第八章熒光分光光度法與檢測技術課件

1、1某些物質(zhì)吸收紫外-可見光后，可以發(fā)射其波長比吸收光更長的光，并且隨照射光的消失而消失，這種發(fā)射光稱為熒光（fluorescence）。熒光分析法（fluorometry）是利用某些物質(zhì)發(fā)射熒光的特性進行定性、定量分析的光學分析方法，又稱熒光光譜法第一節(jié) 熒光分光光度法的基本原理 2第一節(jié) 基本原理一、熒光的產(chǎn)生過程（一）單重態(tài)與三重態(tài)A 單重基態(tài) B 激發(fā)單重態(tài) C 激發(fā)三重態(tài)3第一節(jié) 基本原理（二）熒光的產(chǎn)生 電子由激發(fā)單重態(tài)基態(tài)單重態(tài)的躍遷4第一節(jié) 基本原理（二）磷光的產(chǎn)生 電子由激發(fā)三重態(tài)基態(tài)單重態(tài)的躍遷課堂互動您能比較熒光和磷光的主要區(qū)別嗎？5第一節(jié) 基本原理二、激發(fā)光譜和熒光光譜（

2、發(fā)射光譜）6第一節(jié) 基本原理 任何熒光物質(zhì)都具有兩個特征光譜：激發(fā)光譜和熒光光譜（發(fā)射光譜）激發(fā)光譜是當熒光波長一定時，熒光強度隨激發(fā)光波長而變化的關系曲線（以激發(fā)光波長ex為橫坐標，熒光的發(fā)光強度F為縱坐標的光譜）。7第一節(jié) 基本原理熒光光譜是當使激發(fā)光波長和強度不變，而讓物質(zhì)所產(chǎn)生的熒光通過發(fā)射分光系統(tǒng) ( II )分光，測定每一發(fā)射波長熒光強度F，以發(fā)射光波長em為橫坐標，熒光的發(fā)光強度F為縱坐標作圖所得的關系曲線。8第一節(jié) 基本原理三、熒光與分子結(jié)構(gòu) （一）熒光物質(zhì)的特征具有強的可見-紫外吸收，即具有K帶強吸收具有高的熒光效率熒光效率9第一節(jié) 基本原理（二）分子結(jié)構(gòu)與熒光的關系大的共軛

3、鍵結(jié)構(gòu)ex（激發(fā)）em（激發(fā)）F苯2052780.11萘2863210.29蒽3654000.46四苯3904800.6010第一節(jié) 基本原理分子的剛性和共平面性取代基的影響聯(lián)苯F =0.18芴F=1.0 11第一節(jié) 基本原理（三）影響熒光強度的外界因素溫度溶劑溶液酸堿性熒光熄滅劑散射光激發(fā)光源12第一節(jié) 基本原理 （四）熒光分光光度計熒光分光光度計是用于掃描液相熒光標記物所發(fā)出的熒光光譜的一種儀器。其能提供包括激發(fā)光譜、發(fā)射光譜以及熒光強度、量子產(chǎn)率、熒光壽命、熒光偏振等許多物理參數(shù),從各個角度反映了分子的成鍵和結(jié)構(gòu)情況。13第一節(jié) 基本原理（一）儀器類型濾光片熒光計濾光片-單色器熒光計熒光

4、分光光度計14第一節(jié) 基本原理（二）熒光分光光度計的基本結(jié)構(gòu)1.光源 2. 4. 7. 9. 狹縫3. 激發(fā)單色器 5. 樣品池6. 表面吸光物質(zhì)8. 發(fā)射單色器10. 檢測器 11. 放大器 12. 指示器 13. 記錄器15第一節(jié) 基本原理光源 目前最常用的是氙燈單色器（分光系統(tǒng)）激發(fā)單色器 發(fā)射單色器樣品池 測定熒光用的樣品池必須用低熒光材料或石英檢測器 光電倍增管16第一節(jié) 基本原理（三）儀器校準靈敏度校準波長校準激發(fā)光譜和發(fā)射光譜校準17課堂互動請您比較熒光分光光度計與紫外-可見分光光度計的主要區(qū)別 第一節(jié) 基本原理18點滴積累熒光和磷光在實驗現(xiàn)象上的區(qū)別：激發(fā)光停止照射時，熒光隨之

