2022年醫(yī)學(xué)專題-細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法干擾試驗

細(xì)菌(xìjūn)內(nèi)毒素檢查法干擾試驗講解董光宴

湛江博康海洋生物有限公司第一頁，共三十九頁。10/27/20221博康實(shí)驗(shíyàn)基本流程圖供試品限值確定(quèdìng)最大有效(yǒuxiào)稀釋倍數(shù)確定供試品干擾實(shí)驗

正式實(shí)驗結(jié)果判斷第二頁，共三十九頁。10/27/20222博康供試品

新化合物或新藥建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法時，常常會遇到各種各樣的困難，尤其是尚處于(chǔyú)新藥研發(fā)早期階段的藥物，由于藥物制劑、賦形劑等還不穩(wěn)定，經(jīng)常會發(fā)生變化，這樣就給方法的建立帶來不同程度的影響。第三頁，共三十九頁。10/27/20223博康

供試品在建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法之前，應(yīng)盡可能多的收集有關(guān)該藥品的基本信息(xìnxī)，例如：有關(guān)樣品的溶解性信息，推薦的稀釋液，在水中的溶解度，以及最適溶劑；樣品的pH范圍；分子量大?。划a(chǎn)品規(guī)格、體積或重量；擬用于臨床的用法和用量等等。第四頁，共三十九頁。10/27/20224博康限值的確定

1、依據(jù)2010年版《中國藥典》附錄“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水”2010年版《中國藥典》二部附錄“化學(xué)藥品注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)(zhǐdǎo)原則”第五頁，共三十九頁。10/27/20225博康干擾試驗當(dāng)進(jìn)行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗前，或無內(nèi)毒素檢查項的品種建立內(nèi)毒素檢查法時，須進(jìn)行干擾試驗。當(dāng)鱟試劑、供試品的處方、生產(chǎn)工藝改變或試驗環(huán)境(huánjìng)中發(fā)生了任何有可能影響試驗結(jié)果的變化時，須重新進(jìn)行干擾試驗?！?010版藥典

第六頁，共三十九頁。10/27/20226博康干擾試驗藥典中已有規(guī)定的品種或有其他內(nèi)毒素檢驗標(biāo)準(zhǔn)的品種，可直接進(jìn)行內(nèi)毒素檢查(jiǎnchá)，如在檢驗中出現(xiàn)干擾的情況需再進(jìn)行干擾實(shí)驗的驗證；其他未建立內(nèi)毒素檢查(jiǎnchá)的品種需先進(jìn)行干擾實(shí)驗，確定不干擾濃度后再進(jìn)行內(nèi)毒素檢查(jiǎnchá)?！?010版《中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》第七頁，共三十九頁。10/27/20227博康干擾試驗干擾實(shí)驗的目的是確定供試品在多大的稀釋倍數(shù)或濃度下對內(nèi)毒素和鱟試劑的反應(yīng)不存在干擾作用，為能否使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法提供依據(jù)。并且驗證當(dāng)供試品的配方和工藝有變化，鱟試劑來源改變或供試品陽性對照結(jié)果呈陰性時供試品是否存在干擾作用?！?010版《中國(zhōnɡɡuó)藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》第八頁，共三十九頁。10/27/20228博康干擾試驗由于干擾實(shí)驗檢驗的是在供試品存在的情況下內(nèi)毒素與鱟試劑的反應(yīng)是否正常，與所使用鱟試劑的靈敏度無關(guān)(wúguān)，因此在干擾實(shí)驗中原則上可使用任一靈敏度的鱟試劑。但建議使用較低靈敏度（如0.50或0.25EU/ml）的鱟試劑，可盡量避免供試品所含的內(nèi)毒素對干擾實(shí)驗造成的陽性影響?！?010版《中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》第九頁，共三十九頁。10/27/20229博康舉例(jǔlì):1試劑和樣品鱟試劑（生產(chǎn)單位：湛江博康海洋生物有限公司，靈敏度：0.25EU/ml）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（中檢所提供）西咪替丁氯化鈉注射液（【規(guī)格】50ml:西咪替丁0.2g與氯化鈉0.45gP258）第十頁，共三十九頁。10/27/202210博康2限值的確定內(nèi)毒素限值L=0.50EU/ml（2010年版《中國(zhōnɡɡuó)藥典》二部正文258頁）。

