ELISA試驗(yàn)基本步驟及材料和試劑

1、一主要步驟包被ELISA 基本步驟和主要試劑、材料注意：本步驟為間接 ELISA 步驟取所要包被的物質(zhì)，提前設(shè)計(jì)好所需濃度，根據(jù)包被孔數(shù)計(jì)算所需包被物的量， 用包被液稀釋至所需體積，分加至各孔中。:ELISA 4過(guò)夜;372 4過(guò)夜。洗滌包被結(jié)束后棄掉包被液,用 PBST 進(jìn)行洗滌，方法為PBST 加滿每孔，靜置 510 min，棄掉洗液，重新加滿，重復(fù)洗滌 35 次，最后拍干 ELISA 板等待下一步封閉. 3 封 閉常用 10%小牛血清，取第 2 步的 ELISA 板加封閉液至每孔，體積至少為所加包437ELISA 可能不同。4 洗 滌封閉結(jié)束的 ELISA 板進(jìn)行洗滌，方法同步驟 2.最

2、后拍干等待加入一抗。5 加入一抗一抗即為你要檢測(cè)的物質(zhì)，一般加之前需要稀釋,具體稀釋倍數(shù)不同實(shí)驗(yàn) 不同需要自己摸索.一抗樣品一般用包被液稀釋，稀釋到所需濃度后加入到相應(yīng)孔中.反應(yīng)條件為 37孵育 2h。洗滌具體同步驟 4。HRP-標(biāo)記的商品化二抗HRP-標(biāo)記的二抗(如一抗為鼠源物質(zhì)則對(duì)應(yīng)加抗鼠二抗），一般也用封閉液稀釋,反應(yīng) 5h。洗滌具體同步驟 4.顯色OPD作為顯色底物,OPDTMB8進(jìn)行到一半使配置顯色液,10ml底物0015g OPD（OPD有毒不方便稱量故只需稍微加入一點(diǎn)即可OPD8150ul 3%過(guò)氧化氫溶液加入之前配10mlELISAELISA板置于3710min。終止將 ELI

3、SA 板取出，每孔加終止液（2mol/L 硫酸溶液）上讀數(shù)（OPD490nm，TMB450nm）。二 材料、試劑ELISA板EILSAELISA81296孔式,需要購(gòu)買.常用聚苯乙烯和聚氯乙烯材料。注意：聚苯乙烯材料目前只有進(jìn)口，特點(diǎn)是孔大,加滿約 300ul,此時(shí)實(shí)驗(yàn)中所加各試劑（液等）均為 100ul 體積。而聚氯乙烯多為國(guó)產(chǎn)，孔較小，加滿約 200ul，此時(shí)各試劑 50ul體積即可。各試劑配制包被液（PH6。3 的碳酸鹽緩沖液無(wú)水Na2CO30.1696gNaHCO30。SW100ml完全溶解至 4，一周內(nèi)使用PBST配方NaCl8。0gNa2HPO4。12H2O2。KCl0.2gKH2

4、PO40.24gTW200.5mlSW1000ml底物緩沖液Na2HPO43.682g檸檬酸1.02gDW200ml不需滅菌，4保存4）3% H2O230%H2O2SW900ml5）顯色劑底物緩沖劑10ml 3H2O2OPD15mgH2O2最后加6)終止液濃硫酸：SW = 1：8SW 中，并攪拌散熱三注意事項(xiàng)包被所謂 37反應(yīng)，一般取一個(gè) 37的水浴鍋,在水面放一較大泡沫板，將 ELISA 37反應(yīng)操作同此；ELISA過(guò)程中所有需要較長(zhǎng)時(shí)間等待的步驟（二抗孵育）ELISA 包起來(lái)再放入冰箱或水浴鍋中,EP 手套套起來(lái)即可.洗滌最常規(guī)的洗滌步驟是洗滌 3 次,每次間隔 5min，具體實(shí)驗(yàn)可能會(huì)微調(diào),36 5-10min 不等;ELISA 3顯 色3ELISA板中，即在加過(guò)氧化氫前要完全完成