回交。在每一分離世代對目的基因加以選擇，經(jīng)過回交7-8代以上，才能選育成近等基因系。近等基因系除目的性狀外，其它性狀應與輪回親本相似。 10/13/202226.基因組學 Genomics4.2

15、 主基因定位 4.2.3 分子標記的分析 近等基因系在基因定位中的利用： 由于近等基因系除目的基因外，其遺傳背景與輪回親本相似，利用近等基因系作基因定位確實是理想的材料。近等基因系通常用作親本之一，用于發(fā)展作圖群體。 1）近等基因系的表現(xiàn)型不受復雜的遺傳背景的干擾，其表現(xiàn)比較真實，能較真實地反映基因效應的大小。 2）利用近等基因系和輪回親本一起做分子標記分析，一旦篩選出多態(tài)性的分子標記，該標記就很可能與目的基因連鎖，從而減少連鎖標記篩選的工作量。 10/13/202227.基因組學 GenomicsNILChr. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12水稻近等基因系的導入片段分析

16、10/13/202228.基因組學 Genomics4.2 主基因定位 4.2.4 遺傳作圖 篩選出與目的基因連鎖的分子標記后，表明目的基因與該標記連鎖。如果所用的分子標記已定位，則基因所在的位置也已知道。如果所用的分子標記尚未定位，則基因所在的位置還不知道。在這種情況下，需要對連鎖的分子標記定位。 10/13/202229.基因組學 Genomics4.2 主基因定位 4.2.4 遺傳作圖 連鎖分析： 基因定位的基本方法是確定表現(xiàn)型與已定位標記之間的連鎖關系。把表現(xiàn)型和標記基因型都按統(tǒng)一的規(guī)定轉換為數(shù)值，并把它們整合在一個數(shù)據(jù)庫中，通過Mapmarker軟件，可以分析它們之間的連鎖關系 10

17、/13/202230.基因組學 Genomics 水稻抗白葉枯病基因xa-13的定位資料10/13/202231.基因組學 Genomics4.2 主基因定位 4.2.4 遺傳作圖 隨機標記的定位： 隨機標記定位的策略是利用己知標記來定位未知標記。利用己知標記來定位未知標記的最佳方案是利用永久性作圖群體。分析隨機標記在永久性作圖群體中的分離，并將數(shù)據(jù)加到永久性作圖群體作圖時已建立的數(shù)據(jù)庫，再做遺傳作圖，就可以確定隨機標記在遺傳圖譜中的位置。因此，永久性作圖群體是隨機標記定位的重要工具。 10/13/202232.基因組學 Genomics水稻DH群體構建的遺傳圖譜10/13/202233.基因

18、組學 Genomics4.2 主基因定位 4.2.4 遺傳作圖 精細定位 （fine mapping）： 在基因定位中，找到已定位的分子標記，只是完成了基因的粗定位，即只知道基因的大概位置，這對于基因定位來說是不完善的?；蚓毝ㄎ?，就是在基因粗定位的基礎上，進一步完善基因定位的工作?；蚓毝ㄎ坏哪繕?，對于不同的目的有不同的要求。 精細定位是基因圖位克隆的基礎。10/13/202234.基因組學 Genomics4.2 主基因定位 4.2.4 遺傳作圖 The linkage map (a), physical map (b) and ORF prediction (c) of locus

19、S-b on rice chromosome 5 李文濤等，2006，科學通報10/13/202235.基因組學 Genomics4 Mapping of genes4.3 QTL定位 QTL（quantitative trait locus）稱為數(shù)量性狀基因座位。由于這類基因控制數(shù)量性狀，并且表現(xiàn)為微小效應，因此難以用主基因定位的方法來定位。隨著分子標記技術的不斷發(fā)展，QTL定位的方法也日趨成熟。10/13/202236.基因組學 Genomics4.3 QTL定位 4.3.1 概況 生物性狀的形成取決于兩方面的因素，一是親本的基因型，一是環(huán)境條件的影響。因此，表現(xiàn)型是基因型和環(huán)境條件共同作

20、用的結果。 P = G + E 其中，P表示表現(xiàn)型值，G表示基因型值，E表示環(huán)境條件引起的變異。 相對來說，數(shù)量性狀的表現(xiàn)型值中，由環(huán)境條件引起的變異更大。 10/13/202237.基因組學 Genomics4.3 QTL定位 4.3.1 概況 在傳統(tǒng)的遺傳分析中，通常是分析數(shù)量性狀的表現(xiàn)型值中，基因型值所占的比率，以便評價數(shù)量性狀遺傳力的大小，或者是通過雙列分析等方法，估計控制數(shù)量性狀的基因對數(shù)，但難以確定控制數(shù)量性狀的基因所在染色體上的位置。 分子標記的出現(xiàn)，為QTL定位提供了有力的手段。 10/13/202238.基因組學 Genomics4.3 QTL定位 4.3.2 基本方法 按采

