臨床病原微生物標本及其耐藥機制檢測課件

臨床微生物及其耐藥機制檢測安徽省細菌耐藥監(jiān)控中心安徽醫(yī)科大學臨床檢驗診斷學教研室安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗科徐元宏一、正確留取標本是獲得準確結果的前提1.血液、骨髓、無菌體液：（1）嚴格消毒、避免體表正常菌群的污染。（2）應在抗生素使用之前抽血。如果病人已使用抗生素，應選擇含中和劑（活性炭、中性樹脂）的培養(yǎng)瓶，或在下次用藥前采血。（3）由于血液、骨髓、無菌體液含有極少量的病原體，就可以造成感染性疾病，而實驗室檢出率與病原體數量有關，并非只要有病原體就能檢驗出來，因此血液、骨髓、無菌體液等必須增菌才能獲得滿意結果。成人未使用抗生素治療采集骨髓0.5-1毫升，血液、胸腹水、關節(jié)液3-10毫升接種成人培養(yǎng)瓶（藍蓋）；成人已使用抗生素治療采集上述標本接種加中性樹脂培養(yǎng)瓶（灰蓋）；兒童采集骨髓0.5-1毫升，血液、胸腹水，關節(jié)液1-3毫升接種兒童培養(yǎng)瓶（紅蓋）；厭氧培養(yǎng)接種上述標本3-10毫升于厭氧培養(yǎng)瓶（黃蓋）。（4）由于菌血癥、敗血癥是間歇排菌，應在發(fā)熱高峰時采血，對于感染性心內膜炎患者增加采血次數，以提高陽性率。2.導管相關性的血流感染（CRBSI）血培養(yǎng)（1）第一采集方法經外周靜脈穿刺采血》1套（送兩個培養(yǎng)瓶）；從導管中心或靜脈留置口隔膜采血1套，兩者的采血時間應該接近（《5分鐘）。結果解釋：（a）依據細菌鑒定賀藥敏試驗確認，若兩套陽性血培養(yǎng)是同一種細菌，又沒有其它部位的感染，提示CRBSI；（b）若兩套陽性血培養(yǎng)瓶是同一種細菌，從導管采血血培養(yǎng)報告陽性時間比外周靜脈穿刺采血早》120分鐘，又沒有其它部位的感染，提示CRBSI；（e）若只有外周靜脈穿刺采血的血培養(yǎng)是陽性，但分離菌為金黃色葡萄球菌或念珠菌，且沒有任何其它部位感染的證據，提示高度可疑為CRBSI；（f）若再次導管采血/外周采血，若培養(yǎng)陽性，且是同一種細菌，可定為CRBSI；（2）第二種采集方法：外周靜脈穿刺采血采集1～2套，同時拔出導管，用Maki導管平皿滾動法，對導管尖片段進行半定量培養(yǎng)。（c）若所有的血培養(yǎng)和導管片段培養(yǎng)是陰性，不太可能是CRBSI；（d）如果有》1套的血培養(yǎng)是陽性，導管片段的培養(yǎng)是陰性，但分離株是金黃色葡萄球菌或念珠菌，且沒有任何其它部位的感染證據，提示仍有可能是CRBSI。3.尿液：（1）導尿法：是一種較好的無菌采集法，主要適用于手術后患者，取10-15毫升尿液于無菌容器內送檢，但留置導尿管易造成醫(yī)院內感染。（2）中段尿采集法：是臨床上最多采用的方法，女性病人先以肥皂水或1：1000高錳酸鉀水溶液沖洗外陰及陰道口；男性病人應翻轉包皮沖洗，用1：1000新潔爾滅消毒尿道口，在用無菌紗布擦干，讓病人排尿，棄去前段尿，收集中段尿10—20ml，盛于無菌容器內，立即加蓋送檢。（3）腎盂尿采集法：為確定菌尿是否來自腎臟，可用導尿管采集腎盂尿。首先充分沖洗膀胱，以最后一次沖洗尿作對照，后用導尿管插入輸尿管，分別標記左右側，收集3次尿；如果輸尿管菌數比對照尿菌數多或第3次尿中菌數比第1次多，該菌尿可能來自腎臟。反之，如果第1次尿菌數多于第3次尿菌數，則可能來自膀胱。腎盂尿采集法一般應該請泌尿科醫(yī)師協(xié)助進行，并確實做好標記，以防左右側搞錯。4.痰液：正常人下呼吸道是無菌的，上呼吸道有正常菌群寄居。下呼吸道的分泌物必須通過上呼吸道，常受上呼吸道的正常菌群的污染。因此對于下呼吸道分泌物培養(yǎng)出來的結果必須分析、判斷。一般要求病人清晨用無菌生理鹽水漱口6次，再用冷開水漱口一次，用力咳深部的痰液于無菌容器內送檢，避免口水的污染。對于痰液不能自主咳出，可采用高滲鹽水霧化吸入排痰。

