醫(yī)學(xué)基因工程的工具酶課件

基因工程的工具酶基因工程的工具酶基因工程的工具酶〔instrumentalenzymeofgeneengineering〕是應(yīng)用于基因工程各種酶的總稱，包括核酸序列分析、標(biāo)記探針制備、載體構(gòu)建、目的基因制取、重組體DNA制備等所需要的酶類。基因工程的工具酶〔instrumentalenzymeo核酸酶：能夠?qū)⒕酆塑账徭湹牧姿岫ユI切斷的酶，屬于水解酶。核酸酶：能夠?qū)⒕酆塑账徭湹牧姿岫ユI切斷的酶，屬于水解酶。核酸酶的分類：1〕根據(jù)核酸底物分RNA酶〔Rnase〕、DNA酶〔Dnase〕和底物非專一性核酸酶；2〕根據(jù)作用方式分內(nèi)切核酸酶〔endonuclease〕和外切核酸酶〔exonuclease〕；3)根據(jù)對底物堿基專一性分堿基專一性核酸酶〔切割部位的堿基序列高度專一性〕和非堿基專一性核酸酶〔切割部位的堿基序列隨機(jī)性〕核酸酶的分類：〖醫(yī)學(xué)〗基因工程的工具酶課件〖醫(yī)學(xué)〗基因工程的工具酶課件在限制修飾系統(tǒng)中，限制作用是指一定類型的細(xì)菌可以通過限制性核酸內(nèi)切酶的作用，破壞入侵的外源DNA(如噬菌體DNA等)，使得外源DNA對生物細(xì)胞的入侵受到限制；而生物細(xì)胞(如宿主)自身DNA分子通過甲基化酶的作用，在堿基特定位置上發(fā)生了甲基化，可免遭自身限制性內(nèi)切酶的破壞。

限制－修飾作用實(shí)際就是細(xì)菌中的限制性內(nèi)切酶降解外源DNA，維護(hù)自身遺傳穩(wěn)定的保護(hù)機(jī)制。

在限制修飾系統(tǒng)中，限制作用是指一定類型

用于核酸操作的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA聚合酶DNA連接酶核酸修飾酶核酸酶用于核酸操作的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA聚合酶DNA限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及其生物功能識別雙鏈DNA分子中的特定序列，并切割DNA雙鏈主要存在于原核細(xì)菌中，幫助細(xì)菌限制外來DNA的入侵細(xì)菌的限制與修飾作用1968年，Smith等人首先從流感嗜血桿菌d株中別離出HindⅡ和Hind

Ⅲ

限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及其生物功能識別雙鏈D限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的類型主要特性I型II型III型限制修飾多功能單功能雙功能蛋白結(jié)構(gòu)異源三聚體同源二聚體異源二聚體輔助因子ATPMg2+SAMATPMg2+SAMMg2+識別序列TGAN8TGCT旋轉(zhuǎn)對稱序列GAGCCAACN6GTGCCAGCAG切割位點(diǎn)距識別序列1kb處識別序列內(nèi)或附近距識別序列下游隨機(jī)性切割特異性切割24-26bp處限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的類型主要特性限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的命名屬名種名株名Hind

Ⅲ

Hind

ⅡHaemophilusinfluenzae

d

嗜血流感桿菌d株同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的命名屬名限制性核酸內(nèi)切酶II型限制性核酸內(nèi)切酶的根本特性識別雙鏈DNA分子中4-8對堿基的特定序列大局部酶的切割位點(diǎn)在識別序列內(nèi)部或兩側(cè)識別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對稱型回文結(jié)構(gòu)5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’EcoRⅠ的識別序列EcoRⅠ的切割位點(diǎn)限制性核酸內(nèi)切酶II型限制性核酸內(nèi)切酶的根本特性識別雙鏈D回文結(jié)構(gòu)〔palindrome〕：序列正讀和反讀是一樣的，即有一個中心對稱軸，從這個軸朝兩個方向讀序列是完全一樣的。在切割位點(diǎn)處，限制性核酸內(nèi)切酶的作用下磷酸二酯鍵會發(fā)生水解效應(yīng)，從而導(dǎo)致鏈的斷裂?；匚慕Y(jié)構(gòu)〔palindrome〕：序列正讀和反讀是一樣的，即限制性核酸內(nèi)切酶的切割類型：〔1〕兩條鏈上的斷裂位置是交錯和對稱圍繞著一個對稱軸排列，這種形式的斷裂結(jié)果形成具有粘末端的DNA片段；〔2〕兩條鏈上的斷裂位置是處在一個對稱軸的中心，這樣形式的斷裂是形成具有平末端的DNA片段。限制性核酸內(nèi)切酶的切割類型：EcoRⅠ等產(chǎn)生的5’粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRⅠ37℃5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-GA-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-AG-C-T-C…5’OHPOHPEcoRⅠ等產(chǎn)生的5’粘性末端5‘…G-C-T-G-A-PstⅠ等產(chǎn)生的3’粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstⅠ37℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-AG-G-A-G…3’3‘…C-G-A-GA-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHPPstⅠ等產(chǎn)生的3’粘性末端5‘…G-C-T-C-T-GPvuⅡ等產(chǎn)生的平頭末端5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuⅡ37℃5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’PvuⅡ等產(chǎn)生的平頭末端5‘…G-C-T-C-A-G-C3.病毒性肺炎如冠狀病毒、腺病毒、流感病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒等。4.真菌性肺炎如白念珠菌、曲霉、放射菌等。5.其它病原體所致的肺炎如立克次體、弓形蟲、原蟲、寄生蟲如肺包蟲、肺吸蟲、肺血吸蟲〕等。機(jī)體免疫力低下者〔如艾滋病患者〕容易伴發(fā)肺部卡氏肺包子蟲、軍團(tuán)菌、鳥形分支桿菌、結(jié)核菌、弓形體等感染。6.理化因素所致的肺炎如放射性肺炎、胃酸吸入、藥物等引起的化學(xué)性肺炎等。7.支原體肺炎由肺炎支氣體引起。編輯本段發(fā)病原因

肺炎患肺炎的原因可能是：接觸到一些厲害的病菌或病毒身體抵抗力弱，如長期吸煙。上呼吸道感染時，沒有正確處理。例如是沒有正確地看醫(yī)生、沒有正確地看服藥，又或者是濫用止咳藥止咳以至痰和菌愈積愈多〔Sputumretention)。如果一年內(nèi)有多過一次真正的肺炎〔一些醫(yī)生誤看X光片或?yàn)E用了肺炎的診斷)，原因可能是：身體抵抗力弱〔先天性或后天性)氣管有異物。尤其是幼童。心肺有其它病變：如癌病、氣管擴(kuò)張、肺塵埃沉著病、沒有正確地看醫(yī)生、沒有正確地看服藥，又或者是濫用止咳藥止咳以至痰和菌愈積愈多〔Sputumretention)工作環(huán)境有問題。注意改善空氣流通、冷氣系統(tǒng)。打造最權(quán)威的專業(yè)課件醫(yī)學(xué)精品課件本文檔免費(fèi)瀏覽閱讀，下載后可以編輯修改。3.病毒性肺炎如冠狀病毒、腺病毒、流感病毒、巨細(xì)胞病毒、單位點(diǎn)偏愛〔sitepreference〕某些限制性內(nèi)切酶對不同位置的同一個識別序列表現(xiàn)出不同的切割效率。位點(diǎn)偏愛〔sitepreference〕星號活性〔staractivity〕又稱星活性，一些限制性內(nèi)切酶在某些反響條件變化時酶的專一性發(fā)生改變，如酶濃度過高、反響液離子強(qiáng)度過低、pH改變、有機(jī)溶劑的影響等條件，酶切割位點(diǎn)專一性發(fā)生改變。星號活性〔staractivity〕同裂酶(isoschizomers)