21、用的標記數(shù)目分類: 單標記法 相鄰雙標記法 多標記法 10/13/202239.基因組學 Genomics4.3 QTL定位 4.3.2 基本方法 按使用的統(tǒng)計方法分類: 方差分析法 回歸分析法 最大似然分析法 10/13/202240.基因組學 Genomics4.3 QTL定位 4.3.2 基本方法 按作圖所用區(qū)間數(shù)分類: 零區(qū)間作圖法 單區(qū)間作圖法 多區(qū)間作圖法 10/13/202241.基因組學 Genomics4.3 QTL定位 4.3.3 單標記方差分析法 單標記方差分析法（single marker ANOVA（analysis of variance）是Thoday （1961

22、）提出的。 10/13/202242.基因組學 Genomics4.3 QTL定位 4.3.3 單標記方差分析法 基本假定: 基因型分別為M1M1Q1Q1和M2M2Q2Q2的兩親本雜交，F(xiàn)1的基因型為M1M2Q1Q2，F(xiàn)1產(chǎn)生4種配子M1Q1、M1Q2、M2Q1、M2Q2。其中，M1Q1和M2Q2的配子為親本型，其頻率為1/2（1-r）；M1Q2和M2Q1的配子為重組型，其頻率為1/2（r）。 10/13/202243.基因組學 Genomics4.3 QTL定位 4.3.3 單標記方差分析法 M1Q1 M2Q2 M1Q2M2Q1 (1-r) (1-r) (r) (r) M1Q1 (1-r)2

23、 (1-r)2 r(1-r)r(1-r) (1-r) M2Q2 (1-r)2 (1-r)2 r(1-r)r(1-r) (1-r) M1Q2r(1-r) r(1-r) r2 r2 (r) M2Q1r(1-r) r(1-r) r2 r2 (r) M1 Q1 M2 Q2 M1 Q1 M2 Q2 M1 Q1 M2 Q210/13/202244.基因組學 Genomics作圖群體的基因型頻率（pij） : jQ1Q1 Q1Q2 Q2Q2 Mean i M1M1 （1-r）2 2r（1-r） r2 m1 M1M2r（1-r） r2+（1-r）2 r（1-r） m2 M2M2r2 2r（1-r） （1-r）

24、2 m3 M1Q1 M2Q2 M1Q2M2Q1 (1-r) (1-r) (r) (r) M1Q1 (1-r)2 (1-r)2 r(1-r)r(1-r) (1-r) M2Q2 (1-r)2 (1-r)2 r(1-r)r(1-r) (1-r) M1Q2r(1-r) r(1-r) r2 r2 (r) M2Q1r(1-r) r(1-r) r2 r2 (r)10/13/202245.基因組學 Genomics基因型的效應值（gj） : 效應值： -d 0 h d 基因型： Q2Q2（P2） 1/2（P1+P2） Q1Q2 Q1Q1（P1） 10/13/202246.基因組學 Genomics4.3 QT

25、L定位 4.3.3 單標記方差分析法 平均數(shù)的估算:平均數(shù)按以下公式計算： mi = pijgj 式中，pij為基因型頻率，gj為基因型效應值。 10/13/202247.基因組學 Genomics按該公式計算，F(xiàn)2群體中分子標記座位上各種基因型的平均數(shù)為： m1 = (1-r)2d + 2r(1-r)h + r2(-d) = (1-2r)d + 2r(1-r)h m2 = r(1-r)d + r2 + (1-r)2h + r(1-r) (-d) = r2 + (1-r)2h m3 = r2d + 2r(1-r)h + (1-r)2(-d) = -(1-2r)d + 2r(1-r)h假定: d

26、 h dh 0當r=0.5，即M與Q不連鎖時， m1 = 1/2h m2 = 1/2hm3 = 1/2h即，mi = mk。mk為某一分子標記基因型效應值的平均數(shù)。 反過來，如果mi = mk，則r = 0.5，即表明M與Q不存在連鎖關系；如果mi mk，則r 0.5，即表明M與Q存在連鎖關系。 10/13/202248.基因組學 Genomics標記與性狀關聯(lián)的檢測 :4.3 QTL定位 4.3.3 單標記方差分析法 資料的整理： 標記基因型 株號M1M1M1M2M2M2 1 2 3 株數(shù)（ni） n1 n2 n3 表型值（mi） m1 m2 m310/13/202249.基因組學 Geno

