實(shí)驗(yàn)室消毒和滅菌基礎(chǔ)知識(shí)

1、 11/11實(shí)驗(yàn)室消毒和滅菌基礎(chǔ)知識(shí)消毒和滅菌是微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)中最基本的操作技術(shù)，因此從事生產(chǎn)、檢驗(yàn)的人員均應(yīng)了解消毒和滅菌的基本概念、兩者的關(guān)系，各自的應(yīng)用方法及其意義，操作時(shí)應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行相關(guān)的操作規(guī)程，一方面確保生產(chǎn)與檢驗(yàn)工作的效果，另一方面也是對(duì)自身安全的保護(hù)。消毒和滅菌的概念：1、消毒：指對(duì)病原微生物的繁殖體的致死作用，但不能殺死芽孢等全部微生物，因此消毒是不徹底的，不能代替滅菌。凡用于消毒的化學(xué)藥品稱為消毒劑，因此人們也常稱消毒劑為化學(xué)消毒劑。2、滅菌：殺滅物體中所有活的微生物（含芽孢）的作用，滅菌是采用強(qiáng)烈的理化因素使任何物體內(nèi)外部的一切微生物永遠(yuǎn)喪失其生長(zhǎng)繁殖能力的措施。通常用物理

2、方法來達(dá)到滅菌的目的。二、消毒和滅菌的關(guān)系1、共性：殺滅微生物以控制其污染和防止傳播。2、區(qū)別：消毒滅菌方法目前常用的消毒滅菌方法多采用物理方法(如干熱滅菌法、濕熱滅菌法、過濾除菌法、射線殺菌法等)和化學(xué)方法(消毒劑、抗生素)兩大類。1.干熱滅菌法干熱滅菌法是利用恒溫干燥箱內(nèi)120C150C的高熱，并保持90120分鐘，殺死細(xì)菌和芽孢，達(dá)到滅菌目的的一種方法。主要適用于不便在壓力蒸汽滅菌器中進(jìn)行滅菌，且不易被高溫?fù)p壞的玻璃器皿、金屬器械以及不能和蒸汽接觸的物品的滅菌。用此方法滅菌的物品干燥，易于貯存。酒精燈火焰燒灼滅菌法也是屬于干熱滅菌的方法之一。在進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)工作時(shí)，常須利用工作臺(tái)面

3、上的酒精燈火焰對(duì)金屬器具及玻璃器皿口緣進(jìn)行補(bǔ)充滅菌。2.濕熱滅菌法壓力蒸汽濕熱滅菌法是目前最常用的一種滅菌方法。它利用高壓蒸汽以及在蒸汽環(huán)境中存在的潛熱作用和良好的穿透力，使菌體蛋白質(zhì)凝固變性而使微生物死亡。適合于布類工作衣、各種器皿、金屬器械、膠塞、蒸餾水、棉塞、紙和某些培養(yǎng)液的滅菌。高壓蒸汽滅菌器的蒸汽壓力一般調(diào)整為1.01.1kg/cm2，維持2030min即可達(dá)到滅菌效果。3.射線滅菌法利用紫外線燈進(jìn)行照射滅菌的方法。紫外線是一種低能量的電磁輻射，可以殺滅多種微生物。紫外線的作用機(jī)制是通過對(duì)微生物的核酸及蛋白質(zhì)等的破壞作用而使其滅活。適合于實(shí)驗(yàn)室空氣、地面、操作臺(tái)面滅菌。滅菌時(shí)間為30

4、min。用紫外線殺菌時(shí)應(yīng)注意，不能邊照射邊進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，因?yàn)樽贤饩€不僅對(duì)人體皮膚有傷害，而且對(duì)培養(yǎng)物及一些試劑等也會(huì)產(chǎn)生不良影響。4.過濾除菌法過濾除菌法是將液體或氣體通過有微孔的濾膜過濾，使大于濾膜孔徑的細(xì)菌等微生物顆粒阻留，從而達(dá)到除菌的方法。過濾除菌法大多用于遇熱易發(fā)生分解、變性而失效的試劑、酶液、血清、培養(yǎng)液等。目前，常用微孔濾膜金屬濾器或塑料濾器正壓過濾除菌，或用玻璃細(xì)菌濾器、濾球負(fù)壓過濾除菌。濾膜孔徑應(yīng)在0.220.45m范圍內(nèi)或用更小的細(xì)菌濾膜，溶液通過濾膜后，細(xì)菌和孢子等因大于濾膜孔徑而被阻，并利用濾膜的吸附作用，阻制小于濾膜孔徑的細(xì)菌透過。5.化學(xué)消毒劑消毒法化學(xué)消毒劑消毒法