有些來源不同的限制性核酸內(nèi)切酶識別同樣的核苷酸靶序列，產(chǎn)生同樣的切割，形成同樣的末端。例如，XmaI〔CCCGGG〕SmaI〔CCCGGG〕

同裂酶(isoschizomers)

有些

同尾酶

(isocaudamers)來源不同，識別的靶序列也各不相同，但都能產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。常用的BamHⅠ，BclⅠ，BglⅡ，XhoⅠ就是一組同尾酶，它們切割DNA之后都形成由-GATC-4個核苷酸組成的粘性末端。

同尾酶

(isocaudamers)限制性核酸內(nèi)切酶II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反響的操作大局部II型核酸內(nèi)切酶需要相似的反響條件：Tris-HCl50mMMgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mM0-50mM低鹽酶100mM中鹽酶150mM高鹽酶Volume20-100mlTT37℃1-2hr1U核酸內(nèi)切酶的酶活性：在最正確反響條件下反響1小時，完全水解1mg標(biāo)準(zhǔn)DNA所需的酶量限制性核酸內(nèi)切酶II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反響的操作大局部限制性核酸內(nèi)切酶II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反響的操作II型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解：對鹽濃度要求相同的酶，原那么上可以同時酶切，但應(yīng)注意：5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’BamHⅠ

SmaⅠ5‘…GCTACATG

GATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAG

GGCCCAAGCGTA…5’5‘…GCTACATGGATCCC

GGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGG

CCCAAGCGTA…5’限制性核酸內(nèi)切酶II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反響的操作II限制性核酸內(nèi)切酶II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反響的操作II型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解：對鹽濃度要求不同的酶，可采取以下方法：使用較貴酶的鹽濃度，加大廉價酶的用量，同時酶解低鹽酶先切，然后補(bǔ)加鹽，高鹽酶再切一種酶先切，然后更換緩沖液，另一種酶再切倍體積的3MNaAc倍體積的冰冷乙醇-20℃冰浴30分鐘、高速冷凍離心10分鐘、枯燥限制性核酸內(nèi)切酶II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反響的操作II限制性核酸內(nèi)切酶影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素DNA樣品的純度：蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量，1mgDNA用10U酶加大反響總體積延長反響時間限制性核酸內(nèi)切酶影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素DNA樣品的純限制性核酸內(nèi)切酶影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素DNA樣品的甲基化程度：識別序列中特定核苷酸的甲基化會強(qiáng)烈抑制限制酶的活性因此在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大腸桿菌株限制性核酸內(nèi)切酶影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素DNA樣品的甲影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素

DNA的分子結(jié)構(gòu)某些限制性核酸內(nèi)切酶切割超螺旋的質(zhì)粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化線性DNA的高出許多倍。此外，還有一些核酸內(nèi)切限制酶，切割它們自身處于不同部位的限制位點(diǎn)，其效率亦有明顯的差異。影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素

DNA的分子結(jié)構(gòu)限制性核酸內(nèi)切酶影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素核酸內(nèi)切酶的緩沖液性質(zhì)：高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、極端pH值等，會使一些核酸內(nèi)切酶的識別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的Staractivity現(xiàn)象

EcoRⅠ在正常條件下識別并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油濃度超過5%〔v/v〕時，也可切割5‘AATT3’序列限制性核酸內(nèi)切酶影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素核酸內(nèi)切酶的緩酶活性的正常發(fā)揮，是絕對需要二價陽離子，通常是Mg2+。緩沖液Tris—HCl的作用在于使反響混合物的pH恒定在酶活性所要求的最正確數(shù)值范圍之內(nèi)。對絕大多數(shù)限制酶來說，在的條件下，其功能最正確。巰基試劑對于保持某些內(nèi)切酶的穩(wěn)定性是有用的，但它同樣也可能有利于潛在污染雜質(zhì)的穩(wěn)定性。酶活性的正常發(fā)揮，是絕對需要二價陽離子，通常是Mg2+。影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素酶切消化反響的溫度大多數(shù)核酸內(nèi)切限制酶的標(biāo)準(zhǔn)反響溫度都是37℃，但也有許多例外的情況。影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素限制性內(nèi)切酶反響的終止消化DNA樣品后，在進(jìn)一步處理DNA樣品前往往需要鈍化內(nèi)切酶的活性，鈍化大多數(shù)限制性內(nèi)切酶的方法是65℃溫浴5分鐘。但有些酶，如BamHI和HaeⅡ具備對熱穩(wěn)定性，那么需參加終止反響液〔參加0.5mol／L的EDTA使之在溶液中的終濃度到達(dá)10mmol/L以螯合Mg2+〕。限制性內(nèi)切酶反響的終止限制性核酸內(nèi)切酶的特點(diǎn)識別位點(diǎn)的DNA序列具有回文結(jié)構(gòu)；切割DNA均產(chǎn)生含5’磷酸和3’羥基的末端；錯位切割產(chǎn)生粘端，沿對稱軸切割產(chǎn)生平末端；限制性核酸內(nèi)切酶的特點(diǎn)識別位點(diǎn)的DNA序列具有回文結(jié)構(gòu)；限制性核酸內(nèi)切酶的應(yīng)用在特異位點(diǎn)上切割DNA，產(chǎn)生特異的限制酶切片斷；用限制酶切割產(chǎn)生的相同粘末端以便重組；建立DNA的限制酶切圖譜；構(gòu)建基因組文庫。限制性核酸內(nèi)切酶的應(yīng)用在特異位點(diǎn)上切割DNA，產(chǎn)生特異的限制利用限制酶對DNA進(jìn)行消化的具體步驟：不同的限制酶生產(chǎn)廠家往往推薦使用截然不同的反響條件，甚至對同一種酶也如此，所以建議遵循與酶一起提供的說明書進(jìn)行操作。以下是對0.2—1.0ugDNA進(jìn)行消化的典型反響步驟，如要對更大量的DNA進(jìn)行消化，那么反響的各個成分須相應(yīng)放大。利用限制酶對DNA進(jìn)行消化的具體步驟：1)參加適宜體積的DNA溶液；2)參加2ul適當(dāng)?shù)?0X限制酶消化緩沖液，輕敲管外壁以混勻之；3)參加1－2單位限制酶，輕彈管外壁以混勻之；4)將上述混合的反響物置于適當(dāng)溫度并按所需的時間進(jìn)行溫育；M/LEDTA〔〕使終濃度達(dá)10mM／L，以終止反響；6)如果消化后DNA直接進(jìn)行凝膠電泳分析，可參加6ul凝膠電泳加樣緩沖液混合后，再加樣進(jìn)行電泳。

