DNA的生物合成名師優(yōu)質(zhì)課賽課一等獎市公開課獲獎課件

DNA生物合成(復制)DNABiosynthesis，Replication

第九章第1頁中心法則（centraldogma）遺傳信息傳遞方向規(guī)律基因表示：是指將遺傳信息由DNA轉(zhuǎn)錄為RNA、再翻譯成蛋白質(zhì)過程第2頁第3頁復制(replication)是指遺傳物質(zhì)傳代，以母鏈DNA為模板合成子鏈DNA過程。復制親代DNA子代DNA第4頁復制基本規(guī)律BasicRulesofDNAReplication

第一節(jié)第5頁一、半保留復制試驗依據(jù)和意義DNA生物合成時，母鏈DNA解開為兩股單鏈，各自作為模板(template)按堿基配對規(guī)律，合成與模板互補子鏈。子代細胞DNA，一股單鏈從親代完整地接收過來，另一股單鏈則完全從新合成。兩個子細胞DNA都和親代DNA堿基序列一致。這種復制方式稱為半保留復制。半保留復制概念第6頁AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母鏈DNA

復制過程中形成復制叉子代DNA

目錄第7頁密度梯度試驗

——試驗結(jié)果支持半保留復制構(gòu)想。含重氮N15-DNA細菌培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第一代繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第二代梯度離心結(jié)果第8頁按半保留復制方式，子代DNA與親代DNA堿基序列一致，即子代保留了親代全部遺傳信息，表達了遺傳保守性。半保留復制意義遺傳保守性，是物種穩(wěn)定性分子基礎，但不是絕正確。第9頁二、雙向復制原核生物復制時，DNA從起始點(origin)向兩個方向解鏈，形成兩個延伸方向相反復制叉，稱為雙向復制。復制中放射自顯影圖象第10頁Cairns復制模型—θ型復制第11頁第12頁A.環(huán)狀雙鏈DNA及復制起始點B.復制中兩個復制叉C.復制靠近終止點(termination,ter)oriterABC第13頁5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’復制子3’第14頁（2）起始點和方向

①原核生物和真核生物復制都是在DNA分子特定位置起始，如大腸桿菌起始點有固定重復保守次序，可被酶識別。

②方向：大多是雙向、對稱復制,也有單向或不對稱。

③速度：原核生物復制叉移動快(約105bp/min);

真核生物復制叉移動慢

(約5×102～5×103bp/min)第15頁復制起始點、復制子與復制叉（動畫演示）第16頁三、復制半不連續(xù)性3535解鏈方向3′5′3′3′5′領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)隨從鏈(laggingstrand)第17頁順著解鏈方向生成子鏈，復制是連續(xù)進行，這股鏈稱為領(lǐng)頭鏈(前導鏈）。另一股鏈因為復制方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長，這股不連續(xù)復制鏈稱為隨從鏈（后隨鏈、滯后鏈）。復制中不連續(xù)片段稱為岡崎片段(okazakifragment)。

領(lǐng)頭鏈連續(xù)復制而隨從鏈不連續(xù)復制，就是復制半不連續(xù)性。

第18頁參加DNA復制物質(zhì)底物(substrate):

dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):

依賴DNADNA聚合酶，簡寫為DNA-pol模板(template):

解開成單鏈DNA母鏈引物(primer):

提供3’-OH末端使dNTP能夠依次聚合

其它酶和蛋白質(zhì)因子第19頁一、復制化學反應

(dNMP)n

+dNTP→(dNMP)n+1

+PPi

目錄第20頁聚合反應特點

除了底物和酶外，DNA新鏈生成需引物和模板；新鏈延長只可沿5’→3’方向進行。第21頁二、DNA聚合酶全稱：依賴DNADNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)簡稱：DNA-pol活性：1.5'→3'