27、mics 不同基因型的均值（mi）之間的差異來源于：（1）基因型的效應；（2）環(huán)境的影響。因此，需要對這些資料作組內觀察值不等的單因素的方差分析。 變異來源DF SS MS F 標記基因型間k-1 SSt MStMSt/MSe 試驗誤差（ni-1） SSe MSe 總計ni-1 SST 當FF0.05時，平均數(shù)間的差異顯著，即mi mk，表明M與Q存在連鎖關系。當FF0.05時，平均數(shù)間的差異不顯著，即mi=mk，表明M與Q不存在連鎖關系。10/13/202250.基因組學 Genomics4.3 QTL定位 4.3.3 單標記方差分析法 重組率及遺傳參數(shù)的估計 :根據(jù)上述的假定，親本和F2的

28、QTL基因型的效應值分別為： Q1Q1=d（P1）Q2Q2=-d（P2）m1 = (1-2r)d + 2r(1-r)hm2 = r2 + (1-r)2hm3 = -(1-2r)d + 2r(1-r)h建立聯(lián)立方程：P1 P2 = 2d（1） m1 m3 = 2（1-2r）d （2） 10/13/202251.基因組學 Genomics P1 P2 = 2d（1） m1 m3 = 2（1-2r）d （2） m1 m3 L = = 1-2r P1 P2式中，L定義為m1m3與P1P2的比值。 1 m1m3 2 VL = Vm1-m3 + VP1-P2 （P1-P2）2 （P1-P2）210/13/

29、202252.基因組學 Genomics重組率的估算 :根據(jù)上述公式m1 m3 L = = 1-2r P1 P2得到:r = 1/2（1-L）r為重組率的估計值； Vr = 1/4 VL Vr為重組率估計值的方差 。10/13/202253.基因組學 Genomics加性效應值的估算 :根據(jù)（2）式 m1 m3 = 2（1-2r）d ： m1 m3d = 2（1-2r）d為基因加性效應的估計值； 1Vd = Vm1-m3 4（1-2r）2Vd為基因加性效應估計值的方差。10/13/202254.基因組學 Genomics顯性效應值的估算: m2-1/2（m1-m3） h = （1-2r）2h為

30、顯性效應的估計值; 1 Vh = Vm2 - 1/2 m1 - 1/2 m3 （1-2r）4Vh為顯性效應估計值的方差。10/13/202255.基因組學 Genomics4.3 QTL定位 4.3.4 QTL定位的新策略 QTL分析的發(fā)展方向： 把復雜性狀變?yōu)楹唵涡誀睿?把多基因分解為單基因（單一孟德爾因子）； 把數(shù)量性狀變成質量性狀。Q1 Q2 Q310/13/202256.基因組學 Genomics4.3 QTL定位 4.3.4 QTL定位的新策略 利用永久性作圖群體作QTL分析的優(yōu)勢在于： （1）以品系為分離單元，使數(shù)量性狀的測量比較準確。 （2）可以在試驗中設置重復，以減少試驗誤差。

31、 （3）可以進行多點試驗，以評價基因與環(huán)境的互作關系。 永久性作圖群體的利用 10/13/202257.基因組學 Genomics4.3 QTL定位 4.3.4 QTL定位的新策略 AB-QTL（advanced backcross QTL）分析，即高世代回交QTL分析，是把QTL分析的世代推遲到BC2或BC3的一種QTL分析方法。這種方法能更好地鑒定和利用QTL，特別適用于從野生型等非優(yōu)良材料中鑒定優(yōu)良的QTL，并轉移到優(yōu)良的育種品系中。 AB-QTL分析AB-QTL10/13/202258.基因組學 Genomics4.3 QTL定位 4.3.4 QTL定位的新策略 AB-QTL分析的優(yōu)點

32、是： （1）與低世代群體，或稱平衡群體（F2、BC1等）相比，AB群體中個體的基因型（及表現(xiàn)型）與優(yōu)良的親本（輪回親本）更加相似，使產(chǎn)量等數(shù)量性狀的測量更加準確。 （2）在遠緣雜交的低世代群體中，通常會出現(xiàn)一些不良的性狀（如不育性、落粒等），因此影響了對數(shù)量性狀的測量。在AB群體的發(fā)展過程中，逐步淘汰一些來自供體的不良性狀， 使AB群體的數(shù)量性狀表現(xiàn)更加正常。 （3）由于AB群體中，供體的基因頻率較低，因此供體基因型之間的相互作用（上位性作用）較小，因此供體中的QTL轉移到受體后，其效應值變化不大。 （4）再增加回交次數(shù)，可以較容易地獲得近等基因系，即QTL-NIL。這些QTL-NIL可以進行