如欲純化酶切后的DNA，可用酚和氯仿抽提后，乙醇沉淀DNA。1)參加適宜體積的DNA溶液；使用限制酶的注意點(diǎn)：1〕限制酶十分昂貴!為能從貯存管內(nèi)取出極少量的酶，只要用移液器吸頭在酶溶液外表輕沾一下即可，這樣可以取到少至0.1ul的酶。濃縮的限制酶也可在使用前用限制酶緩沖液稀釋，但切勿用水稀釋以免酶變性。2)限制酶在50％甘油中保存于-20℃時是穩(wěn)定的。進(jìn)行酶切消化時，將除酶以外的所有反響成分參加后加以混勻，再從冰箱內(nèi)取出貯酶管，立即放置于冰上。每次取酶時都應(yīng)換一個無菌吸頭，一旦限制酶中污染了DNA或其它酶，將造成財(cái)力和時間上的浪費(fèi)。操作要盡可能快，用完后立即將酶放回冰箱，以使酶在冰箱外放置的時間盡可能縮短。3)盡量減少反響中的加水量以使反響體積減到最小，但要確保酶體積不超過反響總體積的1／10，否那么，限制酶活性將受到甘油的抑制。4)通常延長消化時間可使所需的酶量減少，這在切割大量DNA時不失為一大節(jié)約方法。在消化過程中，可取少量反響液進(jìn)行電泳以判斷消化程度。使用限制酶的注意點(diǎn)：DNA聚合酶作用的特點(diǎn)：〔1〕要有底物4種dNTP為前體催化合成DNA；〔2〕接受模板指導(dǎo)；〔3〕需要有引物〔3’羥基〕的存在；〔4〕不能起始合成新的DNA鏈；〔5〕催化dNTP加到生長中的DNA鏈3’-OH末端；〔6〕催化DNA的合成方向是5’—3’。DNA聚合酶DNA聚合酶作用的特點(diǎn)：DNA聚合酶〖醫(yī)學(xué)〗基因工程的工具酶課件DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I〔DNApolI〕5’→3’的DNA聚合酶活性5’→3’的核酸外切酶活性3’→5’的核酸外切酶活性大腸桿菌DNA聚合酶I的根本性質(zhì)：3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘…C-G-A-G-T-OH5‘pppdNMg2+3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OHDNApolIDNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I〔DNApolIDNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I〔DNApolI〕缺口平移：5’→3’的核酸外切酶和聚合酶活性協(xié)同作用，使缺口向前推進(jìn)大腸桿菌DNA聚合酶I的根本用途：Nicktranslation制備DNA探針DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I〔DNApolI〖醫(yī)學(xué)〗基因工程的工具酶課件DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段〔Klenow〕Klenow酶的根本性質(zhì)：大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理，獲得N端三分之二的大肽段，即為Klenow酶Klenow酶仍擁有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核核酸外切酶活性，但失去了5’→3’的核酸外切酶活性DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段〔KlenowDNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段〔Klenow〕Klenow酶的根本用途：補(bǔ)平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5’粘性末端DNA片段的同位素末端標(biāo)記cDNA第二鏈的合成雙脫氧末端終止法測定DNA序列DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段〔KlenowDNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段〔Klenow〕Klenow酶的根本用途：補(bǔ)平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5’粘性末端5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’KlenowdATPdTTP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段〔KlenowDNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段〔Klenow〕Klenow酶的根本用途：DNA片段的同位素末端標(biāo)記5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’Klenowa-32P-pppdATPdTTP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段〔KlenowDNA聚合酶T4-DNA聚合酶T4-DNA聚合酶的根本特性：在無dNTP時，可以從任何3’-OH端外切在只有一種dNTP時，外切至互補(bǔ)核苷酸暴露時停止在四種dNTP均存在時，聚合活性占主導(dǎo)地位5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性DNA聚合酶T4-DNA聚合酶T4-DNA聚合酶的根本特性：DNA聚合酶T4-DNA聚合酶T4-DNA聚合酶的根本用途：切平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的3’粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

HO-A-C-G-T-C-C-T-C…5’T4-DNA聚合酶5‘…G-C-T-C-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

HO-C-C-T-C…5’注意：該酶也能降解雙鏈DNA，只是其活性比單鏈降解活性低很多DNA聚合酶T4-DNA聚合酶T4-DNA聚合酶的根本用途：DNA聚合酶T4-DNA聚合酶T4-DNA聚合酶的根本用途：DNA片段的同位素末端標(biāo)記5‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘Mg2+5‘pppdNTPa-32P-dATP5‘G-C-T-CA-G-C-T-G-OH

HO-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘T4-DNApolT4-DNApol5‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘DNA聚合酶T4-DNA聚合酶T4-DNA聚合酶的根本用途：DNA聚合酶T7噬菌體DNA聚合酶T7噬菌體DNA聚合酶的根本特性：DNA聚合酶中持續(xù)合成能力最強(qiáng)改造后成為雙脫氧終止法對長片段DNA的測序酶5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性DNA聚合酶T7噬菌體DNA聚合酶T7噬菌體DNA聚合酶的根DNA聚合酶T7噬菌體DNA聚合酶T7噬菌體DNA聚合酶的根本用途：用于拷貝長段模板的引物延伸反響通過補(bǔ)平或交換〔置換〕反響進(jìn)行快速末端標(biāo)記DNA聚合酶T7噬菌體DNA聚合酶T7噬菌體DNA聚合酶的根末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶〔TdT〕TdT的根本特性：來自小牛胸腺不需要模板的DNA聚合酶，隨機(jī)摻入dNTPs5‘p3‘HOOH3‘p5‘TdTCo2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAOH3‘p5‘DNA聚合酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶〔TdT〕TdT的根本特性：來自小牛胸腺TdT的根本特性：5‘p3‘HOOH3‘

p5‘

TdTCo2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOH3‘

p5‘

5‘p3‘HOOH3‘

p5‘

TdTCo2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAAAOH3‘

p5‘

AAAAAAAAAAAAATdT的根本特性：5‘p3‘HOOH3‘p5‘DNA聚合酶TdT的根本用途：DNA片段3’末端的同位素標(biāo)記給載體或目的DNA加上互補(bǔ)的同聚物尾DNA聚合酶TdT的根本用途：DNA片段3’末端的同位素標(biāo)記DNA聚合酶依賴于RNA的DNA聚合酶〔反轉(zhuǎn)錄酶〕反轉(zhuǎn)錄酶的根本特性：以RNA為模板聚合cDNA鏈3’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA反轉(zhuǎn)錄酶Mg2+dNTP5’TTTTTTTTTTTToligo(dT)12-183’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTTTT3’cDNADNA聚合酶依賴于RNA的DNA聚合酶〔反轉(zhuǎn)錄酶〕反轉(zhuǎn)錄酶的DNA聚合酶依賴于RNA的DNA聚合酶〔反轉(zhuǎn)錄酶〕反轉(zhuǎn)錄酶的根本特性：雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈反轉(zhuǎn)錄酶3’RNA5’