聚合酶活性2.核酸外切酶活性第22頁第23頁5′AGCTTCAGGATA

3′

|||||||||||3′TCGAAGTCCTAGCGAC5′3'→5'外切酶活性

5'→3'外切酶活性?能切除突變DNA片段。能識別錯配堿基對，并將其水解。

核酸外切酶活性目錄第24頁第25頁第26頁第27頁第28頁第29頁第30頁功效：

①

5′→3′聚合酶活性；酶與模板結(jié)合后構(gòu)象改變，識別堿基，正確配對后才發(fā)揮聚合作用②

3′→

5′外切酶活性；主要是對新生DNA鏈進行校對，預防“錯配”③

5′→3′外切酶活性。主要是對DNA損傷修復，以及在DNA復制時RNA引物切除及其空隙填補

可見，DNApolⅠ是1個多功效酶第31頁323個氨基酸小片段5'→3'核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604個氨基酸DNA聚合酶活性3'→5'核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是試驗室合成DNA，進行分子生物學研究中慣用工具酶。

第32頁功效是原核生物復制延長中真正起催化作用酶。

DNA-polⅢ(250kD)第33頁第34頁α亞基含有5′→3′方向合成DNA催化活性ε亞基含有3′→5′外切酶活性，起校對功效，可提升聚合酶Ⅲ復制DNA保真性亞基可能起組建作用β亞基如同夾子，功效是識別引物、夾住DNA

分子向前滑動亞基起著促使關(guān)鍵酶二聚化作用其余亞基組成-復合物，主要功效是幫助亞基夾住DNA（也稱夾子裝置器），并有增強關(guān)鍵酶活性作用第35頁（二）真核生物DNA聚合酶DNA-pol起始引發(fā)，有引物酶活性。延長子鏈主要酶，有解螺旋酶活性。參加低保真度復制。在復制過程中起校讀、修復和填補缺口作用。在線粒體DNA復制中起催化作用。DNA-polDNA-polDNA-polDNA-pol第36頁第37頁（一）解螺旋酶、引物酶和單鏈DNA結(jié)合蛋白第38頁解螺旋酶(helicase)——利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈引物酶(primase)——復制起始時催化生成RNA引物酶單鏈DNA結(jié)合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)——在復制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護單鏈完整

第39頁拓撲異構(gòu)酶作用特點既能水解、又能連接磷酸二酯鍵

拓撲異構(gòu)酶Ⅰ

拓撲異構(gòu)酶Ⅱ分類第40頁第41頁第42頁第43頁第44頁第45頁五、DNA連接酶連接DNA鏈3-OH末端和相鄰DNA鏈5-P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰DNA鏈連接成一條完整鏈。以NＡＤ＋（大腸桿菌）或ＡＴＰ（真核細胞）為能源。DNA連接酶(DNAligase)作用方式第46頁HO5’3’3’5’DNA連接酶ATPADP5’3’5’3’目錄第47頁第48頁DNA連接酶在復制中起最終接合缺口作用。在DNA修復、重組及剪接中也起縫合缺口作用。也是基因工程主要工具酶之一。功效第49頁（一）復制起始需要處理兩個問題：1.DNA解開成單鏈，提供模板。2.合成引物，提供3-OH末端。一、原核生物DNA生物合成

第50頁原核生物E.coli為例復制由起始點oriC(origin)開始雙向復制E.coli復制起始點oriC（245bpDNA組分）序列分析有以下特點

3組串連重復序列(13bp），每個次序都由GATC開始

2組反向重復序列(9bp)4個dnaA蛋白結(jié)合部位第51頁1、拓撲異構(gòu)酶解開超螺旋。2、DnaA蛋白識別并在ATP存在下結(jié)合于四個9bp重復序列。3、在類組蛋白（HU、ATP參加下,DanA蛋白變性13個bp重復序列,形成開鏈復合物。4、DnaB借助于水解ATP產(chǎn)生能量在DnaC幫助下沿5’→3’

方向移動，解開DNA雙鏈，形成前引發(fā)復合物。5、單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合于單鏈。6、引物合成酶（DnaG蛋白）開始合成RNA引物。第52頁第53頁第54頁DnaADnaB、DnaCDNA拓撲異構(gòu)酶引物酶SSB3535引發(fā)體和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA復制起始區(qū)域復合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。

第55頁3535引物是由引物酶催化合成短鏈RNA分子。

引物3'HO5'引物酶第56頁第57頁

DNA復制調(diào)控是在起始階段進行，一旦復制起始，它就會繼續(xù)下去直到整個復制子完成復制。復制起點是以一條鏈為模板起始DNA合成一段序列。有時，兩條鏈復制起點并不在同一點上（不對稱復制，如D環(huán)復制）。在一個完整細胞周期中，每一個復制起點只使用一次，完成一次復制過程。多數(shù)生物復制起點，都是富含A.T。第58頁（二）復制延長復制延長指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP方式逐一加入引物或延長中子鏈上，其化學本質(zhì)是磷酸二酯鍵不停生成。

