免疫細(xì)胞分離與功能檢測課件

1、免疫細(xì)胞別離與功能檢測免疫細(xì)胞別離與功能檢測免疫細(xì)胞別離與功能檢測第一節(jié) 免疫細(xì)胞的別離22021/1/12第一節(jié) 免疫細(xì)胞的別離2021/1/122免疫細(xì)胞的別離及檢測檢測：各類免疫細(xì)胞及其亞群的數(shù)量和功能測定方法：體外法為主目的：判斷機(jī)體免疫狀態(tài)意義：討論疾病的發(fā)病機(jī)制、開展、預(yù)后、療效免疫細(xì)胞的別離 是指將各種參與免疫反響的 細(xì)胞從血液或組織中別離出來 2021/1/123 免疫細(xì)胞的起源與分化 紅細(xì)胞 血小板 肥大細(xì)胞 中性粒細(xì)胞 巨噬細(xì)胞 樹突狀細(xì)胞 漿細(xì)胞 T細(xì)胞 NK細(xì)胞2021/1/124免疫細(xì)胞種類2021/1/125免疫細(xì)胞的別離流程外周血PBMC純淋巴細(xì)胞T、B細(xì)胞TC亞

2、群/BC亞群2021/1/126包括：淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞各種血細(xì)胞比重不同,利用密度梯度離心進(jìn)展別離常用分層液：，一、 外周血單個核細(xì)胞的別離和純化2021/1/127細(xì)胞比重血小板1.0301.035PBMC1.0751.090多核白細(xì)胞1.092紅細(xì)胞1.093外周血各細(xì)胞成分的密度2021/1/128 別離液法是一種單次差速密度梯度離心的別離法，主要用于別離外周血中的單個核細(xì)胞。離心：密度梯度離心別離：各類細(xì)胞按其相應(yīng)密度重新分布一、別離法2021/1/129分層液別離單個核細(xì)胞示意圖2021/1/1210二、淋巴細(xì)胞的別離 純淋巴細(xì)胞群的采集 原理：利用單核細(xì)胞在37和離子存在條件下，

3、能主動粘附在玻璃、塑料、尼龍毛、棉花纖維或葡聚糖凝膠的特性，據(jù)此建立許多從單個核細(xì)胞中除去單核細(xì)胞的方法，以獲得高純度的淋巴細(xì)胞群。2021/1/1211(一)粘附貼壁法因B細(xì)胞也有貼壁現(xiàn)象，因此，本法別離的淋巴細(xì)胞群中B細(xì)胞有所損失。(二)吸附柱過濾法 將單核 細(xì)胞吸附于玻璃柱中，洗脫下來的主要是淋巴細(xì)胞2021/1/1212(三)磁鐵吸引法利用單核細(xì)胞具有吞噬的特性，在懸液中參加羰基鐵顆粒，待單核細(xì)胞吞噬鐵顆粒后，用磁鐵將細(xì)胞吸至管底，上層液中含較純的淋巴細(xì)胞群。2021/1/12137898四別離法返回章目錄2021/1/1214三、T、B細(xì)胞和T細(xì)胞亞群的別離免疫磁珠別離法流式細(xì)胞術(shù)別

4、離法 其他方法2021/1/1215一免疫磁珠別離法 2021/1/1216488 激光+-前向散射光檢測器 熒光檢測器電磁場單個細(xì)胞被分類進(jìn)入檢測管流式細(xì)胞術(shù)別離原理示意圖2021/1/1217第二節(jié) 淋巴細(xì)胞外表標(biāo)志的檢測及亞群分類2021/1/1218一、T細(xì)胞外表標(biāo)志及亞群48348-348+主要為 T 輔助性T細(xì)胞主要為 T 細(xì)胞毒性T細(xì)胞2021/1/1219二、B細(xì)胞外表標(biāo)志及亞群亞群2021/1/1220細(xì)胞典型標(biāo)志：56和16三、 細(xì)胞外表標(biāo)志2021/1/1221第三節(jié) 抗原提呈細(xì)胞外表標(biāo)志抗原提呈細(xì)胞：是指能攝取、加工、處理抗原，并將抗原信息提呈給抗原特異性淋巴細(xì)胞的一類