DNA3’5’3’RNA5’

DNA3’5’反轉(zhuǎn)錄酶5’

DNA3’DNA聚合酶依賴于RNA的DNA聚合酶〔反轉(zhuǎn)錄酶〕反轉(zhuǎn)錄酶的DNA聚合酶依賴于RNA的DNA聚合酶〔反轉(zhuǎn)錄酶〕基因工程中常用的反轉(zhuǎn)錄酶：一種提取自純化的禽成髓細(xì)胞瘤病毒〔AMV〕禽源反轉(zhuǎn)錄酶在42℃發(fā)揮作用，而鼠源反轉(zhuǎn)錄酶在42℃失活一種是Moloney鼠白血病病毒〔MMLV〕克隆的反轉(zhuǎn)錄酶基因在大腸桿菌的表達(dá)產(chǎn)物DNA聚合酶依賴于RNA的DNA聚合酶〔反轉(zhuǎn)錄酶〕基因工程中DNA聚合酶依賴于RNA的DNA聚合酶〔反轉(zhuǎn)錄酶〕反轉(zhuǎn)錄酶的根本用途：將真核基因的mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，構(gòu)建cDNA文庫代替Klenow片段，用于DNA序列測定對具有5‘突出端的DNA片段的3’端進(jìn)行補(bǔ)平和標(biāo)記、制備探針DNA聚合酶依賴于RNA的DNA聚合酶〔反轉(zhuǎn)錄酶〕反轉(zhuǎn)錄酶的DNA聚合酶耐熱DNA聚合酶〔Taq酶〕Taq酶的特點(diǎn)：熱穩(wěn)定性忠實(shí)性：5’-3’聚合酶活性和5’-3’外切酶活性離子依賴性DNA聚合酶耐熱DNA聚合酶〔Taq酶〕Taq酶的特點(diǎn)：熱穩(wěn)DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)1967年，世界上有數(shù)個實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r發(fā)現(xiàn)了一種能夠催化在2條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶，即DNA連接酶〔1igase〕。這種酶需要在一條DNA鏈的3’末端具有一個游離的羥基(-OH)，和另一條DNA鏈的5’末端具有一個磷酸基團(tuán)(-P)，只有在這種情況下，才能發(fā)揮其連接DNA分子的功能作用。DNA連接酶DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)DNA連接酶值得注意的一點(diǎn)是，DNA連接酶并不能連接兩條單鏈DNA分子或環(huán)化單鏈DNA分子，被連接的DNA鏈必須是雙螺旋的一局部。

值得注意的一點(diǎn)是，DNA連接酶并不能連接兩用于共價連接DNA片段的連接酶有兩種不同的來源：一種是由大腸桿菌染色體編碼的DNA連接酶：另一種是由大腸桿菌T4噬菌體DNA編碼的T4DNA連接酶。這兩種DNA連接酶，除了前者用NAD+[煙酰胺腺嘌呤二核苷酸]作能源輔助因子，后者用ATP[腺苷三磷酸]作能源輔助因子外，其它的作用機(jī)理并沒有什么差異。

用于共價連接DNA片段的連接酶有兩種不〖醫(yī)學(xué)〗基因工程的工具酶課件〖醫(yī)學(xué)〗基因工程的工具酶課件DNA連接酶DNA連接酶的根本性質(zhì)修復(fù)雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵DNA連接酶5‘…G-C-T-C-T-G-C-AG-G-A-G…3’3‘…C-G-A-GA-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’nicknickDNA連接酶DNA連接酶的根本性質(zhì)修復(fù)雙鏈DNA上缺口處的磷DNA連接酶DNA連接酶的根本性質(zhì)修復(fù)與RNA鏈結(jié)合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵T4-DNA連接酶5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-G-C-C-T-C…5’OHPnick5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C…5’DNA連接酶DNA連接酶的根本性質(zhì)修復(fù)與RNA鏈結(jié)合的DNADNA連接酶DNA連接酶的根本性質(zhì)連接多個平頭雙鏈DNA分子：5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C

…5’5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C

…5’T4-DNA連接酶DNA連接酶DNA連接酶的根本性質(zhì)連接多個平頭雙鏈DNA分子DNA連接酶DNA連接酶的反響條件Tris-HCl50-100mMMgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20mlTT4-16℃4-16hr1UDNA連接酶的酶活性：在最正確反響條件下16℃反響1小時，完全連接1mgl-DNA所需的酶量DNA連接酶DNA連接酶的反響條件Tris-HCl50-粘性末端的連接DNA連接酶最突出的特點(diǎn)是，它能夠催化外源DNA和載體分子之間發(fā)生連接作用，形成重組DNA分子。當(dāng)然，按上述這種方法構(gòu)建重組體DNA分子最主要的缺點(diǎn)是，由限制酶切產(chǎn)生的具有粘性末端的載體DNA分子，在連接反響中會發(fā)生自我環(huán)化作用。為了克服這一缺點(diǎn)，現(xiàn)在的載體一般能提供多克隆位點(diǎn)，可采用雙酶切進(jìn)行酶切。

粘性末端的連接DNA連接酶平頭雙鏈DNA片段的連接操作從分子動力學(xué)的角度講，由限制性核酸內(nèi)切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬于分子內(nèi)部的連接，而平頭末端的連接那么屬于分子間的連接，因此后者反響速度要慢得多。提高平頭末端連接效率的方法包括：加大連接酶用量〔10倍大于粘性末端的連接〕加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞時機(jī)參加10%PEG8000，促進(jìn)大分子之間的有效作用參加單價陽離子〔NaCl〕，最終濃度150-200mMDNA連接酶平頭雙鏈DNA片段的連接操作從分子動力學(xué)的角度講平末端DNA片段的連接

不具有粘性末端的DNA分子也可以被連接起來。連接這種平末端DNA分子的方法有4種，〔1〕直接用T4DNA連接酶連接；〔2〕先用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶，給平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA連接酶進(jìn)行連接；〔3〕用銜接物連接平末端DNA分子；〔4〕DNA接頭連接法。平末端DNA片段的連接〔1〕直接用T4DNA連接酶連接

T4DNA連接酶除了能夠封閉具有3’-OH和5’-P末端的雙鏈DNA的單鏈缺口外，在ATP和高濃度酶的條件下，它還能連接具有完全堿基配對的平末端DNA分子，但平末端連接效率不高，基因操作不經(jīng)常采用?！?〕直接用T4DNA連接酶連接〔2〕同聚物加尾連接平末端DNA片段運(yùn)用末端轉(zhuǎn)移酶，能夠?qū)⒑塑账峒拥紻NA分子單鏈延伸末端的3’-OH基團(tuán)上，不需要模板鏈的存在，一個個加上核苷酸，構(gòu)成由核苷酸組成的尾巴，長度可達(dá)100個核苷酸。連接分子的裂口可以通過大腸桿菌DNA聚合酶I的作用來填補(bǔ)；留下的單鏈缺口那么可由DNA連接酶封閉。上述這種連接DNA分子的方法叫作同聚物尾巴連接法，簡稱同聚物加尾法。