實驗室在收到痰標本，涂片革蘭染色（SEC<10/LPF，WBC>25/LPF）可做細菌培養(yǎng)，記錄涂片結果，SEC>25/LPF，WBC<10/LPF，視為污染，建議重留標本；介于二者之間做細菌培養(yǎng)，記錄涂片結果，結合培養(yǎng)后細菌數量考慮是否是致病菌。合格的痰標本用無菌生理鹽水約20毫升漂洗2次，用等量的sputosol作用20分鐘。用接種環(huán)四區(qū)劃線，從一區(qū)到另一區(qū)應滅菌，接種直徑9厘米的血平板兩塊，巧克力平板一塊，沙包氏培養(yǎng)基。5.皮膚、創(chuàng)面：首先按常規(guī)消毒皮膚，然后用無菌注射器抽吸皮下病變部分，或用無菌棉簽取痂下膿性分泌物。6.生殖道分泌物：根據病人主述臨床癥狀，采用不同方式取材：若病人白帶呈淡黃色，稀水樣，考慮滴蟲感染，用無菌棉簽取陰道分泌物于1毫升生理鹽水內送檢，注意保溫，因為目前滴蟲的檢驗主要看鞭毛擺動的動力。若病人白帶呈“豆腐渣”樣，燒癢癥狀，用無菌棉簽取“豆腐渣”樣白帶送檢，選擇不同的送檢方式和檢驗方法可獲得不同的檢驗結果，其方法有生理鹽水直接鏡檢、涂片加NaOH破壞上皮細胞鏡檢、革蘭氏染色鏡檢，一般認為革蘭染色鏡檢是較為理想的方法。對于口腔、陰道等部位由于采用染色方法提高酵母菌檢驗靈敏度，對于是定植還是致病，目前缺少診斷依據。若懷疑淋病患者，對于男性急性患者，用一支棉簽擦去尿道口膿液，輕輕擠壓尿道口，再用一支棉簽取其膿液；對于男性慢性患者或治療后復查的患者，用一支棉簽伸入尿道口2-4厘米，停留數秒鐘，旋轉取出，因為尿道口寄居的是鱗狀上皮細胞，尿道2-4厘米寄居的是柱狀上皮細胞，這是淋球菌寄居的地方。對于女性患者，用溫水濕潤的擴陰器，取陰道分泌物或宮頸分泌物，棉簽停留數秒鐘，讓棉簽充分吸附分泌物。從直腸取材時，應將棉簽插入肛門2.5厘米以上，碰到糞便，應換一個棉簽重取。檢查淋球菌性咽炎時，應從扁桃體及扁桃體窩取材。支原體檢查：支原體是簡單的原核細胞，沒有細胞壁，缺乏許多細胞器，直接鏡檢沒有意義，只有通過培養(yǎng)，取材顯得重要，采集標本時，男性患者可用尿道拭子或清晨中段尿培養(yǎng)，女性推薦陰道拭子。衣原體檢查：采取尿道標本，至少在排尿1小時后采集，對于男性尿道取材，棉拭子應伸入尿道2-4厘米（因為衣原體寄生在粘膜柱狀上皮細胞，而不是寄生在復層鱗狀上皮細胞中），轉動拭子以獲得細胞；對于女性尿道取材，先用一個拭子擦凈尿道口，再用棉拭子（小）伸入尿道2厘米，輕輕轉動拭子取出，對于女性宮頸取材，用溫水濕潤的擴陰器擴張陰道，先用一個拭子擦凈宮頸口，然后再用棉拭子（?。┥烊雽m頸內1-2厘米，用力摩擦采取宮頸細胞，不采用膿液作培養(yǎng)。直腸取材，可將拭子插入肛門括約肌，在肛門和直腸結合處沿腸壁轉動，持續(xù)10-30秒，以吸取微生物，并避免糞便的污染。尿液、精液、服過抗生素的病人標本以及新近用過某些陰道制劑、清潔劑等病人標本不宜作衣原體檢查。二、正確檢驗病原體1.