氨甲喋呤聯(lián)合咖啡因?qū)侨饬黾?xì)胞株的作用觀察

氨甲喋呤結(jié)合咖啡因?qū)侨饬黾?xì)胞株的作用觀察【摘要】［目的］觀察氨甲喋呤結(jié)合咖啡因?qū)侨饬黾?xì)胞株的作用。［方法］以國(guó)人骨肉瘤細(xì)胞株S-732細(xì)胞為研究對(duì)象，根據(jù)析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)原因，設(shè)1無(wú)藥組〔陰性對(duì)照組〕，2咖啡因組，3氨甲喋呤組，4咖啡因、氨甲喋呤結(jié)合用藥組〔混合用藥組〕。培養(yǎng)一段時(shí)間后，分別采用TT法細(xì)胞毒性試驗(yàn)和流式細(xì)胞儀〔F〕分析，觀察3組藥物對(duì)細(xì)胞的毒性〔用殘存細(xì)胞吸光度A值表示〕及細(xì)胞周期的影響。［結(jié)果］F分析各組于48hG2/期細(xì)胞比例〔%〕為1組〔23.210±0.416〕，2組為〔23.120±0.440〕，3組為〔28.770±0.531〕，4組〔23.267±0.319〕，1組與2組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P＜0.01〕。各組殘存細(xì)胞吸光度A值為1組〔0.411±0.006〕，2組〔0.401±0.006〕；3組〔0.304±0.007〕，4組〔0.105±0.002〕，組間差異及交互作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P＜0.01)。［結(jié)論］氨甲喋呤與咖啡因具有協(xié)同作用，可增加氨甲喋呤對(duì)骨肉瘤細(xì)胞株的抑制率。【關(guān)鍵詞】骨肉瘤；氨甲喋呤；咖啡因；腫瘤細(xì)胞,培養(yǎng)的Abstrat［bjetive］TbservehetherrntaffEineaniprvetheyt-txiityeffetfethtrexate(TX)nstesaraellline.［ethd］stesaraell(S-732)ereinubatedithndrug,affEIne,TXrTXaddingaffeineseparately,anderenaedasntrlgrup,affeinegrup,TXgrupandixinggruprespetively.TheratisfellsnG2phasefeahgrupereeasuredithflytetryafter48hinubatinandtheellinhibitinratisereeasurediththeTTlrietrianalysisafter72hinubatin.［Result］Theratis(%)fellsnG2phaseerentrlgrup〔23.210±0.416),affeinegrup〔23.120±0.440),TXgrup〔28.770±0.531〕andixinggrup〔0.105±0.002〕(P＜0.01,exeptntrlgrupbeteenaffeinegrup),theabsrbenyfsurvivalell(Avalue)erentrlgrup〔0.411±0.006),affeinegrup〔0.401±0.006〕；TXgrup〔0.304±0.007〕andixinggrup〔0.105±0.002〕(P＜0.01).［nlusin］affeineaniprvetheyt-txiityeffetfTXnstesaraellline.Keyrds：stesara;TX;affeine;turell,inubatin腫瘤細(xì)胞在化療藥物作用后,有的會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞周期受阻的現(xiàn)象，包括G1停滯，S期蓄積，G2期阻滯等。G2期阻滯被認(rèn)為是細(xì)胞的一種保護(hù)性調(diào)節(jié)，可以使DNA受損的細(xì)胞獲得充分的修復(fù)時(shí)間，從而順利地進(jìn)入下一個(gè)細(xì)胞周期，防止被誘導(dǎo)凋亡。咖啡因是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的腫瘤化療增加劑，主要作用機(jī)理是縮短G2期阻滯。氨甲喋呤作用于骨肉瘤細(xì)胞后會(huì)不會(huì)出現(xiàn)G2期阻滯，參加咖啡因能否增加其細(xì)胞毒性，目前尚缺乏試驗(yàn)根據(jù)。1材料與方法1.1材料S-732細(xì)胞株購(gòu)于北京積水潭醫(yī)院創(chuàng)傷骨科研究所，RPI1640干粉及胰酶購(gòu)于美國(guó)ib公司，氨甲喋呤購(gòu)于浙江萬(wàn)馬藥業(yè)，咖啡因購(gòu)于美國(guó)Siga公司，F(xiàn)美國(guó)ulter公司消費(fèi)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀美國(guó)da公司消費(fèi)，2孵箱Sheldnanufaturing公司消費(fèi)，倒置顯微鏡重慶光學(xué)儀器廠消費(fèi)，96孔培養(yǎng)板NunlnInternatinal公司消費(fèi)。