〔2〕同聚物加尾連接平末端DNA片段〖醫(yī)學(xué)〗基因工程的工具酶課件(3)用銜接物連接平末端DNA分子

所謂銜接物(linker)，是指用化學(xué)方法合成的一段由10—12個核苷酸組成的、具有一個或數(shù)個限制酶識別位點(diǎn)的寡核苷酸片段。銜接物的5’末端和待克隆的DNA片段5’末端，用T4多核苷酸激酶處理使之磷酸化，然后再通過T4DNA連接酶的作用使兩者連接起來；接著用適當(dāng)?shù)南拗泼赶哂秀暯游锏腄NA分子和克隆載體分子，這樣的結(jié)果使二者都產(chǎn)生出了彼此互補(bǔ)的粘性末端。(3)用銜接物連接平末端DNA分子核酸修飾酶T4-多聚核苷酸激酶〔T4-PNP〕T4-PNP的根本特性：在DNA、RNA的5‘-OH上加磷酸5‘HO3‘HOOH3‘OH5‘T4-PNPMg2+pppATP〔g-32P-ATP〕5‘p3‘HOOH3‘p5‘用于探針的末端同位素標(biāo)記：核酸修飾酶T4-多聚核苷酸激酶〔T4-PNP〕T4-PNP的3.病毒性肺炎如冠狀病毒、腺病毒、流感病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒等。多種肺炎細(xì)菌均可引起大葉性肺炎，但絕大多數(shù)為肺炎鏈球菌，其中以Ⅲ型致病力最強(qiáng)。肺炎鏈球菌為革蘭陽性球菌，有莢膜，其致病力是由于高分子多糖體的莢膜對組織的侵襲作用。少數(shù)為肺炎桿菌、金黃*色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、流感嗜血桿菌等。肺炎鏈球菌為口腔及鼻咽部的正常寄生菌群，假設(shè)呼吸道的排菌自凈功能及機(jī)體的抵抗力正常時，不引發(fā)肺炎。當(dāng)機(jī)體受寒、過度疲勞、醉酒、感冒、糖尿病、免疫功能低下等使呼吸道防御功能被削弱，細(xì)菌侵入肺泡通過變態(tài)反響使肺泡壁毛細(xì)血管通透性增強(qiáng)，漿液及纖維素滲出，富含蛋白的滲出物中細(xì)菌迅速繁殖，并通過肺泡間孔或呼吸細(xì)支氣管向鄰近肺組織蔓延，涉及一個肺段或整個肺葉。大葉間的蔓延系帶菌的滲出液經(jīng)葉支氣管播散所致。編輯本段臨床表現(xiàn)多數(shù)起病急驟，常有受涼淋雨、勞累、病毒感染等誘因，約1/3患病前有上呼吸道感染。病程7~10天?！惨弧澈畱?zhàn)、高熱：典型病例以突然寒戰(zhàn)起病，繼之高熱，體溫可高達(dá)39℃~40℃，呈稽留熱型，常伴有頭痛、全身肌肉酸痛，食量減少。抗生素使用后熱型可不典型，年老體弱者可僅有低熱或不發(fā)熱?！捕晨人?、咳痰：初期為刺激性干咳，繼而咳出白色粘液痰或帶血絲痰，經(jīng)1~2天后，可咳出粘液血性痰或鐵銹色痰，也可呈膿性痰，進(jìn)入消散期痰量增多，痰黃而稀薄?！踩承赝矗憾嘤袆×覀?cè)胸痛，常呈針刺樣，隨咳嗽或深呼吸而加劇，可放射至肩或腹部。如為下葉肺炎可刺激隔胸膜引起劇烈腹痛，易被誤診為急腹癥?！菜摹澈粑щy：由于肺實(shí)變通氣缺乏、胸痛以及毒血癥而引起呼吸困難、呼吸快而淺。病情嚴(yán)重時影響氣體交換，使動脈血氧飽和度下降而出現(xiàn)紫紺。打造最權(quán)威的專業(yè)課件本文檔免費(fèi)瀏覽閱讀，下載后可以編輯修改。醫(yī)學(xué)精品課件3.病毒性肺炎如冠狀病毒、腺病毒、流感病毒、巨細(xì)胞病毒、單〖醫(yī)學(xué)〗基因工程的工具酶課件〔4〕DNA接頭連接法DNA接頭(adapter)連接法于1978年由康乃爾大學(xué)吳瑞教授創(chuàng)造的。它是一類由人工合成的一頭具有某種限制性內(nèi)切酶粘末端，另一頭為平末端的特殊雙鏈寡核苷酸片段。當(dāng)它的平末端與平末端的外源DNA片段連接之后，會使后者成為具粘末端的新DNA分子，從而易于連接重組。

〔4〕DNA接頭連接法〖醫(yī)學(xué)〗基因工程的工具酶課件核酸修飾酶T4-多聚核苷酸激酶〔T4-PNP〕T4-PNP的根本特性：在DNA、RNA的5‘-OH上加磷酸5‘HO3‘HOOH3‘OH5‘T4-PNPMg2+pppATP〔g-32P-ATP〕5‘p3‘HOOH3‘p5‘用于探針的末端同位素標(biāo)記：核酸修飾酶T4-多聚核苷酸激酶〔T4-PNP〕T4-PNP的核酸修飾酶堿性磷酸單酯酶來自小牛胸腺的堿性磷酸單酯酶〔CIP〕68°C時失活來自大腸桿菌的堿性磷酸單酯酶〔BAP〕68°C穩(wěn)定，且耐酚抽提5‘pOH3‘

DNAorRNA5‘pppdN5‘pppNBAP/CIPOH3‘

5‘HO5‘HOdN5‘HON核酸修飾酶堿性磷酸單酯酶來自小牛胸腺的堿性磷酸單酯酶〔CIP核酸修飾酶堿性磷酸單酯酶堿性磷酸單酯酶根本用途：去除載體DNA5’端磷酸化，防止載體自身環(huán)化，減低本底，提高重組率去除DNA和RNA的5‘端磷酸基，然后用T4多聚核苷酸激酶作用下進(jìn)行末端標(biāo)記核酸修飾酶堿性磷酸單酯酶堿性磷酸單酯酶根本用途：去除載體DN核酸酶單鏈核酸外切酶：核酸外切酶VII〔ExoVII〕大腸桿菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+ExoVII3’5’3’5’3’5’3’5’核酸酶單鏈核酸外切酶：核酸外切酶VII〔ExoVII〕大腸桿核酸酶雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶III〔ExoIII〕ExoVII3’5’3’5’Mg2+3’5’3’5’大腸桿菌的核酸外切酶III特異性地從3’端外切核酸酶雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶III〔ExoIII〕Ex核酸酶雙鏈核酸外切酶：l核酸外切酶〔lExo〕lExo3’5’3’5’Mg2+l核酸外切酶特異性地從5’端外切3’5’3’5’核酸酶雙鏈核酸外切酶：l核酸外切酶〔lExo〕lExo3核酸酶單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶S1核酸酶的根本特性：來自稻谷曲霉菌〔Aspergillusoryzae〕Zn2+必需最適pH需要NaCl10-300mM降解單鏈DNA的速度比降解雙鏈DNA快75000倍降解單鏈DNA的速度比降解單鏈RNA快7倍核酸酶單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶S1核酸酶的根本特性：來自稻核酸酶單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶S1核酸酶的根本反響：內(nèi)切單鏈DNA或RNA5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T…3’S1Zn2+5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-CT-T-G-A-G-G-A-G-T…3’5‘…G-C-T-CA-G-C-T-CT-T-G-A-GG-A-G-T…3’5‘dNMPs或5‘NMPs核酸酶單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶S1核酸酶的根本反響：內(nèi)切單核酸酶單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶S1核酸酶的根本反響：內(nèi)切帶缺口或裂口的雙鏈DNA或RNA5‘…G-C-T-C-A-GC-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C