及時接種，選擇合適培養(yǎng)基：由于體外環(huán)境不是微生物生長的最適宜環(huán)境，微生物怕冷、熱、光、干燥、消毒劑，因此實驗室接受標本后，應立即接種；不同微生物需要不同的營養(yǎng)要求和環(huán)境，選用不同的培養(yǎng)基，制備不同的環(huán)境，例如解脲支原體需要解脲支原體培養(yǎng)基，腦膜炎奈瑟氏菌需要營養(yǎng)豐富的巧克力血平板和5-10%CO2，淋球菌需要Thayer-Martin（T-M）、NYC培養(yǎng)基和5-10%CO2。除此之外，為了更好分離致病菌、抑制正常菌群和污染菌，需要加入一些營養(yǎng)因子和抑菌劑。例如淋球菌T-M培養(yǎng)加入血紅蛋白、萬古霉素、多粘菌素、制霉菌素、磺胺嘧啶。萬古霉素抑制葡萄球菌的生長，多粘菌素抑制銅綠假單胞菌的生長，制霉菌素抑制念珠菌的生長，磺胺嘧啶抑制變形桿菌的生長。有利的一面，利于淋球菌的的識別；不利的一面是遺漏可能的致病菌，患者易產生繼發(fā)感染：繼發(fā)霉菌性陰道炎、淋病治愈后葡萄球菌性尿道炎。3.如何從眾多的正常菌群中辨別致病菌？采用營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基和適宜的環(huán)境滿足致病菌的生長。采用含抑制劑的培養(yǎng)基篩選致病菌。如解脲支原體培養(yǎng)基除含小牛血清外，還含有青霉素；分離大腸埃希氏菌O157，H7所用培養(yǎng)基是山梨醇麥康凱培養(yǎng)基。運用豐富、扎實的知識識別致病菌。對于痰液：致病菌是腦膜炎奈瑟氏菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、奴卡氏菌；可能致病菌是念珠菌、金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌（指除凝固酶陽性的金黃色葡萄球菌之外的所有凝固酶陰性葡萄球菌統(tǒng)稱，目前包括31個種，是一種習慣稱法）、肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌、卡他粘膜炎奈瑟氏菌等。一般不是致病菌是指草綠色鏈球菌。對于尿液：分離到兩種以下的細菌，可能是病人寄居的細菌，若分離到三種或三種以上，可能是污染菌，建議病人重新留取標本。在報告細菌的同時，應報告菌落計數，過去認為對于革蘭陰性桿菌≥105

CFU/ml有致病意義，革蘭陽性球菌≥104

CFU/ml有致病意義；現在認為只要病人有主述癥狀，菌落計數≥100CFU/ml就有致病意義。通過墨汁染色可以直接判斷有無新型隱球菌感染。菌落特征有突起、凹陷、色澤、色素等表面特征：肺炎鏈球菌呈現肚臍樣凹陷，沙雷氏菌出現紅色色素，銅綠假單胞菌有綠色、無色色素，有姜味氣味，可呈現粘液型菌落、粗糙型菌落、光滑型菌落。5.正確鑒別病原菌對于細菌而言，主要依據表型特征，菌體、菌落形態(tài)，溶血性、生化反應，血清凝集將細菌鑒定。革蘭陽性球菌中葡萄球菌主要依據凝固酶、新生霉素抑菌試驗、生化反應來判斷；腸球菌依據6.5%NaCL、膽汁七葉苷與葡萄球菌、鏈球菌鑒別，依據甘露醇、山梨醇、山梨糖、精氨酸、阿拉伯糖、棉子糖、動力、黃色素、蔗糖、丙酮酸鹽來鑒別屬內12個種；鏈球菌屬依據cAMP、DNA、桿菌肽、血清凝集來鑒別。革蘭陰性球菌主要依據氧化酶、DNA酶、生化反應來鑒別，淋球菌氧化酶陽性、DNA酶陰性、葡萄糖陽性、乳糖陰性、麥芽糖陰性、甘露糖陰性、蔗糖陰性；腦膜炎奈瑟氏菌氧化酶陽性、DNA酶陰性、葡萄糖陽性、乳糖陰性、麥芽糖陽性、甘露糖陰性、蔗糖陰性。革蘭陽性桿菌主要依據菌體、菌落，特征性染色來鑒別，結核分枝桿菌抗酸染色陽性，白喉棒狀桿菌Albert染色出現異染顆粒，產單核李斯特菌溶血性和動力。革蘭陰性桿菌主要依據氧化酶、氧化-發(fā)酵（O-F）試驗來判斷。氧化酶陰性、氧化-發(fā)酵（O-F）發(fā)酵腸桿菌科編碼補充生化反應鑒定到種。對于致病性大腸埃希菌、志賀菌、沙門菌還需血清學凝集。氧化酶陰性、氧化-發(fā)酵（O-F）氧化

