手足口病的實(shí)驗(yàn)診斷課件

手足口病的實(shí)驗(yàn)診斷安徽省疾病預(yù)防控制中心2009.3

.11手足口病的病原手足口?。╤and-foot-mouthdisease,HFMD）由人腸道病毒感染引起。人腸道病毒為小RNA病毒科（Picornaviridae），腸道病毒屬（Enterovirus）的一組單股正鏈RNA病毒。其中包括?？刹《荆?1個血清型）、柯薩奇病毒A組（23個血清型）和B組（5個血清型），還包括3個脊髓灰質(zhì)炎病毒血清型和人腸道病毒68-71型。

CourtesyofLindaM.Stannard,UniversityofCapeTown,S.A.h~30nm二十面體對稱無包膜人腸道病毒的毒粒結(jié)構(gòu)人腸道病毒發(fā)現(xiàn)的歷史脊髓灰質(zhì)炎病毒：1909年首次鑒定出該病毒，1949年，利用細(xì)胞培養(yǎng)的方法增殖病毒，為疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)?？滤_奇病毒：1948年在美國紐約Coxsackie鎮(zhèn)，將兩名麻痹患兒的標(biāo)本接種至乳鼠體內(nèi)，分離出來的一組病毒定名為柯薩奇病毒。根據(jù)它們在乳鼠上產(chǎn)生的組織病理學(xué)變化和在細(xì)胞培養(yǎng)上的能力，分為柯薩奇病毒A組和B組。埃可病毒：1951年在一名無癥狀的兒童的糞便標(biāo)本中分離到，在細(xì)胞培養(yǎng)上可以造成致細(xì)胞病變，但對乳鼠和靈長類動物不致病。新腸道病毒：隨后新發(fā)現(xiàn)的病毒被按照序號命名（69~71），最近，已經(jīng)命名至102型腸道病毒主要血清型腸道病毒的抵抗力腸道病毒無包膜，乙醚、75%酒精、表面活性劑等均不能將其滅活。對紫外線及干燥敏感；各種氧化劑（高錳酸鉀、漂白粉等）、甲醛或56℃30min都能滅活病毒病毒在4℃可存活1年，-20℃可長期保持感染性病毒RNA有感染性。（一）糞便標(biāo)本采集病人發(fā)病7日內(nèi)的糞便標(biāo)本，用于病原檢測。糞便標(biāo)本采集量5～8g/份，采集后立即放入無菌采便管內(nèi)，4℃暫存立即(12h內(nèi))送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標(biāo)本存于－70℃冰箱。（二）腦脊液標(biāo)本出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的病例，要采集腦脊液標(biāo)本，進(jìn)行病原和抗體檢測。采集時間為出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀后3日內(nèi)，采集量為1.0～2.0ml。采集后立即裝入無菌帶墊圈的凍存管中，4℃暫存立即(12h內(nèi))送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標(biāo)本存于－70℃冰箱。手足口病的標(biāo)本采集（五）皰疹液可同時采集多個皰疹作為一份標(biāo)本，用消毒針將皰疹挑破用棉簽蘸取皰疹液，迅速將棉簽放入內(nèi)裝有3～5ml保存液（維持液或生理鹽水）的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封。所采集標(biāo)本4℃暫存立即(12h內(nèi))送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標(biāo)本存于－70℃冰箱。手足口病的標(biāo)本采集標(biāo)本采集器械要求注射器：醫(yī)用（5ml和10ml）一次性注射器棉拭子：塑料桿全血收集管：10ml螺口塑料管(外螺旋、帶密封墊圈)血清保存管：2ml螺口塑料管(外螺旋、帶密封墊圈)，可耐深低溫（液氮保存）糞便保存管：5-20ml螺口塑料管(外螺旋、帶密封墊圈)，可耐深低溫（液氮保存）-全國POLIO網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室鼻咽拭子保存管：10ml螺口塑料管(外螺旋、帶密封墊圈)，可耐深低溫（液氮保存）痰液保存管：50ml螺口塑料管(外螺旋、帶密封墊圈)，可耐深低溫（液氮保存）尸檢組織凍存管：50ml螺口塑料管(外螺旋、帶密封墊圈)；尸檢（每一個樣品換手術(shù)刀）記號筆：油性，防水標(biāo)本采集器械要求病人標(biāo)本的采集運(yùn)輸和保藏標(biāo)本采集注意事項為了保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和有效性，標(biāo)本應(yīng)在病例發(fā)病后盡早采集，盡快檢測。不能立即檢測的標(biāo)本應(yīng)冷凍保存。對于血清學(xué)診斷，急性期血清應(yīng)該在發(fā)病后盡早采集，恢復(fù)期血清在發(fā)病2-4周后采集。手足口病的診斷一般是通過采集適當(dāng)?shù)呐R床標(biāo)本后進(jìn)行基因檢測、抗原檢測、血清學(xué)抗體檢測、病毒分離和病鑒定手足口病的實(shí)驗(yàn)室診斷標(biāo)本病毒分離CPE陽性RT-PCR及序列測定腸道病毒非腸道病毒測雙份血清中和抗體滴度RT-PCRRealtimeRT-PCR檢測病毒核酸序列測定無CPE常規(guī)實(shí)驗(yàn)補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)中和定型手足口病的實(shí)驗(yàn)室檢測流程病毒分離培養(yǎng)用于病毒分離的標(biāo)本：