第59頁5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol目錄第60頁領(lǐng)頭鏈合成目錄第61頁隨從鏈合成目錄第62頁第63頁第64頁第65頁第66頁第67頁原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復制復制片段在復制終止點(ter)處匯合。oriter

E.coli8232oriterSV40500（三）復制終止第68頁

細菌復制終止區(qū)含有多個約22bp終止子(terminator)位點，E.coli有7個終止子位點。第69頁

新合成兩條染色體DNA分子相互連在一起，被拓撲異構(gòu)酶IV分離第70頁DNA復制分子機制基本特點復制結(jié)果是半保留復制，復制過程是半不連續(xù)復制。復制以復制單位進行，起始于特定位點（復制起點）。復制能夠是單向，也能夠是雙向，后者更為常見。復制時，DNA兩條鏈都從5′端向3′端延伸。第71頁前導鏈是連續(xù)合成，而后續(xù)鏈是不連續(xù)合成。DNA合成始于RNA引物合成，所以前導鏈只有一次RNA合成，滯后鏈岡崎片斷每個都有RNA引物合成。RNA引物隨后由DNA片段替換，相鄰DNA片段連接形成一條完整DNA鏈。DNA聚合酶校對功能和細胞錯誤修復功能維持DNA分子準確性和忠實性。第72頁哺乳動物細胞周期DNA合成期G1G2SM二、真核生物DNA生物合成

?細胞能否分裂，決定于進入S期及M期這兩個關(guān)鍵點。G1→S及G2→M調(diào)整，與蛋白激酶活性相關(guān)。?蛋白激酶經(jīng)過磷酸化激活或抑制各種復制因子而實施調(diào)控作用。第73頁?真核生物每個染色體有多個起始點，是多復制子復制。復制有時序性，即復制子以分組方式激活而不是同時起動。?復制起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）參加。還需拓撲酶和復制因子(replicationfactor,RF)。?增殖細胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen,PCNA)在復制起始和延長中起關(guān)鍵作用。（一）復制起始第74頁3553領(lǐng)頭鏈3535親代DNA隨從鏈引物核小體（二）復制延長第75頁染色體DNA呈線狀，復制在末端停頓。復制中岡崎片段連接，復制子之間連接。染色體兩端DNA子鏈上最終復制RNA引物，去除后留下空隙。（三）復制終止第76頁53355335+5333355目錄第77頁諾貝爾生理學/醫(yī)學獎：端粒和端粒酶怎樣保護染色體第78頁端粒(telomere)指真核生物染色體線性DNA分子末端結(jié)構(gòu)。功效?維持染色體穩(wěn)定性?維持DNA復制完整性結(jié)構(gòu)特點?由末端單鏈DNA序列和蛋白質(zhì)組成。?末端DNA序列是屢次重復富含G、C堿基短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…第79頁端粒酶(telomerase)端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶協(xié)同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)

組成第80頁端粒酶爬行模型（動畫演示）第81頁第82頁真核生物DNA復制特點4、真核生物染色體在全部復制完之前起點不再重新開始復制；而在快速生長原核生物染色體DNA復制中，起點可以連續(xù)發(fā)動復制。真核生物快速生長時，往往采取更多復制起點。1、真核生物染色體有多個復制起點，稱為自主復制序列（ARS）或復制基因(replicator);多復制眼，呈雙向復制，多復制子。2、岡崎片段長約200bp。3、真核生物DNA復制速度比原核慢，速度為1000～