氧化酶陽性、氧化-發(fā)酵（O-F）氧化/-非發(fā)酵菌編碼補充生化反應鑒定到種。氧化酶陽性、氧化-發(fā)酵（O-F）發(fā)酵弧菌科編碼補充生化反應、血清學凝集鑒定到種，如霍亂弧菌O1、O139等。對于真菌而言，主要依據菌體形態(tài)、菌落形態(tài)、色素，同化試驗、發(fā)酵試驗來鑒別至種屬。實驗室人員困惑：由于上述細菌、真菌鑒定依靠表型特征，表型是受基因控制，同一基因型可能有不同種表型，同一表現型可能受不同基因型所控制。根據表現型判斷的菌體能代表真正的菌屬嗎？隨著分子生物學的發(fā)展，人們能任意改造表現型。我們能有所作為嗎？三、恰如其分報告藥敏結果藥敏試驗中藥敏紙片選用：臨床醫(yī)生經常反映，實驗室所報告的藥敏試驗結果，臨床根本或很少使用這類藥物，實驗室藥敏試驗中藥物是敏感，臨床使用無效。如何聯(lián)合用藥、合理用藥？實驗室人員應根據可能的細菌種類、細菌的菌屬，合理選用藥敏紙片，報告檢驗結果。實驗室應根據美國FDA推薦臨床微生物實驗室苛養(yǎng)菌和非苛養(yǎng)菌分組的藥物選用，它將藥物分為四組：A組，一級試驗并常規(guī)報告的抗生素；B組，一級有選擇報告的抗生素；C組，補充試驗，有選擇報告的抗生素；U組，用于泌尿道補充試驗的藥物。例如對于腸桿菌科細菌常規(guī)報告的抗生素有氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢噻吩、慶大霉素；選擇報告的抗生素有阿米卡星、阿莫西林/棒酸或氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/棒酸、頭孢孟多或頭孢尼西或頭孢呋辛、頭孢吡肟、頭孢美唑、頭孢哌酮、頭孢替坦、頭孢西丁、頭孢噻肟或頭孢唑肟或頭孢曲松、環(huán)丙沙星或左氧氟沙星、亞胺培南或美羅培南、美洛西林或哌拉西林、替卡西林、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑。對于銅綠假單胞菌和不動桿菌常規(guī)報告的抗生素有頭孢他啶、慶大霉素、美洛西林或替卡西林、哌拉西林，選擇報告的抗生素有阿米卡星、氨曲南、頭孢哌酮、頭孢吡肟、環(huán)丙沙星、亞胺培南或美羅培南、妥布霉素。對于葡萄球菌常規(guī)報告的抗生素有苯唑青霉素、青霉素，選擇報告的抗生素有阿奇霉素或克拉霉素或紅霉素、克林霉素、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑、萬古霉素。對于腸球菌常規(guī)報告的抗生素有青霉素/氨芐西林，選擇報告的抗生素有萬古霉素。對于嗜血桿菌常規(guī)報告的抗生素有氨芐西林、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑，選擇報告的抗生素有頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢唑肟或頭孢曲松、頭孢呋辛鈉（針劑）、氯霉素、美羅培南。