A-C-C-T-C-A…

5‘nickgapS1Zn2+5‘…G-C-T-C-A-G3‘…C-G-A-G-T-CT-G-G-A-G-T…3’A-C-C-T-C-A…5‘核酸酶單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶S1核酸酶的根本反響：內(nèi)切帶核酸酶單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶S1核酸酶的重要用途：去除DNA片段的單鏈突端，使之成為平端去除cDNA合成時形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)施行S1核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)，分析轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物修整漸進(jìn)性刪除突變的末端成熟mRNA與基因組DNA雜交后，結(jié)合此酶水解，可定位內(nèi)含子核酸酶單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶S1核酸酶的重要用途：去除D核酸酶單鏈內(nèi)切雙鏈外切的核酸酶：Bal31核酸酶從雙鏈DNA的兩端3‘和5’同時開始水解兩條鏈對兩條鏈的水解速度不一定相等結(jié)果是雙鏈從兩頭縮短，徹底水解為5‘單核苷酸Bal31核酸酶的根本特性：來自艾氏交替單胞菌〔〕核酸酶單鏈內(nèi)切雙鏈外切的核酸酶：Bal31核酸酶從雙鏈DNA核酸酶單鏈內(nèi)切雙鏈外切的核酸酶：Bal31核酸酶Ca2+5‘dNMPs或5‘NMPsssDNAorRNACa2+Ca2+核酸酶單鏈內(nèi)切雙鏈外切的核酸酶：Bal31核酸酶Ca2+5‘核酸酶單鏈內(nèi)切雙鏈外切的核酸酶：Bal31核酸酶Bal31核酸酶的根本用途：誘發(fā)DNA突變EcoRIABCEcoRIEcoRIBCABal31BCA環(huán)化AC核酸酶單鏈內(nèi)切雙鏈外切的核酸酶：Bal31核酸酶Bal31核核酸酶單鏈內(nèi)切雙鏈外切的核酸酶：Bal31核酸酶用于不同長度的刪除突變克隆實(shí)驗(yàn)繪制DNA限制性酶切圖譜Bal31核酸酶的根本用途：核酸酶單鏈內(nèi)切雙鏈外切的核酸酶：Bal31核酸酶用于不同長度1.大葉性〔肺泡性〕肺炎為肺實(shí)質(zhì)炎癥，通常累及肺大葉的全部或大部，并不累及支氣管。病原表達(dá)在肺泡引起炎癥，繼之導(dǎo)致局部或整個肺段、肺葉發(fā)生炎癥改變，致病菌多為肺炎鏈球菌。本病多見于青壯年，臨床起病急，主要病癥為寒顫高熱、咳嗽、胸痛、呼吸困難和咳鐵銹色痰。2.小葉性〔支氣管〕肺炎指病原體經(jīng)支氣管入侵，引起細(xì)支氣管、終末細(xì)支氣管和肺泡的炎癥。病原體有肺炎鏈球菌、葡萄球菌、病毒、肺炎支原體以及軍團(tuán)菌等。常繼發(fā)于支氣管炎、支氣管擴(kuò)張、上呼吸道病毒感染以及長期臥床的危重病人。3.間質(zhì)性肺炎以肺間質(zhì)炎癥為主，病變累及支氣管壁及其周圍組織，有肺泡壁增生及間質(zhì)水腫?？捎杉?xì)菌、支原體、衣原體、病毒或卡氏肺囊蟲等引起。病因?qū)W分類1.細(xì)菌性肺炎如肺炎鏈球菌〔即肺炎球菌〕、金黃色葡萄球菌、甲型溶血性鏈球菌、肺炎克雷白桿菌、流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌、埃希大腸桿菌、綠膿桿菌等。2.非典型病原體所致的肺炎如軍團(tuán)菌、支原體和衣原體等。打造最權(quán)威的專業(yè)課件醫(yī)學(xué)精品課件本文檔免費(fèi)瀏覽閱讀，下載后可以編輯修改。1.大葉性〔肺泡性〕肺炎為肺實(shí)質(zhì)炎癥，通常累及肺大葉的全部基因工程的工具酶基因工程的工具酶基因工程的工具酶〔instrumentalenzymeofgeneengineering〕是應(yīng)用于基因工程各種酶的總稱，包括核酸序列分析、標(biāo)記探針制備、載體構(gòu)建、目的基因制取、重組體DNA制備等所需要的酶類。基因工程的工具酶〔instrumentalenzymeo核酸酶：能夠?qū)⒕酆塑账徭湹牧姿岫ユI切斷的酶，屬于水解酶。核酸酶：能夠?qū)⒕酆塑账徭湹牧姿岫ユI切斷的酶，屬于水解酶。核酸酶的分類：1〕根據(jù)核酸底物分RNA酶〔Rnase〕、DNA酶〔Dnase〕和底物非專一性核酸酶；2〕根據(jù)作用方式分內(nèi)切核酸酶〔endonuclease〕和外切核酸酶〔exonuclease〕；3)根據(jù)對底物堿基專一性分堿基專一性核酸酶〔切割部位的堿基序列高度專一性〕和非堿基專一性核酸酶〔切割部位的堿基序列隨機(jī)性〕核酸酶的分類：〖醫(yī)學(xué)〗基因工程的工具酶課件〖醫(yī)學(xué)〗基因工程的工具酶課件在限制修飾系統(tǒng)中，限制作用是指一定類型的細(xì)菌可以通過限制性核酸內(nèi)切酶的作用，破壞入侵的外源DNA(如噬菌體DNA等)，使得外源DNA對生物細(xì)胞的入侵受到限制；而生物細(xì)胞(如宿主)自身DNA分子通過甲基化酶的作用，在堿基特定位置上發(fā)生了甲基化，可免遭自身限制性內(nèi)切酶的破壞。

限制－修飾作用實(shí)際就是細(xì)菌中的限制性內(nèi)切酶降解外源DNA，維護(hù)自身遺傳穩(wěn)定的保護(hù)機(jī)制。

在限制修飾系統(tǒng)中，限制作用是指一定類型

用于核酸操作的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA聚合酶DNA連接酶核酸修飾酶核酸酶用于核酸操作的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA聚合酶DNA限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及其生物功能識別雙鏈DNA分子中的特定序列，并切割DNA雙鏈主要存在于原核細(xì)菌中，幫助細(xì)菌限制外來DNA的入侵細(xì)菌的限制與修飾作用1968年，Smith等人首先從流感嗜血桿菌d株中別離出HindⅡ和Hind