包括糞便、咽拭子和皰疹液，如果患者出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，可以采集腦脊液標(biāo)本適用的細(xì)胞RD細(xì)胞（人胚胎橫紋肌肉瘤細(xì)胞）、Hep-2細(xì)胞（人喉上皮癌細(xì)胞）病毒分離培養(yǎng)標(biāo)本的處理1、糞便：2g加PBS10ml，振蕩混勻，1500g低溫離心20min，上清0.2ml接種敏感細(xì)胞2、咽拭子：于采樣管中充分洗滌拭子，4℃下10000rpm離心20min，上清0.2ml接種敏感細(xì)胞3、腦脊液和皰疹液：直接接種病毒分離培養(yǎng)培養(yǎng)觀察：36℃培養(yǎng)逐日觀察，第1代培養(yǎng)見可疑CPE至觀察滿7天后再繼續(xù)凍融傳代，待穩(wěn)定CPE出現(xiàn)后,-20℃或-70℃凍存以備進(jìn)一步鑒定；如果7天之后沒有出現(xiàn)CPE，需盲傳2代繼續(xù)觀察，盲傳2代后仍不出現(xiàn)CPE則判定為陰性；鑒定：中和試驗(yàn)血清抗體檢測方法中和實(shí)驗(yàn)、ELISAIgM：單份血：急性期IgG：雙份血：急性期，恢復(fù)期陰轉(zhuǎn)陽，四倍升高，四倍降低均可診斷近期感染病毒核酸檢測—RT-PCRRT-PCR(ReverseTranscriptasePCR)用于RNA病毒的檢測，酶促催化使RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，逆轉(zhuǎn)錄與第一次PCR在同一系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行，逆轉(zhuǎn)錄完成后，加熱滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，然后開始PCR擴(kuò)增。一條寡聚脫氧核苷酸引物先與mRNA雜交，然后由依賴RNA的DNA聚合酶催化合成相應(yīng)互補(bǔ)的cDNA拷貝，后者能進(jìn)一步用于PCR擴(kuò)增。

糞便標(biāo)本：采用氯仿進(jìn)行處理。

肛拭子/咽拭子標(biāo)本：咽拭子要在標(biāo)本保存液中充分?jǐn)噭?，然后?℃下，10000rpm離心20min。

皰疹液和腦脊液：直接用于RNA提取。標(biāo)本的預(yù)處理可使用商業(yè)化試劑盒從臨床標(biāo)本中提取病毒RNA

簡化操作、規(guī)范方法、條件一致、排除干擾QIAGENViralRNAMiniExtractionKit（CAT：52904）適合臨床標(biāo)本和病毒培養(yǎng)物標(biāo)本QIAGENRneasyMiniKit（CAT：74104）適合組織和咽拭子標(biāo)本RNA的提取EV71核酸檢測引物序列：EV71-S（上游）：5`-