對于肺炎鏈球菌常規(guī)報告的抗生素有紅霉素、青霉素（苯唑青霉素）、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑，選擇報告的抗生素有格帕沙星、左氧氟沙星或司氟沙星、氧氟沙星、四環(huán)素、萬古霉素。對于除肺炎鏈球菌以外其它鏈球菌常規(guī)報告的抗生素有紅霉素、青霉素、氨芐西林，選擇報告的抗生素有氯霉素、克林霉素、萬古霉素、頭孢吡肟或頭孢他啶或頭孢曲松、左氧氟沙星、氧氟沙星、Linezolid、奎奴普汀/達福普汀。對于淋球菌常規(guī)報告β-內酰胺酶結果，如β-內酰胺酶陽性提示青霉素、氨芐西林和阿莫西林耐藥，但淋球菌更多的是染色體介導的耐藥，需要做補充藥敏試驗，選擇報告的抗生素有頭孢克肟或頭孢噻肟或頭孢泊肟或頭孢唑肟或頭孢曲松、頭孢美唑、頭孢替坦、頭孢西丁、頭孢呋辛、環(huán)丙沙星、格帕沙星或氧氟沙星、青霉素、大觀霉素、四環(huán)素。遵循嚴格的操作方法、施加質量控制：紙片擴散法（K-B））法、液體稀釋法必須遵循NCCLS（CLSI）規(guī)定，它對紙片厚度、藥物濃度、培養(yǎng)基、培養(yǎng)環(huán)境、孵育溫度、操作方法都有詳細規(guī)定。E-test必須按照其說明要求進行。運用豐富的理論知識，提示臨床用藥：對于腸道分離的沙門菌和志賀菌屬，常規(guī)僅測試氨芐西林、一種喹諾酮類藥物和TMP/SMZ藥物，1、2代頭孢菌素盡管體外敏感，但臨床治療無效，實驗室不能做此藥敏試驗。對于腸道外分離株，沙門氏菌屬還一定要測試并報告氯霉素和某一種三代頭孢菌素。對于MRSA、MRSCON、ESBLs、高耐慶大霉素腸球菌、AmpC-β-內酰胺酶應有所選擇性報告藥敏結果，有時體外藥敏結果是敏感的也要報告耐藥。1.藥敏試驗種類和方法：（1）細菌藥敏試驗紙片擴散法液體稀釋法E-test法（2）酵母樣真菌藥敏試驗紙片擴散法液體稀釋法E-test法淺部真菌目前尚沒有標準方法。細菌藥敏試驗-紙片擴散法Kirby-BaueragardiskdiffusionPaperdiskcontainingantibioticisplacedonlawnofbacteria,thenincubatedovernight.DiameterofzoneofinhibitionisinverselyrelatedtoMIC(usedtoestablishinterpretivebreakpoints).Standardizedforcommonlyisolated,rapidlygrowingorganisms.細菌藥敏試驗-液體稀釋法Minimalinhibitoryconcentration(MIC)Referencemethod.Addstandardinoculumtodilutionsofantibiotic.Incubateovernight.MICislowestconcentrationthatinhibitsgrowth(canalsobeperformedbyagardilution).Interpretation(SorR)isbasedonachievabledruglevels104