5、免疫細(xì)胞。單核-巨噬細(xì)胞樹突狀細(xì)胞2021/1/12221分泌、反響氧中間產(chǎn)物及蛋白水解酶等2效應(yīng)3激活T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子等活化巨噬細(xì)胞協(xié)同殺傷腫瘤細(xì)胞。一單核吞噬細(xì)胞141.吞噬和殺傷作用 2021/1/1223形態(tài)呈樹突樣具有一些相對特征性外表標(biāo)志抗原提呈才能強(qiáng)能激活初始T細(xì)胞免疫應(yīng)答的始動者二、樹突狀細(xì)胞 ，特征：2021/1/1224 由髓樣干細(xì)胞多數(shù)、淋巴干細(xì)胞分化。 如：類分子及類分子、B7-1和B7-2、40、1以及粘附分子等。 1、6、12、等。主要標(biāo)志：1a、11c、832021/1/1225第四節(jié) T細(xì)胞功能檢測一、T細(xì)胞功能檢測2021/1/1226淋巴細(xì)胞DNA合成分化

6、母細(xì)胞刺激物細(xì)胞變大細(xì)胞漿擴(kuò)大空泡核仁明顯核染色質(zhì)疏松（一）T淋巴細(xì)胞增殖試驗2021/1/1227形態(tài)學(xué)檢查法 3摻入法 比色法 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的檢測方法2021/1/1228形態(tài)學(xué)檢查法2021/1/1229 轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞未轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞淋巴母細(xì)胞 過渡型細(xì)胞大小(直徑m)1220121668核大小、染色質(zhì)增大、疏松增大、疏松不增大、密集核仁清晰、14個有或無無有絲分裂有或無無無胞質(zhì)、著色增多、嗜堿增多、嗜堿極少、天青色漿內(nèi)空泡有或無有或無無偽足有或無有或無無未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞的形態(tài)特征2021/1/1230原理：刺激物3756hG1期 S1期 合成 33716h 3測淋巴細(xì)胞內(nèi)放射量計

7、算判斷淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度外周血TG0期3摻入法2021/1/1231評價：該方法敏感性高、客觀性強(qiáng)、重復(fù)性好、可自動操作；設(shè)備昂貴、放射污染。 刺激指數(shù) ， 試驗管均值/對照管均值3摻入法2021/1/1232放射性測定3H-TdR絲裂原（抗原）刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗原理示意3摻入法2021/1/1233原理:用刺激劑體外激活淋巴細(xì)胞，用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制如莫能霉素阻止細(xì)胞因子分泌到細(xì)胞外，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)方式被打亂，引起細(xì)胞因子向高爾基體積聚，用流式細(xì)胞儀便可測出淋巴細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子種類，從而確定1/ 2細(xì)胞的百分率。淋巴細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測二T細(xì)胞分泌功能檢定2021/1/1234分泌的細(xì)胞因子 2

8、2 - - 3 + + - 4 - 5 - 6 - 10 - 和2分泌的細(xì)胞因子2021/1/1235原理:靶細(xì)胞抗原T細(xì)胞觀察殺傷活力致敏靶細(xì)胞三T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗2021/1/1236 試驗方法: 同位素法 淋巴細(xì)胞+含51 的腫瘤細(xì)胞 腫瘤細(xì)胞破壞 51 釋放 測定射線51特異釋放率= 100%三T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗2021/1/1237三T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗背景無效應(yīng)細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞 1:1效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞 5:1效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞 20:1細(xì)胞溶解2021/1/1238特異性抗原皮膚試驗皮膚試驗四體內(nèi)試驗2021/1/1239溶血空斑試驗酶聯(lián)免疫斑點試驗體內(nèi)試驗二、B細(xì)胞功

9、能檢測2021/1/1240一溶血空斑試驗溶血斑補(bǔ)體抗血清包被綿羊紅細(xì)胞2021/1/1241二酶聯(lián)免疫斑點法抗體產(chǎn)生B細(xì)胞抗原包被酶聯(lián)抗抗體凝膠底物顯色2021/1/1242刺激體內(nèi)抗體產(chǎn)生的特異性抗原有白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、多價肺炎鏈球菌等。將適量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后1周、2周、3周分別采血，別離血清，測定受檢者免疫前后相應(yīng)抗體的效價，判斷受檢者體內(nèi)B細(xì)胞的功能。三體內(nèi)試驗2021/1/1243染色計數(shù)離心取上清測或測發(fā)光強(qiáng)度測值形態(tài)法酶釋法放射性核素釋放法流式細(xì)胞術(shù)靶細(xì)胞溶解常用靶細(xì)胞: K562細(xì)胞株三、細(xì)胞活性檢測返回章目錄2021/1/1244 大吞噬細(xì)胞

