【干貨分享】新版《中國藥典》中關(guān)于非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查的要點

1、 20/20【干貨分享】新版中國藥典中關(guān)于非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查的要點新版中國藥典中對非無菌產(chǎn)品的微生物限度及檢查方法等都做出了相關(guān)要求，本文對其要點進行了整理，供大家參考。微生物計數(shù)法1、微生物計數(shù)法用于能在有氧條件下生長的嗜溫細菌和真菌的計數(shù)。2、微生物計數(shù)法用于檢查非無菌制劑及其原、輔料等是否符合規(guī)定的微生物限度標準時，應按下述規(guī)定進行檢驗，包括樣品的取樣量和結(jié)果的判斷等。除另有規(guī)定外，本法不適用于活菌制劑的檢查。3、微生物計數(shù)試驗環(huán)境應符合微生物限度檢查的要求。4、檢驗全過程必須嚴格遵守無菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。5、潔凈空氣區(qū)域、工作臺面及環(huán)境

2、應定期進行監(jiān)測。6、如供試品有抗菌活性，應盡可能去除或中和。7、供試品檢查時，若使用了中和劑或滅活劑，應確認其有效性及對微生物無毒性。8、供試液制備時如果使用了表面活性劑，應確認其對生物無毒性以及與所使用中和劑或滅活劑的相容性。計數(shù)方法1、計數(shù)方法包括平皿、薄膜過濾法和最可能數(shù)法(Most-Probable-Numr berMethod，簡稱MPN法)，MPN法用于微生物計數(shù)時精確度較差，但對于某些微生物污染量很小的供試品，MPN法可能是更適合的方法。2、供試品檢查時，應根據(jù)供試品理化特性和微生物限度標準等因素選擇計數(shù)方法，檢測的樣品量應能保證所獲得的試驗結(jié)能夠判斷供試品是否符合規(guī)定。3、所選

3、方法的適用性須經(jīng)確認。計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和供試品計數(shù)方法適用性試驗1、供試品微生物計數(shù)中所使用的培養(yǎng)基應進行適用性檢查。2、供試品的微生物計數(shù)方法應進行方法適用性試驗，以確認所采用的方法適合于該產(chǎn)品的微生物計數(shù)。3、若檢驗程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可影響檢驗結(jié)果時，計數(shù)方法應重新進行適用性試驗。菌種及菌液制備1、菌種（1）試驗用菌株的傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進行保存，以保證試驗菌株的生物學特性。（2）計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和計數(shù)方法適用性試驗用菌株見表1。表1 試驗菌液的制備和使用2、菌液制備（1）按表1規(guī)定程序培養(yǎng)各試驗菌株。（2）取金黃

4、色葡球菌、銅綠假單孢菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠茵的新鮮培養(yǎng)物，用pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液或0.9無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液；取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物加人適量含0.05(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或含0.05(ml/ml)聚山梨酯80的0.9無菌氯化鈉液，將孢子洗脫。（3）采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液或含0.05(ml/ml)聚山梨80的0.9無氧化鈉溶液制成適宜濃度的黑曲霉孢子懸液。（4）菌液制備后若在室溫下放置，應在2小時內(nèi)使用;若保存在28，可在24小時內(nèi)使用。

5、黑曲毒孢子懸液可保存在28，在驗證過的貯存期內(nèi)使用。3、陰性對照為確認試驗條件是否符合要求，應進行陰性對照試驗，陰性對照試驗應無菌生長，如陰性對照有菌生長，則應進行偏差調(diào)查。4、培養(yǎng)基適用性檢查（1）微生物計數(shù)用的商品化的預制培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應進行培養(yǎng)基適用性檢查。（2）按表1規(guī)定，接種不大于100cfu的菌液至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基管或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板，置表1規(guī)定條件下培養(yǎng)。（3）每一試驗菌株平行制備2管或2個平板；同時，用相應的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進行上述試驗。（4）被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值應

6、在0.52范圍內(nèi)，且菌落形態(tài)大小應與對照培養(yǎng)基上的菌落一致；被檢液體培養(yǎng)基管與對照培養(yǎng)基管比較，試驗菌應生長良好。計數(shù)方法適用性試驗1.供試液制備（1）根據(jù)供試品的理化特性與生物學特性，采取適宜的方法制備供試液。（2）供試液制備若需加溫時，應均勻加熱，且溫度不應超過45。（3）供試液從制備至加入檢驗用培養(yǎng)基，不得超過1小時。（4）常用的供試液制備方法如下。如果下列供試液制備方法經(jīng)確認均不適用，應尋找其他適宜的方法。1）水溶性供試品a.取供試品，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或pH7.2磷酸鹽沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基溶解稀釋成1：10供試液。b.若需要，調(diào)節(jié)供試液pH勻值至68。c.