5、用于那些不能利用物理方法進(jìn)行滅菌的物品、空氣、工作面、操作者皮膚、某些實(shí)驗(yàn)器皿等。1）消毒劑分類依殺滅微生物能力進(jìn)行分類，有以下三種：2）消毒劑的選擇消毒劑的種類很多，性質(zhì)不一，因此應(yīng)根據(jù)實(shí)際需求選擇既安全又有效的消毒劑。在選擇時(shí)至少應(yīng)考慮以下幾點(diǎn)：3）消毒劑的使用A、影響消毒效果的因素影響消毒劑效能的因素比較復(fù)雜，一般都因消毒劑的種類而異，因此各種消毒劑使用時(shí)應(yīng)注意以下因素a）微生物種類及數(shù)量消毒劑的有效濃度及作用時(shí)間因微生物的種類及數(shù)量的不同而有差異，不同類型的病原微生物對(duì)消毒劑的抗力不同。對(duì)于細(xì)菌繁殖體來說，革蘭氏陰性菌比革蘭氏陽性菌對(duì)消毒劑的耐受性強(qiáng)，尤其是銅綠假單胞菌的耐受性較強(qiáng)；芽

6、孢的耐受力最強(qiáng)，在化學(xué)消毒劑中，戊二醛和過氧乙酸可殺滅芽孢，但其作用力不如熱力滅菌方法；病毒對(duì)消毒因子的耐力也因其種類的不同而有相當(dāng)大的差異，親水病毒的耐力較親脂病毒要強(qiáng)；真菌對(duì)大多數(shù)化學(xué)藥物的耐受力較強(qiáng)，因此適用于細(xì)菌的消毒劑并不一定適用于真菌，但真菌一般耐熱性較差。微生物污染數(shù)量多時(shí)，應(yīng)加長(zhǎng)消毒接觸時(shí)間、加大消毒劑用量或提高消毒劑濃度。b）溫度一般來說，消毒的速度隨溫度的提高而加快，其殺菌作用也相應(yīng)增強(qiáng)。溫度影響的原理是其可影響菌體表面和酶系統(tǒng)的活性，以及消毒劑的分子運(yùn)動(dòng)，使得消毒劑與菌細(xì)胞接觸的機(jī)會(huì)增加，從而使消毒的時(shí)間縮短。但溫度的變化對(duì)各種消毒劑的影響不同，如醇類和酚類一般受溫度影響

7、較小，但如甲醛、環(huán)氧乙烷等溫度升高一倍時(shí)，其殺菌效果可增加十倍。c）濃度消毒劑的濃度應(yīng)考慮的是其主要成分的濃度，根據(jù)不同類型的消毒劑性質(zhì)，提高或降低濃度，均可顯著影響消毒效果。一般降低消毒劑的濃度需延長(zhǎng)相應(yīng)的消毒時(shí)間，且消毒劑內(nèi)的有效成分在其保存期內(nèi)也會(huì)相應(yīng)下降。d）pH值酸堿度常影響酸性或堿性消毒劑的電離度，改變其溶解度及分子結(jié)構(gòu)，影響不同離子型消毒劑的作用，在堿性環(huán)境中，細(xì)菌表面負(fù)電荷增多，陽離子型消毒劑作用較強(qiáng)，在酸性環(huán)境中，細(xì)菌表面負(fù)電荷減少，陰離子型消毒劑的殺菌效果較好；另外pH的過高或過低對(duì)微生物的生長(zhǎng)及表面物理化學(xué)狀態(tài)均有影響。e）有機(jī)物質(zhì)消毒環(huán)境中存在有機(jī)物，則其可在微生物表面