3000bp/min(僅為原核生物1/20～1/50）。第83頁5、真核生物有各種DNA聚合酶,DNA聚合酶Ⅲ（δ）是真正復制酶，在PCNA存在下有連續(xù)合成能力。PCNA稱為增殖細胞核抗原，相當于大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲβ-夾子，RFC蛋白相當于夾子裝配器。6、真核生物線性染色體兩端有端粒結(jié)構(gòu)，它是由許多成串重短復序列組成，端粒功效是穩(wěn)定染色體末段結(jié)構(gòu)，預防染色體間末端連接，并可賠償滯后鏈5’-末段在消除RNA引物后造成空缺，使染色體保持一定長度。端粒酶是含一段RNA逆轉(zhuǎn)錄酶.7、RPA：真核生物單鏈結(jié)合蛋白；RNaseH1和MF-1切除RNA引物，DNA聚合酶ε填補缺口。第84頁最少依賴三種機制1、恪守嚴格堿基配對規(guī)律2、聚合酶在復制延長中對堿基選擇功效（按模板要求選擇底物）3、復制犯錯時有即時校讀功效復制忠實性確保第85頁核酸生物合成三、DNA復制調(diào)控

原核生物DNA甲基化以及與細胞質(zhì)膜相互作用能夠影響復制起始時間。酶：Dam甲基化酶（腺嘌呤甲基化酶）位點：GATC中腺嘌呤N6位方式：游離oriC第86頁核酸生物合成復制時間與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA甲基化以及轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)。通常活性區(qū)先復制，異染色質(zhì)區(qū)晚復制。復制許可因子（replicationlicensingfactor）所控制.該因子為復制起始所必需，但一旦復制起始后它即被滅活或者降解。因為該因子不能經(jīng)過核膜，只能經(jīng)過有絲分裂在重建核結(jié)構(gòu)時才能進入核內(nèi)并作用于染色體復制起點，這使其僅在有絲分裂后期才能與復制起點相互作用。真核生物復制起始是受各種因子調(diào)控，這些因子磷酸化和去磷酸化直接影響著復制起始。第87頁逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)逆轉(zhuǎn)錄(reversetranscription)RNADNA

逆轉(zhuǎn)錄酶一、逆轉(zhuǎn)錄病毒和逆轉(zhuǎn)錄酶

第88頁逆轉(zhuǎn)錄病毒細胞內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象RNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA雜化雙鏈RNA酶單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶雙鏈DNA第89頁逆轉(zhuǎn)錄酶

AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT分子生物學研究可應用逆轉(zhuǎn)錄酶，作為獲取基因工程目標基因主要方法之一，此法稱為cDNA法。

以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成與mRNA堿基序列互補DNA鏈。試管內(nèi)合成cDNAcDNAcomplementaryDNA第90頁DNA損傷（DNAdamage）指一個或多個脫氧核苷酸組成、復制或表型功效異常改變，也稱DNA損傷，又稱突變（mutation）突變結(jié)果引發(fā)遺傳信息改變。

DNA突變(損傷)大多數(shù)是自發(fā)，是進化與分化基礎。原因：自發(fā)突變誘發(fā)突變第91頁引發(fā)突變原因物理原因紫外線(ultraviolet,UV)、各種輻射

UV第92頁化學原因目錄第93頁突變分子改變類型錯配(mismatch)缺失(deletion)插入(insertion)重排(rearrangement)框移(frame-shift)

第94頁DNA分子上堿基錯配稱點突變(pointmutation)。發(fā)生在同型堿基之間，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。1.轉(zhuǎn)換發(fā)生在異型堿基之間，即嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤。

2.顛換（一）錯配第95頁鐮形紅細胞貧血病人Hb(HbS)β亞基N-val

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his

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leu

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thr

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pro·

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glu

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C肽鏈CACGTG基因正常成人Hb(HbA)β亞基N-val

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his

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leu

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pro·

glu

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glu

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·

C肽鏈CTCGAG基因第96頁（二）缺失、插入和框移缺失：一個堿基或一段核苷酸鏈從DNA大分子上消失。插入：原來沒有一個堿基或一段核苷酸鏈插入到DNA大分子中間。框移突變是指三聯(lián)體密碼閱讀方式改變，造成蛋白質(zhì)氨基酸排列次序發(fā)生改變。

缺失或插入都可造成框移突變

。第97頁谷酪蛋絲5’……GCA

GUA

CAU

GUC……丙纈組纈正常5’……GAG

UAC

AUG

UC……缺失C缺失引發(fā)框移突變第98頁-----第99頁（三）重排DNA分子內(nèi)較大片段交換，稱為重組或重排。

第100頁由基因重排引發(fā)兩種