第十一頁，共三十九頁。10/27/202211博康3干擾試驗濃度的計算按照(ànzhào)中國藥典2005年版提供的公式計算最大有效稀釋倍數(shù)，計算方法如下：3.1選用靈敏度為：0.25EU/ml時：MVD=CL/λ=1×0.5/0.25=2倍3.2選用靈敏度為：0.125EU/ml時：MVD=CL/λ=1×0.5/0.125=4倍第十二頁，共三十九頁。10/27/202212博康4預(yù)試驗4.1目的初步確定供試品的最大不干擾濃度（當(dāng)限值以EU/mg或EU/U表示）或最小不干擾稀釋倍數(shù)（當(dāng)限值以EU/ml表示）,為正式干擾試驗提供(tígōng)依據(jù)。優(yōu)點(diǎn)：減少摸索過程、節(jié)省成本第十三頁，共三十九頁。10/27/202213博康4.2操作方法由于干擾試驗檢驗的是在供試品存在的情況下內(nèi)毒素與鱟試劑的反應(yīng)是否正常，與所用鱟試劑的靈敏度無關(guān)(wúguān)，因此在干擾試驗的預(yù)試驗中原則上可使用任一靈敏度的鱟試劑。但建議使用較低靈敏度（0.5或0.25EU/ml）的鱟試劑，可盡量避免供試品所含的內(nèi)毒素對干擾試驗造成的陽性影響。第十四頁，共三十九頁。10/27/202214博康將供試品溶液進(jìn)行一系列倍數(shù)(bèishù)的稀釋，但最大的稀釋倍數(shù)(bèishù)不得超過MVD=CL/λ0.03使用鱟試劑對每一稀釋倍數(shù)進(jìn)行檢驗。每一稀釋倍數(shù)下做2支供試品管和2支供試品陽性對照（即含2.0λ濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的該濃度的供試品稀釋液）。另做2支陰性對照，和2支陽性對照。第十五頁，共三十九頁。10/27/202215博康4.3結(jié)果判斷當(dāng)陰性對照為陰性，陽性對照為陽性時，實(shí)驗為有效。當(dāng)系列濃度中出現(xiàn)供試品溶液2管為陰性，供試品陽性對照2管為陽性時，認(rèn)為供試品在該濃度下可能無干擾，可選擇(xuǎnzé)該稀釋倍數(shù)進(jìn)行正式干擾實(shí)驗。第十六頁，共三十九頁。10/27/202216博康樣品信息結(jié)果2倍4倍8倍0.25EU/ml0.25EU/ml0.25EU/mlPPC++++++樣品管------PC++NC--4.4結(jié)果(jiēguǒ)記錄第十七頁，共三十九頁。10/27/202217博康

預(yù)試驗結(jié)果，樣品西咪替丁氯化鈉注射液在2-8倍稀釋范圍內(nèi)不存在明顯(míngxiǎn)的增強(qiáng)和抑制作用，可選用其中任一濃度做該樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素干擾試驗。第十八頁，共三十九頁。10/27/202218博康5干擾(gānrǎo)試驗溶液的制備溶液名稱WSE/被加入內(nèi)毒素的溶液稀釋用液倍數(shù)WSE管數(shù)供試品無/供試品溶液———2Et

2λ/供試品溶液供試品溶液12482λ1λ0.5λ0.25λ4444ES

2λ/BETBET12482λ1λ0.5λ0.25λ4444NC無/BET———2第十九頁，共三十九頁。10/27/202219博康5.1供試品溶液樣品西咪替丁氯化鈉注射液的稀釋：用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將其稀釋到2倍和4倍稀釋液備用。操作過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程，保證無外源物質(zhì)(wùzhì)的干擾。第二十頁，共三十九頁。10/27/202220博康西咪替丁氯化鈉注射液原液2倍稀釋液4倍稀釋液2.0ml2.0ml0.5ml0.5ml圖示第二十一頁，共三十九頁。10/27/202221博康5.2鱟試劑(shìjì)靈敏度的對照系列根據(jù)鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值（λ），將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水1ml溶解，在旋渦混合器上混合15分鐘，然后制備成1.0EU/ml、0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml和0.03EU/ml等6個濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混合30秒鐘。