7、必要時，用同一稀釋液將供試液進一步10倍系列稀釋。d.水溶性液體制劑也可混合供試品原液作為供試液。2）水不溶性非油脂類供試品a.取供試品，用pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液，或pH7.2磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基制備成1:10供試液。b.分散力較差的供試品，可在稀釋液中加入表面活性劑如0.1(ml/ml)的聚山梨酯80，使供試品分散均勻。c.若需要，調(diào)節(jié)供試液pH值至68。d.必要時，用同一稀釋液將供試液進一步10倍系列稀釋。3）油脂類供試品a.取供試品，加入無菌十四烷酸異丙使其溶解，或與最少量并能使供試品乳化的無菌聚山梨酯80或其無抑菌性的無菌表面活性劑充分混勻。b.表面活性劑的溫

8、度一般不超過40(特殊情況下，最多不超過45)，小心混合，若需要可在水浴中進行，然后加入預熱的稀釋液制成1:10供試液，保溫，混合，并在最短時間內(nèi)形成乳狀液。c.必要時，用稀釋液或含上述表面活性劑的稀釋液進一步10倍系列稀釋。4）膜劑供試品a.取供試品，剪碎，加pH7.0無菌化鈉蛋白胨緩沖液，或pH7.2磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，浸泡，振搖，制成1:10的供試液。b.若需要，調(diào)節(jié)供試液pH值至68。c.必要時，用同一稀釋液將供試液進一步10倍系列稀釋。5）腸溶及結(jié)腸溶制供試品a.取供試品，加入pH6.8無酸鹽緩沖液(用于腸溶制劑)或pH7.6無磷酸鹽緩沖液(用于結(jié)腸溶制劑)，置45

9、水浴中，振搖，使溶解，制成1：10的供試液。b.必要時，用同一稀釋液將供試液進一步10倍系列稀釋。6）氣霧劑供試品a.取供試品，置-20或其他適宜溫度冷凍約1小時，取出，迅速消毒供試品開啟部位或閥門。b.正置容器，用無菌鋼錐或針樣設(shè)備在與閥門結(jié)構(gòu)相匹配的適宜位置鉆一小孔，供試品各容器的鉆孔大小和深度應盡量保持一致，拔出鋼錐時應無明顯拋射劑拋出，輕輕轉(zhuǎn)動容器，使拋射劑緩緩釋出。c.釋放拋射劑后再無菌開啟容器，并將供試品轉(zhuǎn)移至無菌容器中混合，必要時用緩沖液沖洗容器內(nèi)壁，然后取樣檢查。7）貼劑、貼膏劑供試品a.取供試品，去掉防粘層，將粘貼面朝上放置在無菌玻璃或塑料器皿上，在粘貼面上覆蓋一層適宜的無菌

10、多孔材料(如無菌紗布)，避免供試品粘貼在一起。b.將處理后的供試品放入盛有適宜體積并含有表面活性劑（如聚山梨酯80或卵磷脂)稀釋液的容器中，振蕩至少30分鐘。c.必要時，用同一稀釋液將供試液進一步10倍系列稀釋。計數(shù)方法適用性試驗2.接種和稀釋（1）按表2規(guī)定及下列要求進行供試液的接種和稀釋，制備微生物回收試驗用供試液。表2 試驗菌液的制備和使用（2）所加菌液的體積應不超過供試液體積的1%。（3）為確認供試品中的生物能被充分檢出，首先應選擇最低稀釋級的供試液進行計數(shù)方法適用性試驗。試驗組取上述制備好的供試液，加入試驗菌液，混勻，使1ml供試液或每張濾膜所濾過的供試液中含菌量不大于100cfu。

