測定核酸含量的幾種方法

關(guān)于測定核酸含量的幾種方法第1頁，共12頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期五核酸由許多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，為生命的最基本物質(zhì)之一。核酸廣泛存在于所有動植物細(xì)胞、微生物內(nèi)、生物體內(nèi)的核酸常與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核蛋白。不同的核酸，其化學(xué)組成、核苷酸排列順序等不同。根據(jù)化學(xué)組成不同，核酸可分為核糖核酸（簡稱RNA）和脫氧核糖核酸（簡稱DNA）。第2頁，共12頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期五為什么要測核酸含量有助于接下來核酸相關(guān)實(shí)驗(yàn)中所用酶和其他試劑含量的確定為了排除核酸在實(shí)驗(yàn)中的干擾第3頁，共12頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期五核酸含量測定的幾種方法定磷法定糖法紫外吸收法熒光光度法第4頁，共12頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期五定磷法在酸性環(huán)境中，定磷試劑中的鉬酸銨以鉬酸形式與樣品中的磷酸反應(yīng)生成磷鉬酸，當(dāng)有還原劑存在時磷鉬酸立即轉(zhuǎn)變藍(lán)色的還原產(chǎn)物——鉬藍(lán)鉬藍(lán)最大的光吸收在650—660nm波長處。當(dāng)使用抗壞血酸為還原劑時，測定的最適范圍為1—10微克無機(jī)磷。測定樣品核酸總磷量，需先將它用硫酸或過氯酸消化成無機(jī)磷再行測定。總磷量減去未消化樣品中測得的無機(jī)磷量，即得核酸含磷量，由此可以計算出核酸含量。優(yōu)缺點(diǎn)：簡單，快速，靈敏度高，但是受蛋白質(zhì)和核苷酸的影響第5頁，共12頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期五注意事項(xiàng)1）清洗實(shí)驗(yàn)用容器不要用含磷清洗劑

2）消化過程注意防止爆沸和濺出內(nèi)容物第6頁，共12頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期五定糖法核酸中的戊糖可在濃鹽酸或濃硫酸作用下脫水生成醛類化合物，醛類化合物可與某些成色劑縮合成有色化合物，可用比色法或分光光度法測定其溶液中的吸收值，在一定濃度范圍內(nèi)，溶液的吸收值與核酸的含量成正比。1、核糖的測定

生成的綠色化合物在λ=670nm處有最大的吸收值。2、脫氧核糖的測定

DNA中的脫氧核糖可在濃硫酸作用下脫水生成ω-羥基-γ-酮戊酸，該化合物可與二苯胺生成蘭色化合物，在λ=595nm處有最大吸收值。優(yōu)缺點(diǎn)：較靈敏，但特異性較差，凡戊糖均有此反應(yīng)。

第7頁，共12頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期五注意事項(xiàng)其他糖及糖的衍生物、芳香醛、蛋白質(zhì)等都對實(shí)驗(yàn)有干擾，測定前應(yīng)盡量可能除去。第8頁，共12頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期五紫外吸收法組成核酸分子的堿基，均具有一定的吸收紫外線特性，最大吸收值在波長為250~270nm之間。核酸的最大吸收波長是260nm，這個物理特性為測定核酸溶液濃度提供了基礎(chǔ)。在波長260nm紫外線下，1OD值的光密度相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50μg/ml；單鏈DNA或RNA為20μg/ml?？梢源蝸碛嬎愫怂針悠返臐舛取?yōu)缺點(diǎn)：只用于測定濃度大于0.25μg/ml的核酸溶液第9頁，共12頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期五熒光光度法即瓊脂糖凝膠電泳法。溴化乙錠在紫外光照射下能發(fā)射熒光，它插入到DNA分子中形成熒光結(jié)合物，使發(fā)射的熒光增強(qiáng)幾十倍，而熒光的強(qiáng)度正比于DNA的含量，將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品作為電泳對照，就可以估計出待測樣品的濃度。用量只需要5-10ngDNA即可，肉眼觀察可檢測0.05g-0.1g的DNA。該方法只是估計水平，另外還應(yīng)考慮DNA或RNA樣品中分子大小與標(biāo)準(zhǔn)對照中核酸分子的長度。第10頁，共12頁，2022年，5月20日，6點(diǎn)3分，星期五小節(jié)根據(jù)不同情況以及實(shí)驗(yàn)條件選擇合適的檢測方法。無論何種方法，均需保證待測樣品的核酸（DNA或RNA)純度。根據(jù)