Ⅲ

限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及其生物功能識別雙鏈D限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的類型主要特性I型II型III型限制修飾多功能單功能雙功能蛋白結(jié)構(gòu)異源三聚體同源二聚體異源二聚體輔助因子ATPMg2+SAMATPMg2+SAMMg2+識別序列TGAN8TGCT旋轉(zhuǎn)對稱序列GAGCCAACN6GTGCCAGCAG切割位點(diǎn)距識別序列1kb處識別序列內(nèi)或附近距識別序列下游隨機(jī)性切割特異性切割24-26bp處限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的類型主要特性限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的命名屬名種名株名Hind

Ⅲ

Hind

ⅡHaemophilusinfluenzae

d

嗜血流感桿菌d株同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的命名屬名限制性核酸內(nèi)切酶II型限制性核酸內(nèi)切酶的根本特性識別雙鏈DNA分子中4-8對堿基的特定序列大局部酶的切割位點(diǎn)在識別序列內(nèi)部或兩側(cè)識別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對稱型回文結(jié)構(gòu)5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’EcoRⅠ的識別序列EcoRⅠ的切割位點(diǎn)限制性核酸內(nèi)切酶II型限制性核酸內(nèi)切酶的根本特性識別雙鏈D回文結(jié)構(gòu)〔palindrome〕：序列正讀和反讀是一樣的，即有一個中心對稱軸，從這個軸朝兩個方向讀序列是完全一樣的。在切割位點(diǎn)處，限制性核酸內(nèi)切酶的作用下磷酸二酯鍵會發(fā)生水解效應(yīng)，從而導(dǎo)致鏈的斷裂。回文結(jié)構(gòu)〔palindrome〕：序列正讀和反讀是一樣的，即限制性核酸內(nèi)切酶的切割類型：〔1〕兩條鏈上的斷裂位置是交錯和對稱圍繞著一個對稱軸排列，這種形式的斷裂結(jié)果形成具有粘末端的DNA片段；〔2〕兩條鏈上的斷裂位置是處在一個對稱軸的中心，這樣形式的斷裂是形成具有平末端的DNA片段。限制性核酸內(nèi)切酶的切割類型：EcoRⅠ等產(chǎn)生的5’粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRⅠ37℃5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-GA-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-AG-C-T-C…5’OHPOHPEcoRⅠ等產(chǎn)生的5’粘性末端5‘…G-C-T-G-A-PstⅠ等產(chǎn)生的3’粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstⅠ37℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-AG-G-A-G…3’3‘…C-G-A-GA-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHPPstⅠ等產(chǎn)生的3’粘性末端5‘…G-C-T-C-T-GPvuⅡ等產(chǎn)生的平頭末端5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuⅡ37℃5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’PvuⅡ等產(chǎn)生的平頭末端5‘…G-C-T-C-A-G-C3.病毒性肺炎如冠狀病毒、腺病毒、流感病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒等。4.真菌性肺炎如白念珠菌、曲霉、放射菌等。5.其它病原體所致的肺炎如立克次體、弓形蟲、原蟲、寄生蟲如肺包蟲、肺吸蟲、肺血吸蟲〕等。機(jī)體免疫力低下者〔如艾滋病患者〕容易伴發(fā)肺部卡氏肺包子蟲、軍團(tuán)菌、鳥形分支桿菌、結(jié)核菌、弓形體等感染。6.理化因素所致的肺炎如放射性肺炎、胃酸吸入、藥物等引起的化學(xué)性肺炎等。7.支原體肺炎由肺炎支氣體引起。編輯本段發(fā)病原因

肺炎患肺炎的原因可能是：接觸到一些厲害的病菌或病毒身體抵抗力弱，如長期吸煙。上呼吸道感染時，沒有正確處理。例如是沒有正確地看醫(yī)生、沒有正確地看服藥，又或者是濫用止咳藥止咳以至痰和菌愈積愈多〔Sputumretention)。如果一年內(nèi)有多過一次真正的肺炎〔一些醫(yī)生誤看X光片或?yàn)E用了肺炎的診斷)，原因可能是：身體抵抗力弱〔先天性或后天性)氣管有異物。尤其是幼童。心肺有其它病變：如癌病、氣管擴(kuò)張、肺塵埃沉著病、沒有正確地看醫(yī)生、沒有正確地看服藥，又或者是濫用止咳藥止咳以至痰和菌愈積愈多〔Sputumretention)工作環(huán)境有問題。注意改善空氣流通、冷氣系統(tǒng)。打造最權(quán)威的專業(yè)課件醫(yī)學(xué)精品課件本文檔免費(fèi)瀏覽閱讀，下載后可以編輯修改。3.病毒性肺炎如冠狀病毒、腺病毒、流感病毒、巨細(xì)胞病毒、單位點(diǎn)偏愛〔sitepreference〕某些限制性內(nèi)切酶對不同位置的同一個識別序列表現(xiàn)出不同的切割效率。位點(diǎn)偏愛〔sitepreference〕星號活性〔staractivity〕又稱星活性，一些限制性內(nèi)切酶在某些反響條件變化時酶的專一性發(fā)生改變，如酶濃度過高、反響液離子強(qiáng)度過低、pH改變、有機(jī)溶劑的影響等條件，酶切割位點(diǎn)專一性發(fā)生改變。星號活性〔staractivity〕同裂酶(isoschizomers)

有些來源不同的限制性核酸內(nèi)切酶識別同樣的核苷酸靶序列，產(chǎn)生同樣的切割，形成同樣的末端。例如，XmaI〔CCCGGG〕SmaI〔CCCGGG〕

同裂酶(isoschizomers)

有些

同尾酶

(isocaudamers)來源不同，識別的靶序列也各不相同，但都能產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。常用的BamHⅠ，BclⅠ，BglⅡ，XhoⅠ就是一組同尾酶，它們切割DNA之后都形成由-GATC-4個核苷酸組成的粘性末端。

同尾酶

(isocaudamers)限制性核酸內(nèi)切酶II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反響的操作大局部II型核酸內(nèi)切酶需要相似的反響條件：Tris-HCl50mMMgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mM0-50mM低鹽酶100mM中鹽酶150mM高鹽酶Volume20-100mlTT37℃1-2hr1U核酸內(nèi)切酶的酶活性：在最正確反響條件下反響1小時，完全水解1mg標(biāo)準(zhǔn)DNA所需的酶量限制性核酸內(nèi)切酶II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反響的操作大局部限制性核酸內(nèi)切酶II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反響的操作II型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解：對鹽濃度要求相同的酶，原那么上可以同時酶切，但應(yīng)注意：5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’BamHⅠ