11、供試品對照組取制備好的供試液，以稀釋液代替菌液同試驗組操作。菌液對照組（1）取不含中和劑及滅活劑的相應稀釋液替代供試液，按試驗組操作加入試驗菌液并進行微生物回收試驗。（2）若因供試品抗菌活性或溶解性較差的原因?qū)е聼o法選擇低釋的供試液進行方法適用性試驗時，應用適宜的方法對供試液進行進一步的處理。如果供試品對微生物生長的抑制作用無法以其他方法消除，供試液可經(jīng)過中和、稀釋或薄膜過濾處理后再加入試驗菌懸液進行方適性試驗?？咕钚缘娜コ驕缁睿?）供試液接種后，按“做生物回收”規(guī)定的方法進行做生物計數(shù)。（2）若試驗組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值小于菌液對照組菌落數(shù)值的50%，可采用下述方法消除供試品

12、的抑菌活性。1)增加稀釋液或培養(yǎng)基體積。2)加人適宜的中和劑或滅活劑。（3）中和劑或滅活劑可用于消除干擾物的抑菌活性，最好在稀釋液或培養(yǎng)基滅菌前加入，若使用中和劑或滅菌劑，試驗屮應設(shè)中和劑或滅活劑對照組，即取相應量含中和劑或滅活劑的稀釋液替代供試品同試驗組操作，以確認其有效性和對微生物無毒性，中和劑或滅活劑對照組的菌落數(shù)與菌液對照組的菌落數(shù)的比值應在0.52范圍內(nèi)。供試品中微生物的回收計數(shù)方法適用于試驗用的各試驗菌應逐一進行微生物回收試驗。微生物的回收可釆用平皿法、薄膜過濾法或MPN法。1、平皿法平皿法包括傾注法和涂布法。表3中每株試驗菌每種培養(yǎng)基至少制備2個平皿，以算術(shù)平均值作為計數(shù)結(jié)果。表

13、3試驗菌液的制備和使用（1）傾注法1）取照上述“供試液的制備”“接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活”制備的供試液1ml，置直徑90mm的無菌平皿中，注入1520ml溫度不超過45熔化的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。2）若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基的用量應相應增加。3）按表3規(guī)定條件培養(yǎng)、計數(shù)。4）同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)。5）計算各試驗組的平均菌落數(shù)。（2）涂布法1）取適量(通常為1520ml)溫度不超過45的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，注入直徑90mm的無菌平皿，凝固，制成平板，采用適宜的方法使培養(yǎng)基表面干燥。2）若使用直徑較大的平皿，培

14、養(yǎng)基用量也應相應增加。3）每一平板表面接種上述照“供試液的制備”“接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活”制備的供試液不少于0.1ml。4）按表3規(guī)定條件培養(yǎng)、計數(shù)。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)。計算各試驗組的平均菌落數(shù)。2、薄膜過濾法（1）薄膜過濾法所釆用的濾膜孔徑應不大于0.45m，直徑一般為50mm，若采用其他直徑的濾膜，沖洗量應進行相應的調(diào)整。（2）供試品及其溶劑應不影響濾膜材質(zhì)對微生物的截留。濾器及濾膜使用前應采用適宜的方法滅菌。使用時，應保證濾膜在過濾前后的完整性。（3）水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。（4）油類供試品，其濾膜和濾器在使用前應充分干燥。（5）

15、為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率，應注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。（6）供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量一般為100ml。（7）總沖洗量一般不超過500ml，最多不得超過1000ml，以避免濾膜上的微生物受損傷。（8）取照上述“供試液的制備”“接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活”制備的供試液適量(一般取相當于1g、1ml或10cm的供試品，若供試品中所含的菌數(shù)較多時，供試液可酌情減量)，加至適量的稀釋液中，混勻，過濾。（9）用適量的沖洗液沖洗濾膜。（10）若測定需氧菌總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上；若測定霉菌和酵母總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝

16、上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上。（12）按表3規(guī)定條件培養(yǎng)、計數(shù)。（13）每株試驗菌每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。（14）同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)。3、MPN法MPN法的精密度和準確度不及薄膜過濾法和平皿計數(shù)法，僅在供試品需氧菌總數(shù)沒有適宜計數(shù)方法的情況下使用，本法不適用于霉菌計數(shù)。若使用MPN法，按下列步驟進行。（1）取照上述“供試液的制備”“接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活”制備的供試液至少3個連續(xù)稀釋級，每一稀釋級取3份1ml分別接種至3管裝有910ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，同法測定菌液對照組菌數(shù)。（2）必要時可在培養(yǎng)基中加入表面活性劑、中和劑或滅活劑。（3）接種管置3