5、消失而磷光則將延續(xù)一段時間。最強熒光波長em和最強激發(fā)波長ex是物質(zhì)的定性依據(jù)，也是定量測定時的最適宜波長。強熒光物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)體征：一、具有長共軛結(jié)構(gòu)，如芳香環(huán)、稠環(huán)或雜環(huán)；二、剛性和共平面性。影響熒光強度的主要因素是分子結(jié)構(gòu)與外界條件。第一節(jié) 基本原理第二節(jié) 熒光定量分析第二節(jié) 熒光定量分析由于熒光物質(zhì)的結(jié)構(gòu)不同，其吸收光的波長不同，發(fā)射出熒光的波長也不同，這就是熒光分光光度法對能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)進行定性分析的依據(jù)。實驗證明，在稀溶液中，熒光強度與熒光物質(zhì)的濃度成正比，這是熒光分光光度法對熒光物質(zhì)進行定量分析的依據(jù)。19第二節(jié) 熒光定量分析一、熒光強度與物質(zhì)濃度的關系 當溶液中熒光物質(zhì)的濃度

6、為c，液層厚度為（吸收池內(nèi)徑）L時，由于熒光強度F正比于被熒光物質(zhì)吸收光的強度：F（I0 I），用線性方程表示為：F = K（I0 I）20第二節(jié) 熒光定量分析 K為常數(shù)，稱熒光比率，其大小取決于一定條件下的熒光效率，結(jié)合比爾定律可得到下式：F = 2.303FI0cL 入射光強度I0在波長一定，光源穩(wěn)定時為固定值，因此可以將2.303FI0L視為常數(shù)K，故：F = Kc21第二節(jié) 熒光定量分析 當其他條件也一定時，熒光物質(zhì)在稀溶液中的熒光強度與濃度呈線性關系，這是熒光定量分析的依據(jù)。但只有當熒光物質(zhì)的濃度很小時， 即cL 0.05，這種關系才成立。2223課堂互動請您分析為什么熒光分光光度法

7、的靈敏度比紫外-可見分光光度法要高？第二節(jié) 熒光定量分析24第二節(jié) 熒光定量分析二、定量分析方法標準曲線法 配制一系列濃度為c1、c2、c3對照品溶液，分別測其F1、F2、F3值，用Fc作圖繪制標準曲線。 然后在同樣條件下測定試樣溶液的Fx，在標準曲線上查找對應的濃度cx。25第二節(jié) 熒光定量分析比例法 若熒光分析標準曲線過原點，則可選擇其線性范圍用比例法測定。即配制一對照品溶液（cs）測其熒光強度（Fs），再測定試樣溶液（cx）的熒光強度（Fx），然后進行比較。測定時同樣要以空白（F0）校正：26第二節(jié) 熒光定量分析多組分混合物測定 與吸光度一樣，熒光強度也有加和性，因此混合物不需經(jīng)過分離，

8、可用解聯(lián)立方程的方法測定?？蛇x擇兩物質(zhì)不同的激發(fā)波長處的熒光強度測定，也可選擇不同熒光波長處的熒光強度測定，這樣選擇范圍比紫外-可見分光光度法廣泛。27點滴積累當其他條件（即F、I0、L）一定時，熒光物質(zhì)在稀溶液中的熒光強度F與濃度c成正比。熒光分析的定量方法與紫外-可見分光光度法基本相同。第二節(jié) 熒光定量分析28第三節(jié)應用與發(fā)展一、熒光分析的應用 （一）有機化合物的熒光分析芳香族及具有芳香結(jié)構(gòu)的化合物，因存在共軛體系在紫外光照射下很多能發(fā)射熒光。為提高測定靈敏度和選擇性，可使弱熒光物質(zhì)與某些熒光試劑作用，以得到強熒光性產(chǎn)物。因此，熒光分析法在有機物測定方面的應用很廣。第三節(jié)應用與發(fā)展29第三

9、節(jié)應用與發(fā)展（二）無機化合物的熒光分析直接熒光法熒光猝滅法催化熒光法30第三節(jié)應用與發(fā)展二、熒光分析新技術激光熒光分析時間分辨熒光分析同步熒光分析膠束增敏熒光分析三維熒光光譜分析原油試樣在環(huán)乙烷中的等角三維投影光譜圖31第八章 熒光分析法檢測技術與應用一、選擇題(一)單項選擇題1. 熒光光譜屬于（ ）。A、吸收光譜 B、發(fā)射光譜 C、紅外光譜 D、質(zhì)譜2. 分子熒光分析比紫外-可見分光光度法選擇性高的原因是（ ）。A、能發(fā)射熒光的物質(zhì)比較少 B、分子熒光光譜為線狀光譜，而分子吸收光譜為帶狀光譜C、熒光波長比相應的吸收波長稍長D、熒光光度計有兩個單色器，可以更好地消除組分間的相互干擾目標檢測32