10、:即單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng) 小吞噬細(xì)胞:即中性粒細(xì)胞第五節(jié) 其他免疫細(xì)胞功能檢測技術(shù)吞噬細(xì)胞的種類2021/1/1245特征性標(biāo)志 14別離技術(shù)密度梯度別離法流式細(xì)胞儀別離技術(shù)免疫磁珠別離法：為目前較常用的方法 黏附法一、吞噬細(xì)胞的別離一單核細(xì)胞的別離2021/1/1246斑蝥敷貼法別離人巨噬細(xì)胞 動物的巨噬細(xì)胞直接從腹腔滲出液中獲取 二巨噬細(xì)胞的別離2021/1/1247聚合物加速沉降法 可從外周血中別離出白細(xì)胞血漿(抗凝血) 別離法 可從白細(xì)胞中別離出純化的中性粒細(xì)胞三中性粒細(xì)胞的別離2021/1/1248密度梯度離心別離中性粒細(xì)胞2021/1/1249吞噬細(xì)胞的吞噬活動大體分為趨化、吞噬和胞

11、內(nèi)殺滅作用三個階段，據(jù)此建立相應(yīng)的檢測方法。 一中性粒細(xì)胞功能檢測技術(shù) 二巨噬細(xì)胞功能檢測技術(shù)二、相關(guān)功能檢測2021/1/1250細(xì)胞趨化功能的檢測吞噬功能的檢測殺菌功能的檢測一中性粒細(xì)胞功能檢測2021/1/1251體內(nèi)試驗法：皮膚窗法體外試驗法：濾膜浸透法 瓊脂糖平板法 趨化功能檢測檢測細(xì)胞運(yùn)動功能皮膚窗法 在受檢者前臂屈側(cè)中央3范圍內(nèi)，搔刮皮膚后，用蓋玻片壓緊固定，在第2，5，8，12，24，36小時各取樣一次，染色觀察中性粒細(xì)胞聚集開場時間、聚集程度等。安康正常人一般23h后開場聚集，達(dá)50100個，6小時可達(dá)1000個以上。 2021/1/1252 原理及技術(shù)要點 在一特制的分上下

12、兩層的小盒，將趨化因子參加下室，待檢細(xì)胞參加上室，兩室用微孔濾膜分隔，37溫育數(shù)小時后，上室的中性粒細(xì)胞受下室趨化因子的吸引，由濾膜微孔進(jìn)入濾膜內(nèi)，取濾膜清洗、固定、枯燥、染色和透明，在高倍鏡下觀察細(xì)胞穿越濾膜的挪動間隔 ，從而判斷其趨化功能。濾膜浸透法2021/1/1253原理及技術(shù)要點 在瓊脂糖凝膠平板的中孔加白細(xì)胞懸液，左孔加趨化因子，右孔加對照液，溫育48小時后，用顯微鏡測微器測定中性粒細(xì)胞向左孔的挪動間隔 A和向右孔的挪動間隔 B，計算趨化指數(shù)。趨化指數(shù)= 趨化指數(shù)越大，說明中性粒細(xì)胞運(yùn)動功能越強(qiáng) 瓊脂糖平板法2021/1/1254顯微鏡檢查法 吞噬指數(shù)=一中性粒細(xì)胞吞噬功能檢測2021/1/1255復(fù)原試驗 原理：C + 2C 四氮唑基淡黃色甲紫黑色殺菌功能檢測2021/1/1256 方法：1.抗凝血 + 硝基藍(lán)四氮唑NBT，37孵育25min。2.推片染色、鏡檢。正常值：NBT陽性細(xì)胞率應(yīng)95% NBT復(fù)原試驗2021/1/1257謝謝大家！內(nèi)容總結(jié)免疫細(xì)胞別離