第二十二頁，共三十九頁。10/27/202222博康150EU/ml15EU/ml2EU/ml1EU/ml0.5EU/ml0.125EU/ml0.25EU/ml0.06EU/ml0.2ml0.3ml1.8ml1.95ml1.2ml1.2ml1.2ml1.2ml0.3ml1.2ml1.2ml0.3ml1.2ml1.2ml圖示第二十三頁，共三十九頁。10/27/202223博康5.3干擾(gānrǎo)試驗系列的制備方法①、鱟試劑為0.25EU/ml樣品濃度為2倍稀釋的干擾試驗系列溶液的制備：取西咪替丁氯化鈉注射液的原液0.6ml加入試管中，然后吸取相同體積的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為1.0EU/ml）加入同一試管中，混合均勻即得到含內(nèi)毒素為0.50EU/ml并同時含樣品西咪替丁氯化鈉注射液的2倍稀釋的混合液。第二十四頁，共三十九頁。10/27/202224博康然后用樣品西咪替丁氯化鈉注射液的2倍稀釋液稀釋該混合液，稀釋倍數(shù)依次為2、4和8倍，將這三支管混合均勻連同該混合液即可得到(dédào)含內(nèi)毒素分別為0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml和0.06EU/ml，含樣品西咪替丁氯化鈉注射液濃度為2倍稀釋液的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素對照溶液（干擾試驗系列）。第二十五頁，共三十九頁。10/27/202225博康樣品(yàngpǐn)原液內(nèi)毒素1.0EU/ml圖示0.6ml0.6ml0.6ml0.6ml0.3ml樣品(yàngpǐn)2倍0.3ml0.6ml0.6ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.06EU/ml0.50EU/ml第二十六頁，共三十九頁。10/27/202226博康②、鱟試劑為0.125EU/ml樣品濃度為4倍稀釋的干擾試驗系列溶液(róngyè)的制備：取西咪替丁氯化鈉注射液的的2倍稀釋液0.6ml加入試管中，然后吸取相同體積的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為0.5EU/ml）加入同一試管中，混合均勻即得到含內(nèi)毒素為0.25EU/ml并同時含樣品西咪替丁氯化鈉注射液的4倍稀釋的混合液。第二十七頁，共三十九頁。10/27/202227博康然后用樣品西咪替丁氯化鈉注射液的4倍稀釋(xīshì)液稀釋(xīshì)該混合液，稀釋(xīshì)倍數(shù)依次為2、4和8倍，將這三支管混合均勻連同該混合液即可得到含內(nèi)毒素分別為0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml和0.03EU/ml，含樣品西咪替丁氯化鈉注射液濃度為4倍稀釋(xīshì)液的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素對照溶液（干擾試驗系列）。第二十八頁，共三十九頁。10/27/202228博康樣品(yàngpǐn)2倍內(nèi)毒素0.5EU/ml圖示0.6ml0.6ml0.6ml0.6ml0.3ml樣品(yàngpǐn)4倍0.3ml0.6ml0.6ml0.125EU/ml0.06EU/ml0.03EU/ml0.25EU/ml第二十九頁，共三十九頁。10/27/202229博康6干擾(gānrǎo)試驗加樣

WSE對照名稱2λλ0.5λ0.25λNCESET第三十頁，共三十九頁。10/27/202230博康

7干擾試驗判斷的標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)Es在0.5λ—2.0λ(包括(bāokuò)0.5λ和2.0λ)時，且當(dāng)Et在0.5Es—2.0Es(包括(bāokuò)0.5Es和2.0Es)時，則認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作用。第三十一頁，共三十九頁。10/27/202231博康7.1如所用鱟試劑(shìjì)靈敏度為0.25EU/ml，供試品為XX注射液（稀釋4倍）WSE對照名稱0.50.250.1250.06NC結(jié)果ES++++++++------0.25ET++++++++++++-----0.125

Es在0.5λ—2.0λ，且Et在0.5Es—2.0Es(包括(bāokuò)0.5Es和2.0Es)，認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作用。第三十二頁，共三十九頁。10/27/202232博康7.2如所用鱟試劑(shìjì)靈敏度為0.25EU/ml，供試品為XX注射液（稀釋4倍）WSE對照名稱0.50.250.1250.06NC結(jié)果ES++++++++++++----0.125ET+++++-----------0.42

雖然Es在0.5λ—2.0λ范圍內(nèi)，Et不在0.5Es—2.0Es范圍內(nèi)，供試品在該濃度下有干擾(gānrǎo)作用，需進(jìn)行適當(dāng)處理后重做試驗。

第三十三頁，共三十九頁。10/27/202233博康7.3如所用(suǒyònɡ)鱟試劑靈敏度為0.25EU/ml，供試品為XX注射液（稀釋4倍）WSE對照名稱0.50.250.1250.06NC結(jié)果ES+++++++++++++----0.10ET++++++++--------0.25

Es不在0.5λ—2.0λ范圍(fànwéi)內(nèi)，試驗無效。第三十四頁，共三十九頁。1