cfu420mg/ml細菌藥敏試驗-E-test法E-testStripscontainingagradientofantibioticareplacedonlawnofbacteriaandincubatedovernight.MICisdeterminedatpointwherezoneofinhibitionintersectsscaleonstrip.CombineseaseofKBwithanMICmethod.ParticularlyusefulforS.pneumoniae.四、耐藥機制檢測1、耐甲氧西林葡萄球菌檢測（1）β-內酰胺酶檢測試驗方法：Nitrocefin試驗孵育時間：Nitrocefin試驗需1h或按產品說明進行。結果：Nitrocefin試驗：從黃色變成紅或粉紅色＝β-內酰胺酶陽性QC建議：金黃色葡葡球菌ATCC29213-陽性；金黃色葡萄球菌ATCC25923-陰性報告：β-內酰胺酶陽性葡萄球菌對青霉素，氨基-、羧基-、和脲基青霉素耐藥。（2）苯唑西林耐藥檢測金黃色葡萄球菌試驗方法：瓊脂稀釋法培養(yǎng)基：含4%NaClMHA抗生素濃度：6μg/ml苯唑西林接種物：直接菌落懸液獲得0.5麥氏濁度。使用1μl接種環(huán)蘸取菌液，在平板上涂成直徑10到15mm斑點。替代方法，用棉拭子蘸菌液涂成類似大小斑點或劃滿四分之一區(qū)。孵育條件：33-35℃；空氣（試驗溫度高于35℃不能檢出MRSA）。孵育時間：24h

結果：用透射光仔細檢查＞1個菌落或存在淡的膜狀生長。＞1個菌落＝苯唑西林耐藥。QC建議：金黃色葡葡球菌ATCC29213-敏感；金黃色葡萄球菌ATCC43300-耐藥。報告：苯唑西林耐藥葡萄球菌對所有β-內酰胺類藥物耐藥；其他β-內酰胺類藥物應被報告耐藥或不報告。（3）使用頭孢西丁測mecA介導的苯唑西林耐藥－紙片擴散法：適合所有葡萄球菌培養(yǎng)基：MHA抗生素濃度：30μg頭孢西丁紙片接種物：標準的紙片擴散法推薦孵育條件：33-35℃；空氣（試驗溫度高于35℃不能檢出MRSA）孵育時間：16-18h（金黃色葡萄球菌和路鄧葡萄球菌）；24h（凝固酶陰性葡萄球菌）結果：≤21mm=mecA陽性≥21mm＝mecA陰性－金黃色葡萄球菌和路鄧葡萄球菌；≤24mm=mecA陽性≥25mm＝mecA陰性－凝固酶陰性葡萄球菌。QC建議：金黃色葡萄球菌ATCC25923-mecA陰性(抑菌環(huán)直徑23-29mm)金黃色葡葡球菌ATCC43300-mecA陽性（抑菌環(huán)直徑≤21mm）報告：頭孢西丁被用于檢測mecA介導苯唑西林耐藥的替代品。mecA陽性菌株應報告對苯唑西林（非頭孢西丁）耐藥；其他β-內酰胺類藥物應被報告耐藥或不報告由于罕見非mecA介導的苯唑西林耐藥機制，對于凝固酶陰性葡萄球菌，mecA陰性但苯唑西林MIC是耐藥(MIC≥0.5μg/ml)菌株應報告苯唑西林耐藥；對于金黃色葡萄球菌和路鄧葡萄球菌，mecA陰性但苯唑西林MIC是耐藥(MIC≥4μg/ml)菌株應報告苯唑西林耐藥。（4）使用頭孢西丁測mecA介導的苯唑西林耐藥－肉湯微量稀釋法：適合金黃色葡萄球菌和路鄧葡萄球菌培養(yǎng)基：CAMHB抗生素濃度：4μg/ml頭孢西丁接種物：標準肉湯稀釋法推薦孵育條件：33-35℃；空氣（試驗溫度高于35℃不能檢出MRSA）孵育時間：16-20h結果：＞4μg/ml=mecA陽性；≤4μg/ml=mecA陰性QC建議：金黃色葡葡球菌ATCC29213-mecA陰性(MIC1-4μg/ml)金黃色葡萄球菌ATCC25923-mecA陰性(抑菌環(huán)直徑23-29mm)金黃色葡葡球菌ATCC43300-mecA陽性（MIC＞4μg/ml或抑菌環(huán)直徑≤21mm；報告：頭孢西丁被用于檢測mecA介導苯唑西林耐藥的替代品。mecA陽性菌株應報告對苯唑西林（非頭孢西丁）耐藥；其他β-內酰胺類藥物應被報告耐藥或不報告由于罕見非mecA介導的苯唑西林耐藥機制，mecA陰性但苯唑西林MIC是耐藥(MIC≥4μg/ml)菌株應報告苯唑西林耐藥。