GCAGCCCAAAAGAACTTCAC-3`EV71-A（下游）：5`-

ATTTCAGCAGCTTGGAGTGC-3`引物CA16核酸檢測引物序列：CoxA16-S（上游）：5`-ATTGGTGCTCCCACTACAGC-3`CoxA16-A（下游）；5`-TCAGTGTTGGCAGCTGTAGG-3`引物根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況建立各自RT-PCR反應(yīng)體系配下列試劑主溶液：10×PCRBuffer（含Mg2+）·················································5.0μldNTPs（2.5mMeach）·······················································2.0μl上游引物（0.1μg/μl）························································1.0μl下游引物（0.1μg/μl）························································1.0μlRNA酶抑制劑（RNasin,40U/μl）······································0.5μlTaqDNA聚合酶（5U/μl）·················································0.5μlAMV逆轉(zhuǎn)錄酶（10U/μl）··················································1.0μl模板RNA··········································································3.0μlRNaseFreedH2O···························································36.0μl

50.0μl反應(yīng)體系在PCR儀上進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)步驟如下：42℃························45min95℃························3min95℃························20s50℃························25s×32個循環(huán)

72℃························30s72℃························10min4℃························Soak溫度循環(huán)參數(shù)通過比較標(biāo)本的PCR產(chǎn)物與陽性對照的PCR產(chǎn)物在凝膠上的位置以及大小來解釋結(jié)果。結(jié)果解釋RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果解釋實(shí)驗(yàn)室診斷原則人腸道病毒在自然界廣泛存在且種類繁多，一病多原、一原多癥是腸道病毒感染的重要特征。因而應(yīng)對血清診斷及病原診斷的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果作嚴(yán)格評價，必須結(jié)合臨床癥狀及環(huán)境因素流行病學(xué)分析，以確立病毒與疾病的病原學(xué)關(guān)系。一般采取的原則為：（1）病毒分離陽性率遠(yuǎn)高于對照人群；（2）病程中有特異性抗體變化并排除其他病毒感染；（3）從病變組織中分離出病毒。從疑為腸道病毒感染的腦炎/腦膜炎患者的腦脊液中檢測到相應(yīng)的腸道病毒核酸（RT-PCR法），或分離到病毒或腸道病毒IgM陽性，即可證明是該腸道病毒引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染。從疑為死于EV71（或其它腸道病毒）的尸檢標(biāo)本中檢測到相應(yīng)的腸道病毒核酸，或分離到病毒或腸道病毒IgM陽性，即可證明是該腸道病毒是病因。從HFMD患者的皰疹液中檢測到相應(yīng)的腸道病毒核酸，或分離到病毒，那么該病毒就是病因病原。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的診斷意義實(shí)驗(yàn)結(jié)果的診斷意義當(dāng)無法進(jìn)行病毒分離或未分離到病毒時，血清學(xué)診斷方法可以作為病毒感染的間接證據(jù)。腸道病毒有時引起無癥狀感染，只從個別HFMD患者糞便標(biāo)本中分離到EV71（或其它腸道病毒）時，不能輕易下結(jié)論EV71是病因，應(yīng)該擴(kuò)大樣本量，所以實(shí)驗(yàn)結(jié)果的實(shí)際意義應(yīng)結(jié)合臨床過程和流行病學(xué)資料進(jìn)行解釋。手足口病檢測實(shí)驗(yàn)室相關(guān)問題1、實(shí)驗(yàn)室生物安全問題：必須重視的問題實(shí)驗(yàn)人員受過生物安全培訓(xùn)①有防范潛在生物危害的意識②熟悉生物安全規(guī)程，掌握生物安全技能實(shí)驗(yàn)室自己的生物安全指南合格的生物安全實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室文件化的規(guī)程及方法（包括常規(guī)的和特殊的）2、PCR實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制問題：保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠的必要手段實(shí)驗(yàn)對照：陽性、陰性、試