SmaⅠ5‘…GCTACATG

GATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAG

GGCCCAAGCGTA…5’5‘…GCTACATGGATCCC

GGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGG

CCCAAGCGTA…5’限制性核酸內(nèi)切酶II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反響的操作II限制性核酸內(nèi)切酶II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反響的操作II型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解：對鹽濃度要求不同的酶，可采取以下方法：使用較貴酶的鹽濃度，加大廉價酶的用量，同時酶解低鹽酶先切，然后補(bǔ)加鹽，高鹽酶再切一種酶先切，然后更換緩沖液，另一種酶再切倍體積的3MNaAc倍體積的冰冷乙醇-20℃冰浴30分鐘、高速冷凍離心10分鐘、枯燥限制性核酸內(nèi)切酶II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反響的操作II限制性核酸內(nèi)切酶影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素DNA樣品的純度：蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量，1mgDNA用10U酶加大反響總體積延長反響時間限制性核酸內(nèi)切酶影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素DNA樣品的純限制性核酸內(nèi)切酶影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素DNA樣品的甲基化程度：識別序列中特定核苷酸的甲基化會強(qiáng)烈抑制限制酶的活性因此在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大腸桿菌株限制性核酸內(nèi)切酶影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素DNA樣品的甲影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素

DNA的分子結(jié)構(gòu)某些限制性核酸內(nèi)切酶切割超螺旋的質(zhì)粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化線性DNA的高出許多倍。此外，還有一些核酸內(nèi)切限制酶，切割它們自身處于不同部位的限制位點(diǎn)，其效率亦有明顯的差異。影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素

DNA的分子結(jié)構(gòu)限制性核酸內(nèi)切酶影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素核酸內(nèi)切酶的緩沖液性質(zhì)：高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、極端pH值等，會使一些核酸內(nèi)切酶的識別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的Staractivity現(xiàn)象

EcoRⅠ在正常條件下識別并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油濃度超過5%〔v/v〕時，也可切割5‘AATT3’序列限制性核酸內(nèi)切酶影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素核酸內(nèi)切酶的緩酶活性的正常發(fā)揮，是絕對需要二價陽離子，通常是Mg2+。緩沖液Tris—HCl的作用在于使反響混合物的pH恒定在酶活性所要求的最正確數(shù)值范圍之內(nèi)。對絕大多數(shù)限制酶來說，在的條件下，其功能最正確。巰基試劑對于保持某些內(nèi)切酶的穩(wěn)定性是有用的，但它同樣也可能有利于潛在污染雜質(zhì)的穩(wěn)定性。酶活性的正常發(fā)揮，是絕對需要二價陽離子，通常是Mg2+。影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素酶切消化反響的溫度大多數(shù)核酸內(nèi)切限制酶的標(biāo)準(zhǔn)反響溫度都是37℃，但也有許多例外的情況。影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素限制性內(nèi)切酶反響的終止消化DNA樣品后，在進(jìn)一步處理DNA樣品前往往需要鈍化內(nèi)切酶的活性，鈍化大多數(shù)限制性內(nèi)切酶的方法是65℃溫浴5分鐘。但有些酶，如BamHI和HaeⅡ具備對熱穩(wěn)定性，那么需參加終止反響液〔參加0.5mol／L的EDTA使之在溶液中的終濃度到達(dá)10mmol/L以螯合Mg2+〕。限制性內(nèi)切酶反響的終止限制性核酸內(nèi)切酶的特點(diǎn)識別位點(diǎn)的DNA序列具有回文結(jié)構(gòu)；切割DNA均產(chǎn)生含5’磷酸和3’羥基的末端；錯位切割產(chǎn)生粘端，沿對稱軸切割產(chǎn)生平末端；限制性核酸內(nèi)切酶的特點(diǎn)識別位點(diǎn)的DNA序列具有回文結(jié)構(gòu)；限制性核酸內(nèi)切酶的應(yīng)用在特異位點(diǎn)上切割DNA，產(chǎn)生特異的限制酶切片斷；用限制酶切割產(chǎn)生的相同粘末端以便重組；建立DNA的限制酶切圖譜；構(gòu)建基因組文庫。限制性核酸內(nèi)切酶的應(yīng)用在特異位點(diǎn)上切割DNA，產(chǎn)生特異的限制利用限制酶對DNA進(jìn)行消化的具體步驟：不同的限制酶生產(chǎn)廠家往往推薦使用截然不同的反響條件，甚至對同一種酶也如此，所以建議遵循與酶一起提供的說明書進(jìn)行操作。以下是對0.2—1.0ugDNA進(jìn)行消化的典型反響步驟，如要對更大量的DNA進(jìn)行消化，那么反響的各個成分須相應(yīng)放大。利用限制酶對DNA進(jìn)行消化的具體步驟：1)參加適宜體積的DNA溶液；2)參加2ul適當(dāng)?shù)?0X限制酶消化緩沖液，輕敲管外壁以混勻之；3)參加1－2單位限制酶，輕彈管外壁以混勻之；4)將上述混合的反響物置于適當(dāng)溫度并按所需的時間進(jìn)行溫育；M/LEDTA〔〕使終濃度達(dá)10mM／L，以終止反響；6)如果消化后DNA直接進(jìn)行凝膠電泳分析，可參加6ul凝膠電泳加樣緩沖液混合后，再加樣進(jìn)行電泳。

如欲純化酶切后的DNA，可用酚和氯仿抽提后，乙醇沉淀DNA。1)參加適宜體積的DNA溶液；使用限制酶的注意點(diǎn)：1〕限制酶十分昂貴!為能從貯存管內(nèi)取出極少量的酶，只要用移液器吸頭在酶溶液外表輕沾一下即可，這樣可以取到少至0.1ul的酶。濃縮的限制酶也可在使用前用限制酶緩沖液稀釋，但切勿用水稀釋以免酶變性。2)限制酶在50％甘油中保存于-20℃時是穩(wěn)定的。進(jìn)行酶切消化時，將除酶以外的所有反響成分參加后加以混勻，再從冰箱內(nèi)取出貯酶管，立即放置于冰上。每次取酶時都應(yīng)換一個無菌吸頭，一旦限制酶中污染了DNA或其它酶，將造成財(cái)力和時間上的浪費(fèi)。操作要盡可能快，用完后立即將酶放回冰箱，以使酶在冰箱外放置的時間盡可能縮短。3)盡量減少反響中的加水量以使反響體積減到最小，但要確保酶體積不超過反響總體積的1／10，否那么，限制酶活性將受到甘油的抑制。4)通常延長消化時間可使所需的酶量減少，這在切割大量DNA時不失為一大節(jié)約方法。在消化過程中，可取少量反響液進(jìn)行電泳以判斷消化程度。使用限制酶的注意點(diǎn)：DNA聚合酶作用的特點(diǎn)：〔1〕要有底物4種dNTP為前體催化合成DNA；〔2〕接受模板指導(dǎo)；〔3〕需要有引物〔3’羥基〕的存在；〔4〕不能起始合成新的DNA鏈；〔5〕催化dNTP加到生長中的DNA鏈3’-OH末端；〔6〕催化DNA的合成方向是5’—3’。DNA聚合酶DNA聚合酶作用的特點(diǎn)：DNA聚合酶〖醫(yī)學(xué)〗基因工程的工具酶課件DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I〔DNApolI〕5’→3’的DNA聚合酶活性5’→3’的核酸外切酶活性3’→5’的核酸外切酶活性大腸桿菌DNA聚合酶I的根本性質(zhì)：3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘…C-G-A-G-T-OH5‘pppdN