1.2方法1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于體積分?jǐn)?shù)為10%新生小牛血清〔經(jīng)56℃30in水浴滅活〕的RPI1640培養(yǎng)液中，其中含有青霉素100IU/l及鏈霉素100μg/l，在37℃體積分?jǐn)?shù)為5%2、95%空氣、飽和濕度的2孵箱內(nèi)閉式培養(yǎng)。取傳代后第3d處于指數(shù)增殖期的細(xì)胞備用。1.2.2細(xì)胞處理取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，以少量胰蛋白酶將貼壁細(xì)胞消化、離心，倒去上清液，參加適量RPI1640培養(yǎng)液，用吸管反復(fù)吹打均勻制成細(xì)胞懸液。根據(jù)析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理將細(xì)胞株分為4組，1組無(wú)藥組〔陰性對(duì)照組〕；2組咖啡因組，培養(yǎng)液內(nèi)參加咖啡因，濃度為5.0l/L；3組氨甲喋呤組，培養(yǎng)液內(nèi)參加氨甲喋呤，濃度為320μg/l；4組混合用藥組，培養(yǎng)液內(nèi)同時(shí)參加濃度為5.0l/L的咖啡因與濃度為320μg/l的氨甲喋呤。同時(shí)調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/l。各組細(xì)胞參加96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)3復(fù)孔，每孔200μl。置37℃體積分?jǐn)?shù)為5%2、95%空氣、飽和濕度的2孵箱內(nèi)閉式培養(yǎng)，供測(cè)量各組藥物的細(xì)胞抑劑率。同時(shí)各組取一樣濃度的細(xì)胞懸液10l于培養(yǎng)瓶中在37℃體積分?jǐn)?shù)為5%2、95%空氣、飽和濕度的2孵箱內(nèi)閉式培養(yǎng)供觀察G2期比例。1.2.3流式細(xì)胞儀〔F〕對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)展分析將置于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的各組細(xì)胞于48h取出，以0.25%胰蛋白酶消化3～5in，至貼壁細(xì)胞間出現(xiàn)篩狀間隙為止。棄去消化液，加Hank’s液。用吸管將細(xì)胞自瓶壁上輕輕吹打下來(lái)，并移入離心管中。短時(shí)低速離心〔1000r/in，5in)。棄上清，加冷PBS〔pH7.4)，均勻吹打，并短時(shí)低速離心3次〔1000r/in,5in)以去除懸液中的細(xì)胞碎片。再次參加冷PBS〔pH7.4)均勻吹打，制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞液以500目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，以去除重疊成團(tuán)的細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/l。在4℃冰箱內(nèi)進(jìn)展熒光染色后用流式細(xì)胞檢測(cè)G2期細(xì)胞百分比。每組細(xì)胞測(cè)3次，用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)結(jié)果進(jìn)展方差分析。1.2.4TT法測(cè)定各組細(xì)胞的A值及抑制率72h后將96孔板取出，每孔再加1∶2稀釋的TT應(yīng)用液〔5g/l)20μl,繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄除上清液，于每孔中參加10%的二甲亞砜10μl，振蕩5in，直到結(jié)晶完全溶解，液體呈藍(lán)紫色，然后在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上以570n波長(zhǎng)測(cè)定吸光度〔A〕值。并可根據(jù)A值計(jì)算出各組的細(xì)胞抑制率。用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)結(jié)果進(jìn)展方差分析，觀察各組間的差異及藥物間交互作用是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2結(jié)果2.1F分析各組48hG2期細(xì)胞所占比例〔表1〕1組與2組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P＜0.01〕。單獨(dú)應(yīng)用5.0l/L的咖啡因?qū)2期無(wú)明顯影響，單獨(dú)應(yīng)用氨甲喋呤時(shí)出現(xiàn)G2細(xì)胞比例增高，二者結(jié)合應(yīng)用后G2期細(xì)胞比例降低。表1各組48hG2期細(xì)胞所占比例〔略〕2.2TT法測(cè)定各組細(xì)胞72hA值〔表2〕各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P＜0.01〕。