8、形成保護(hù)層阻礙消毒劑與微生物的接觸或延遲消毒劑的作用，可能導(dǎo)致微生物逐漸產(chǎn)生對(duì)藥物的適應(yīng)性，這些情況均會(huì)不同程度的降低消毒劑的消毒作用，如有機(jī)物可中和一部分消毒劑，有機(jī)物和消毒劑作用，形成溶解度比原來更低或殺菌作用比原來更弱的化合物。一般來說消毒劑中的重金屬類及表面活化劑等受有機(jī)物的影響較大。B、其他注意點(diǎn)a）微生物對(duì)消毒劑的耐受性一般來說，為了避免微生物對(duì)消毒劑的耐受性，很多企業(yè)的消毒劑是輪換使用的，現(xiàn)今在學(xué)術(shù)界對(duì)于消毒劑的輪換使用的必要性尚存爭(zhēng)議，但FDA的監(jiān)管引文中主導(dǎo)應(yīng)進(jìn)行消毒劑輪換，但消毒劑的輪換使用周期應(yīng)以歷史環(huán)境監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)制訂。微生物對(duì)消毒劑的耐受性較抗生素要低一些，因?yàn)橄?/p>

9、劑比抗生素有更強(qiáng)的殺菌作用。另外使用高濃度的消毒劑來殺滅少量的微生物通常影響不大，因此應(yīng)考慮選擇合適的消毒劑來對(duì)抗不斷增強(qiáng)的耐受性。同時(shí)建議定期進(jìn)行試驗(yàn)證明或評(píng)估從環(huán)境菌監(jiān)測(cè)中分離出的微生物（含已知及新的類型）對(duì)該環(huán)境使用消毒劑的敏感性。b）規(guī)范及安全使用在消毒劑的使用過程中，人員培訓(xùn)及是否規(guī)范及安全使用該消毒劑對(duì)其應(yīng)用有很大影響。接觸消毒劑的人員要求進(jìn)行微生物、清潔滅菌操作、消毒劑的制備/使用/安全處理廢棄稀釋及濃縮消毒劑的培訓(xùn)。如正確配制消毒劑是關(guān)鍵，很多消毒效果不佳或失敗的例子源于消毒劑的過度稀釋，另外用于無菌操作流程的消毒劑必須用無菌水稀釋，一般稀釋用水推薦純化水及更高級(jí)別的水，因?yàn)樗?/p>

10、的硬度會(huì)影響一些消毒劑的功效。另外在處理可能產(chǎn)生有毒刺激性氣體、腐蝕性較強(qiáng)及濃度較大的消毒劑（如殺孢子劑）時(shí)，應(yīng)配備適宜的安全防護(hù)裝備，如安全眼鏡、面罩、過濾氣味的口罩、手套、防護(hù)服等。在消毒劑的使用同時(shí)應(yīng)考慮清潔劑的配合使用，清潔是去除表面顆粒及微生物、去除殘留并提高后續(xù)消毒效果，因此清潔是為后續(xù)的消毒做好準(zhǔn)備，同時(shí)規(guī)避前后2種輪換消毒劑的互相作用。6.抗生素抑菌法抗生素抑菌法主要用于培養(yǎng)液，是培養(yǎng)過程中預(yù)防微生物污染的重要手段以及作為微生物污染不嚴(yán)重時(shí)的“急救”措施。常用的抗生素有青霉素、鏈霉素和新霉素等。不同種類物品及培養(yǎng)物消毒滅菌方法1.無菌操作室滅菌培養(yǎng)材料進(jìn)行培養(yǎng)、觀察或更換培養(yǎng)液