10、第八章 熒光分析法檢測技術與應用3. 熒光量子效率是指（ ）。A、熒光強度與吸收光強度之比 B、發(fā)射熒光的量子數(shù)與吸收激發(fā)光的量子數(shù)之比C、發(fā)射熒光的分子數(shù)與物質(zhì)的總分子數(shù)之比 D、激發(fā)態(tài)的分子數(shù)與基態(tài)的分子數(shù)之比4. 一種物質(zhì)能否發(fā)出熒光主要取決于（ ）。A、分子結(jié)構(gòu) B、激發(fā)光的波長 C、溫度 D、溶劑的極性33第八章 熒光分析法檢測技術與應用5. 下列敘述中，錯誤的是（ ）。A、熒光分析的待測物應含有大鍵 B、紫外分光光度法待測物應含有鍵C、質(zhì)譜法待測物應含離子 D、氣象色譜分析物的沸點應較低6. 下列因素會導致熒光效率下降的有（ ）。A、激發(fā)光強度下降 B、溶劑極性變小 C、溫度下降

11、D、溶劑中含有鹵素離子34第八章 熒光分析法檢測技術與應用7. 熒光波長與相應激發(fā)光波長相比（ ）。A、前者較長 B、后者較長 C、兩者相等 D、關系不確定8. 熒光光譜分析的主要優(yōu)點是（ ）。A、準確度高 B、操作簡便 C、儀器簡單 D、靈敏度高9. 熒光分光光度計與分光光度計的主要區(qū)別在于（ ）。A、光源 B、單色器 C、光路 D、檢測器35第八章 熒光分析法檢測技術與應用（二）多項選擇題1. 下列關于分子熒光分析特點的敘述正確的是（ ）。A、檢測靈敏度高 B、用量大，分析時間長 C、用量少，操作簡便 D、選擇性強 E、應用廣泛2. 分子中有利于提高熒光效率的結(jié)構(gòu)特征是（ ）。A、雙鍵數(shù)目

12、較多 B、共軛雙鍵數(shù)目較多 C、含重金屬原子 D、分子為平面剛性 E、苯環(huán)上有給電子基團36第八章 熒光分析法檢測技術與應用3.下列躍遷方式屬于無輻射躍遷的有（ ）。A、振動弛豫 B、內(nèi)轉(zhuǎn)換 C、體系間跨越 D、熒光發(fā)射 E、磷光發(fā)射4. 分子熒光法與紫外-可見分光光法的主要區(qū)別為（ ）。A、分析方法不同 B、儀器結(jié)構(gòu)不同 C、靈敏度不同 D、光譜帶個數(shù)不同 E、光源不同37第八章 熒光分析法檢測技術與應用二、填空題1. 激發(fā)光波長和強度固定后，熒光強度與熒光波長的關系曲線稱為 ；熒光波長固定后，熒光強度與激發(fā)光波長的關系曲線稱為 。2. 熒光分光光度計的主要部件有 、 、 、 四大部件組成。

13、3. 熒光分析法進行定量分析的依據(jù)是 。三、簡答題1何謂熒光效率？具有哪些分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)有較高的熒光效率？2哪些因素會影響熒光波長和強度？3請設計兩種方法測定溶液Al3+的含量。（一種化學分析方法，一種儀器分析方法）38第八章 熒光分析法檢測技術與應用二、填空題1. 激發(fā)光波長和強度固定后，熒光強度與熒光波長的關系曲線稱為 ；熒光波長固定后，熒光強度與激發(fā)光波長的關系曲線稱為 。2. 熒光分光光度計的主要部件有 、 、 、 等四大部件組成。3. 熒光分析法進行定量分析的依據(jù)是 。39第八章 熒光分析法檢測技術與應用四、實例分析題1用熒光法測定復方炔諾酮片中炔雌醇的含量時，取供試品20片（每片含炔雌醇應為31.538.5g），研細溶于無水乙醇中，稀釋至250ml，濾過，取濾液5ml，稀釋至10ml，在激發(fā)波長285nm和發(fā)射波長307nm處測定熒光強度。如炔雌醇對照品的乙醇溶液（1.4g/ml）在同樣測定條件下熒光強度為65，則合格片