33、重復的田間試驗。 （5）由于多次回交，在減數(shù)分裂過程中有更多的機會發(fā)生重組，因此QTL與不良基因之間的連鎖關系容易打破，可以更好地利用QTL。 10/13/202259.基因組學 Genomics4.3 QTL定位 4.3.4 QTL定位的新策略 次級作圖群體是利用近等基因系（near-isogenic line，NIL）、導入系（introgression line，IL）、染色體片段代換系（chromosomal segment subsititution line，CSSL）等次級品系發(fā)展的次級作圖群體。次級作圖群體在QTL分析中得到廣泛的利用，通常稱為 QTL-NIL、IL-QTL等。

34、 次級作圖群體的利用10/13/202260.基因組學 Genomics初級作圖群體非永久性次級作圖群體永久性作圖群體F2、BC1等DH、RI等非單片段單片段SSSLNIL、CSSL等4.3 QTL定位 4.3.4 QTL定位的新策略 10/13/202261.基因組學 Genomics4.3 QTL定位 4.3.4 QTL定位的新策略 （1）具有永久性群體的特點，可以反復使用，排除了環(huán)境的影響。 （2）由于每個品系與輪回親本的遺傳背景十分相似，排除了遺傳背景的干擾，因此QTL表型分析的結果較準確。 （3）由于每個品系只帶有來自供體親本的很小部分，通常只有一個或少數(shù)幾個片段，可以把控制同一數(shù)量

35、性狀的多個QTL進行分解，即把多基因分解為單一的孟德爾因子，使復雜性狀簡單化，因此大大地提高了QTL分析的準確度和可靠性。 利用次級作圖群體的優(yōu)勢：10/13/202262.基因組學 Genomics4 Mapping of genes4.4 分子標記輔助選擇 基因定位的目的是為了更好地利用基因。分子標記輔助選擇(Marker-assisted selection，MAS)就是利用與基因緊密連鎖的分子標記，對目的基因進行輔助選擇，從而實現(xiàn)對基因的有效利用。10/13/202263.基因組學 Genomics4.4 分子標記輔助選擇 4.4.1 基本的原理和條件 分子標記輔助選擇(Marker-

36、assisted selection，MAS)就是利用與基因緊密連鎖的分子標記，輔助選擇目的基因的基因型。 在分子標記輔助選擇中，直接選擇的是分子標記的基因型，而不是目的基因的基因型，因此利用分子標記選擇目的基因的基因型，只是起輔助選擇的作用。當分子標記與目的基因緊密連鎖時，通過選擇分子標記的基因型，可以有效地選擇到目的基因的基因型。但當分子標記與目的基因之間的距離較遠時，通過分子標記的基因型選擇目的基因的基因型的效果就變得較差。分子標記輔助選擇的效果取決于連鎖的緊密程度。 標記與基因的關系10/13/202264.基因組學 Genomics水稻特異親和基因S-c的分子標記輔助選擇10/13/

37、202265.基因組學 Genomics4.4 分子標記輔助選擇 4.4.1 基本的原理和條件 為了提高分子標記輔助選擇的準確率，不但要選擇與目的基因緊密連鎖的分子標記，而且還要利用目的基因兩側的分子標記。假如某一分子標記與目的基因的距離為5cM，側該標記與基因之間的重組率約為5%，意味著利用該標記選擇目的基因的誤差率約為5%。如果某基因兩側各有一個分子標記，其距離均為5cM，側兩標記與目的基因之間同時發(fā)生交換的頻率為: 5 % x 5% = 0.025 % 考慮到交換之間的干擾，利用這兩個標記選擇基因的誤差率應少于0.025%。這樣的誤差率是符合育種要求的。 10/13/202266.基因組

38、學 Genomics抗 感 雜 雜 雜 感 雜 抗 感 雜 抗 雜 雜 抗 感分離群體分子標記輔助選擇抗性鑒定結果10/13/202267.基因組學 Genomics4.4 分子標記輔助選擇 4.4.1 基本的原理和條件 分子標記主要有兩類，即RFLP標記和以PCR為基礎的分子標記。過去用得較多的是RFLP標記，但RFLP標記在技術上比較復雜，在育種中難以利用。以PCR為基礎的分子標記，如STS和SSR等，主要利用的是PCR技術，具有方法簡單、時間短、費用少的優(yōu)點，適合育種上的要求。因此，建立以PCR為基礎的分子標記輔助選擇的技術體系，將使分子標記輔助選擇技術得到切實可行的利用。 MAS在育種