2、萬古霉素敏感性減低的金黃色葡萄球菌試驗方法：瓊脂稀釋法培養(yǎng)基：BHI瓊脂抗生素濃度：6μg/ml萬古霉素接種物：直接菌落懸液獲得0.5麥氏濁度。使用微量吸管取菌液10μl，點種瓊脂平板表面。替代方法，用棉拭子蘸菌液，擠去多余菌液，在平板上涂成直徑10到15mm斑點或在部分區(qū)域劃線接種。孵育條件：35±2℃；空氣孵育時間：24h結果：用透射光仔細檢查＞1個菌落或存在淡的膜狀生長。＞1個菌落＝推測對萬古霉素敏感性減低QC建議：糞腸球菌ATCC29212－敏感糞腸球菌ATCC51299－耐藥3、誘導克林霉素耐藥－紅霉素耐藥、克林霉素敏感或中介葡萄球菌試驗方法：紙片擴散法培養(yǎng)基：MHA或用于MIC測試的血瓊脂平板抗生素濃度：15μg紅霉素紙片和克林霉素紙片間隔15mm距離接種物：標準紙片擴散法推薦或濃菌液接種平板表面孵育條件：35±2℃；空氣孵育時間：16-18h結果：與紅霉素相鄰側抑菌環(huán)邊緣出現“截平”(“D”抑菌環(huán))＝誘導克林霉素耐藥試驗方法：肉湯微量稀釋法培養(yǎng)基：CAMHB抗生素濃度：在同一孔加4μg/ml紅霉素和0.5μg/ml克林霉素接種物：標準微量肉湯稀釋法推薦孵育條件：35±2℃；空氣孵育時間：18-24h結果：任何生長＝誘導克林霉素耐藥；無生長＝無誘導克林霉素耐藥。報告：誘導克林霉素耐藥分離菌應報告“克林霉素耐藥”在報告中可加入“通過誘導克林霉素耐藥試驗，推測此菌株對克林霉素耐藥，克林霉素對某些病人可能仍有效”注釋。QC建議：金黃色葡萄球菌ATCCBAA-976或金黃黃色葡萄球菌ATCC29213-不生長金黃黃色葡萄球菌ATCCBAA-977-生長。4、超廣譜B內酰胺酶檢測（1）ESBLs紙片法培養(yǎng)基：MH瓊脂抗菌藥物濃度：肺炎克雷伯菌、產酸克雷伯菌和大腸埃希菌：頭孢泊肟10μg或頭孢他啶30μg或氨曲南30μg或頭孢噻肟30μg或頭孢曲松30μg；奇異變形桿菌：頭孢泊肟10μg或頭孢他啶30μg或頭孢噻肟30μg(使用一種以上的藥物進行篩選將會提高檢測的敏感性)頭孢他啶30μg頭孢他啶/克拉維酸30/10μg和頭孢噻肟30μg頭孢噻肟/克拉維酸30/10μg(確證試驗需要同時使用頭孢噻肟和頭孢他啶，單獨和聯(lián)合克拉維酸的復合制劑)孵育條件：35℃±2℃；空氣孵育時間：16-18h結果：肺炎克雷伯菌、產酸克雷伯菌和大腸埃希菌：頭孢泊肟抑菌環(huán)直徑≤17mm頭孢他啶抑菌環(huán)直徑≤22mm氨曲南抑菌環(huán)直徑≤27mm頭孢噻肟抑菌環(huán)直徑≤27mm頭孢曲松抑菌環(huán)直徑≤25mm奇異變形桿菌：頭孢泊肟抑菌環(huán)直徑≤22mm頭孢他啶抑菌環(huán)直徑≤22mm頭孢噻肟抑菌環(huán)直徑≤27mm上述抑菌環(huán)直徑提示菌株可能產生ESBLs。2個藥物中有任何一個，在加克拉維酸后，抑菌環(huán)直徑與不加克拉維酸的抑菌環(huán)相比，增大值≥5mm時，判定為產ESBLs（例如，頭孢他啶的抑菌環(huán)＝16mm；頭孢他啶/克拉維酸的抑菌環(huán)＝21mm）QC建議：大腸埃希菌ATCC25922；肺炎克雷伯菌ATCC700603（2）ESBLs肉湯稀釋法法培養(yǎng)基：CAMHB抗菌藥物濃度：肺炎克雷伯菌、產酸克雷伯菌和大腸埃希菌：頭孢泊肟4μg/ml或頭孢他啶1μg/ml或氨曲南1μg/ml或頭孢噻肟1μg/ml或頭孢曲松1μg/ml奇異變形