17、035培養(yǎng)不超過3天，逐日觀察各管微生物生長情況。（4）如果由于供試品的原因使得結(jié)果難以判斷，可將該管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，在相同條件下培養(yǎng)12天，觀察是否有微生物生長。（5）根據(jù)微生物生長的管數(shù)查被測供試品1g、1ml或10cm中需氧菌總數(shù)的最可能數(shù)。結(jié)果判斷（1）計數(shù)方法適用性試驗中，釆用平皿法或薄膜過濾法時，試驗組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值應在0.52范圍內(nèi)。（2）采用MPN法時，試驗組菌數(shù)應在菌液對照組菌數(shù)的95%置信限內(nèi)。（3）若各試驗菌的回收試驗均符合要求，照所用的供試液制備方法及計數(shù)方法進行該供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌

18、和酵母菌總數(shù)計數(shù)。（4）方法適用性確認時，若釆用上述方法還存在一株或多株試驗菌的回收達不到要求，那么選擇回收最接近要求的方法和試驗條件進行供試品的檢查。供試品檢查（1）檢驗量檢驗量即一次試驗所用的供試品量（g、ml或cm）。1）一般應隨機抽取不少于2個最小包裝的供試品，混合，取規(guī)定量供試品進行檢驗。2）除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗量為10g或10ml；膜劑、貼劑和貼膏劑為100cm。3）檢驗時，應從2個以上最小包裝單位中抽取供試品，大蜜丸不得少于4丸，膜劑、貼劑和貼膏劑不得少于4片。4）貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗量可以酌減。5）若供試品處方中每一劑量單位（如片劑、膠囊劑）活性物質(zhì)含量小于或

19、等于1mg，或每1g或每1ml（指制劑）活性物質(zhì)含量低于1mg時，檢驗量應不少于10個劑量單位或10g或10ml供試品；若樣品量有限或批產(chǎn)量極?。ㄈ纾盒∮?000ml或1000g）的活性物質(zhì)供試品，除另有規(guī)定外，其檢驗量最少為批產(chǎn)量的1%，檢驗量更少時需要進行風險評估；若批產(chǎn)量少于200的供試品，檢驗量可減少至2個單位；批產(chǎn)量少于100的供試品，檢驗量可減少至1個單位。（2）供試品的檢查1）按計數(shù)方法適用性試驗確認的計數(shù)方法進行供試品中需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的測定。2）胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基用于測定需氧菌總數(shù)；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于測定霉菌和酵母菌總數(shù)。3）陰性對照

20、試驗：以稀釋液代替供試液進行陰性對照試驗，陰性對照試驗應無菌生長；如果陰性對照有菌生長，應進行偏差調(diào)查。平皿法平皿法包括傾注法和涂布法。除另有規(guī)定外，取規(guī)定量供試品，按方法適用性試驗確認的方法進行供試液制備和菌數(shù)測定，每稀釋級每種培養(yǎng)基至少制備2個平板。（1）培養(yǎng)和計數(shù)1）除另有規(guī)定外，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板在3035培養(yǎng)35天，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板在2025培養(yǎng)57天，觀察菌落生長情況，點計平板上生長的所有菌落數(shù)，計數(shù)并報告。2）菌落蔓延生長成片的平板不宜計數(shù)。3）點計菌落數(shù)后，計算各稀釋級供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報告規(guī)則報告菌數(shù)。4）若同稀釋級兩個平板的菌落數(shù)平均值不小于15，則兩

21、個平板的菌落數(shù)不能相差1倍或以上。（2）菌數(shù)報告規(guī)則1）需氧菌總數(shù)測定宜選取平均菌落數(shù)小于300cfu的稀釋級、霉菌和酵母菌總數(shù)測定宜選取平均菌落數(shù)小于100cfu的稀釋級，作為菌數(shù)報告的依據(jù)。2）取最高的平均菌落數(shù)，計算1g、1ml或10cm供試品中所含的微生物數(shù)，取兩位有效數(shù)字報告。3）如各稀釋級的平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級的平板有菌落生長，但平均菌落數(shù)小于1時，以1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。薄膜過濾法除另有規(guī)定外，按計數(shù)方法適用性試驗確認的方法進行供試液制備。取相當于1g、1ml或10cm供試品的供試液，若供試品所含的菌數(shù)較多時，可取適宜稀釋級的供試液，照方法適用性試驗確認的方法加至適量稀釋液中，立即過