39、上利用的基本條件10/13/202268.基因組學 Genomics4.4 分子標記輔助選擇 4.4.2 以PCR為基礎的MAS 目前已經(jīng)定位的基因主要是利用RFLP標記進行的，許多基因雖然已經(jīng)定位，但卻難以在育種中利用。為了使這些基因在育種中得到利用，首先需要把RFLP標記轉變?yōu)镻CR標記。 RFLP標記轉變?yōu)镻CR標記10/13/202269.基因組學 Genomics4.4 分子標記輔助選擇 4.4.2 以PCR為基礎的MAS 把RFLP標記轉變?yōu)橐訮CR為基礎的分子標記，就是把RFLP標記轉變?yōu)樾蛄袠撕炍稽c(Sequence tagged site，STS)標記。這個過程包括： （1）

40、對RFLP標記（長度約為0.5-2.5kb）進行末端測序，測序的末端長度通常為100bp-300bp。 （2）利用測序的末端序列設計PCR引物，PCR引物設計的原則與前述的相同。 （3）利用上述設計的PCR引物進行PCR擴增，擴增的產(chǎn)物即為STS標記。STS標記與原RFLP標記具有相同的座位，其片段長度比RFLP標記的長度略短。 STS 標記10/13/202270.基因組學 Genomics Forward primer5 GTCGACC TGCAGGTTTA GTCTAGACTC TAGAGGGACGTGCCATCTCT CGAGAGCGTG TGTGTGATGA AATGTTGCTTTT

41、TGGATCTT GCTGGCTTGA TTTGGGCCTT AATCTAATGAAAAATCATCG GTTTCTTCTC TGATCGTTTT AATTTCAGGATAAGATAATG TGTGGTTTTT GTAG (600bp) TGGAAGTAGGTTGCG ATCGAACACC CAGCTCTCCT TATTCCGGCTACCTAGAACT TTGCCGGCGA GAGGACGGCA TTTATATACAATGGACTGAG CACAACCTTT ATATATACAA GTTATDAAGGTGATGTGATT TCGTCACGCA GTTCAGGGGG CCGAGGTCCACAGG

42、GGGGTG AGGTCAGCCT TGATAAACCG GAAATATT 3 CAGTCGGA ACTATTTGGC CT Reverse Primer Terminal sequences of one strand of marker RG246 (1 kb). From these sequences primers were designed for amplification of the corresponding genetic locus. The forward primer is on the sequence. The reverse primer is separat

43、ely as a complementary sequence.10/13/202271.基因組學 Genomics4.4 分子標記輔助選擇 4.4.2 以PCR為基礎的MAS 利用STS引物擴增產(chǎn)生的擴增片段長度多態(tài)性稱為擴增子長度多態(tài)性(Amplicon length polymorphism，ALP)。 與RFLP相比，ALP的頻率明顯降低。這里由于RFLP是在較長的DNA片段中產(chǎn)生的，其片段長度通常為2.0-20kb，而擴增子的長度較短，通常只有0.5-2.5kb。由于RFLP轉變?yōu)镾TS后，其ALP的頻率明顯降低，使RFLP資料的利用出現(xiàn)了新的問題。 10/13/202272.基因組

44、學 Genomics4.4 分子標記輔助選擇 4.4.2 以PCR為基礎的MAS PBR （PCR-based RFLP）或稱 CAPS（cleaved amplified polymorphic sequence）是對擴增片段再進行限制性片段分析的方法。 PBR ：10/13/202273.基因組學 GenomicsPCR products of the waxy locus before digestion (A) and after digestion (B) with enzyme TaqI. The undigested products were separated in a 2%

45、 agarose gel and digested products were separated in a 8% polyacrylamide gel.AB10/13/202274.基因組學 GenomicsComparison between ALP (A) and PCR-based RFLP (B) at locus RG13. The PCR products in B were digested with restriction enzymes HaeIII.AB10/13/202275.基因組學 Genomics Amplification of Locus A PCR prod

46、uct No amplification - null allele - poor PCR Same size band Different size band Digest with REn = Amplification Length Polymorphism (ALP) Restriction Digest Same size band Different size band Digest with REn=+1 = RFLP Restriction Digest Same size band Different size bandDigest with = RFLP REn=+210/13/202276.基因組學 Genomics Restriction endonuclease At least oneLocus Hae III Mbo I Alu I Rsa I Taq I Hpa II RFLP detectedRG140 - nd - + - nd YesRG146 - - - - - - NoRG170 nd - nd