11、時(shí)，必須從各方面防止任何污染物進(jìn)入培養(yǎng)液或容器，所以無菌操作室的滅菌是至關(guān)重要的。由于無菌操作室的污染來源主要是空氣中的細(xì)菌和真菌孢子，因此長(zhǎng)期停用后的無菌操作室應(yīng)進(jìn)行熏蒸滅菌。熏蒸是用高錳酸鉀+甲醛(2ml甲醛+1g高錳酸鉀)/m3進(jìn)行無菌室的滅菌。經(jīng)常使用的無菌操作室，在每次使用前都應(yīng)進(jìn)行地面衛(wèi)生清潔，并用紫外線燈照射30 min，進(jìn)行空氣滅菌。對(duì)超凈工作臺(tái)，每次操作前用紫外燈照射30min，然后用70%75%酒精擦拭。2.培養(yǎng)液滅菌培養(yǎng)液在制備過程中帶有各種雜菌，分裝后應(yīng)立即滅菌，或在24小時(shí)內(nèi)完成滅菌工序。目前常用過濾除菌法除去培養(yǎng)物操作液和培養(yǎng)液中的細(xì)菌。或?qū)ε囵B(yǎng)液中耐熱組分先進(jìn)行高

12、壓蒸汽滅菌，然后在無菌室加入經(jīng)過過濾除菌的不耐熱溶液，混勻后分裝備用。使用高壓蒸汽滅菌器滅菌時(shí)，將分裝好的培養(yǎng)液放入底部有一定量(淹沒加熱管)涼水的高壓蒸汽滅菌器內(nèi)，增壓至0.350.4kg/cm2時(shí)排凈滅菌器內(nèi)冷空氣，以便使蒸汽能到達(dá)各個(gè)消毒部位，保證消毒滅菌徹底。然后繼續(xù)加壓加熱，當(dāng)壓力表讀數(shù)達(dá)到1.01.1kg/cm2為121C，保持1520 min即可。由于消毒滅菌效果取決于溫度而不是壓力，所以在一定壓力下保持較長(zhǎng)的消毒滅菌時(shí)間是必須的。在121C的蒸汽溫度下可以很快殺死各種細(xì)菌及高度耐熱的芽孢桿菌，因此許多培養(yǎng)液的消毒滅菌壓力、溫度一般保持在1.01.1 kg/cm2、121C。消毒

13、滅菌時(shí)間與需要消毒滅菌的培養(yǎng)液量密切相關(guān)(表2-3)，時(shí)間不足達(dá)不到滅菌效果，時(shí)間過長(zhǎng)培養(yǎng)液內(nèi)的一些化學(xué)物質(zhì)遭到破壞，影響培養(yǎng)液成分。消毒滅菌結(jié)束后，關(guān)閉熱源，只有當(dāng)滅菌器內(nèi)壓力降為零時(shí)才能打開放氣閥，排除剩余蒸汽，取出培養(yǎng)液。不可在壓力較高時(shí)打開放氣閥，引起減壓沸騰，使容器中液體溢出。培養(yǎng)液組成中如含有遇熱易分解的物質(zhì)，則需用過濾方法消毒滅菌。首先對(duì)培養(yǎng)液中耐熱組分進(jìn)行高壓蒸汽滅菌后放置在無菌場(chǎng)所，固體培養(yǎng)液在40C左右瓊脂即將凝結(jié)前，加入經(jīng)過過濾除菌的不耐熱溶液，混勻后冷卻備用。液體培養(yǎng)液在冷卻到室溫后再加入過濾除菌溶液。過濾除菌時(shí)，使用孔徑為0.220.45m或更小的細(xì)菌濾膜。過濾除菌可利用抽濾裝置或注射過濾器進(jìn)行，所用器皿均應(yīng)進(jìn)行高壓消毒滅菌，溫度不應(yīng)超過121C。玻璃器皿、塑料器皿和器械滅菌玻璃器皿可進(jìn)行干熱滅菌或高壓蒸汽滅菌，但在蒸汽滅菌后最好及時(shí)烘干水分。對(duì)不能進(jìn)行高壓蒸汽滅菌的塑料器皿可用75%酒精浸泡，使用前在無菌操作臺(tái)面上晾干的同時(shí)，用紫外線重復(fù)殺菌。實(shí)驗(yàn)室還可以用環(huán)氧乙烷滅菌袋對(duì)塑料器皿進(jìn)行消毒，消毒后的器皿要充分散氣24小時(shí)后才可使用。無菌操作所用的各種器械，一般采用干熱或高壓蒸汽滅菌，或用75