單獨(dú)應(yīng)用5.0l/L的咖啡因?qū)侨饬黾?xì)胞有細(xì)微影響，320μg/l的氨甲喋呤對(duì)骨肉瘤細(xì)胞有較大抑制作用，二者結(jié)合應(yīng)用后可明顯減少A值，對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制作用最明顯。根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析二者結(jié)合具有交互作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P＜0.01〕。表2TT法測(cè)定各組細(xì)胞的A值〔略〕3討論新輔助化療的開(kāi)展及新的細(xì)胞毒性藥物的使用使包括骨肉瘤在內(nèi)的許多腫瘤治療有了明顯改觀〔1〕，盡管如此，腫瘤細(xì)胞對(duì)多種化療藥物產(chǎn)生耐藥性仍是造成化療失敗的主要原因。傳統(tǒng)上對(duì)腫瘤耐藥及逆轉(zhuǎn)劑的研究主要集中在細(xì)胞膜/核膜蛋白，即藥物輸出泵：如P糖蛋白〔Pgp〕、多藥耐藥相關(guān)蛋白〔RP〕和肺耐藥相關(guān)蛋白〔LRP〕。已有的逆轉(zhuǎn)劑大局部是針對(duì)細(xì)胞P糖蛋白〔Pgp)，通過(guò)抑制P糖蛋白〔Pgp)對(duì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)化療藥物的外排作用，進(jìn)步細(xì)胞內(nèi)化療藥物的程度，來(lái)增加化療藥物的殺傷作用。如鈣離子通道阻滯劑，環(huán)孢酶素A及其衍生物，抗激素類化合物等，但其效果仍欠理想。近年來(lái)研究說(shuō)明，DNA作為多種抗癌藥物攻擊的靶分子，其損傷修復(fù)才能異常與腫瘤耐藥性的形成有著親密關(guān)系。因此，從DNA損傷修復(fù)的研究入手，將為腫瘤治療和耐藥性逆轉(zhuǎn)開(kāi)拓新的途徑。周期運(yùn)轉(zhuǎn)中的細(xì)胞有一種識(shí)別DNA損傷的才能，一旦出現(xiàn)DNA損傷，細(xì)胞周期就會(huì)受阻，包括G1停滯、S期蓄積和G2期阻滯，從而給細(xì)胞修復(fù)提供足夠的時(shí)間。細(xì)胞周期素(ylin)為重要的細(xì)胞周期蛋白的調(diào)控基因。目前發(fā)現(xiàn)的ylin有ylinA～H。ylinB主要出如今G2期〔2〕。其表達(dá)的產(chǎn)物細(xì)胞周期蛋白與P34d2蛋白復(fù)合物被稱為有絲分裂促進(jìn)因子(aturatinprtingfatr,PF)。在正常細(xì)胞，G2后期PF氨基酸被磷酸化或去磷酸化，從而具有激酶活性，進(jìn)而誘導(dǎo)一系列底物(如核層蛋白，H1組蛋白，核仁蛋白等)磷酸化，引導(dǎo)核膜崩解，染色質(zhì)凝聚等有絲分裂所具有的變化。細(xì)胞通過(guò)抑制ylinB表達(dá)，或抑制P34d2激酶活性，使細(xì)胞不能進(jìn)展有絲分裂，從而產(chǎn)生G2期阻滯。YaSL〔3〕等發(fā)現(xiàn)，咖啡因有活化受抑制的PF的才能。因此可以縮短甚至取消G2期阻滯，從而可以逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥。該原理在國(guó)外已經(jīng)臨床使用，并獲得不錯(cuò)的臨床效果〔4〕。國(guó)內(nèi)也開(kāi)場(chǎng)對(duì)此進(jìn)展研究。萬(wàn)雙林〔5〕等發(fā)現(xiàn)平安濃度的咖啡因在骨肉瘤細(xì)胞株(S-732)順鉑熱化療中具有增效作用，并發(fā)現(xiàn)咖啡因能促進(jìn)經(jīng)順鉑熱化療后的骨肉瘤細(xì)胞由G2/期向G0/G1期移行，導(dǎo)致G2/期縮短，細(xì)胞不能進(jìn)展足夠的DNA修復(fù)而進(jìn)入分裂期，從而加速細(xì)胞死亡。李鈞等〔6〕的研究說(shuō)明，咖啡因有促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的作用。目前在臨床上使用更多的RsenT12〔5〕化療方案，其中氨甲喋呤作用于骨肉瘤細(xì)胞后，是否出現(xiàn)G2期阻滯，咖啡因能否縮短甚至取消G2期阻滯，二者結(jié)合應(yīng)用能否增加腫瘤細(xì)胞抑制率，尚未見(jiàn)報(bào)道。作者根據(jù)析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)原因，設(shè)置4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，用F測(cè)定各組細(xì)胞于48hG2期比例，用TT法來(lái)測(cè)定各組藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞作用72h后殘存細(xì)胞吸光度，結(jié)果顯示，單純應(yīng)用5.0l/L咖啡因，對(duì)腫瘤細(xì)胞G2期比例無(wú)明顯影響，對(duì)腫瘤細(xì)胞有細(xì)微抑制；單純應(yīng)用氨甲喋呤，增加G2期比例，對(duì)腫瘤細(xì)胞有抑制作用；二者合用后G2期比例有明顯降低，對(duì)細(xì)胞抑制明顯。根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，二者間交互作用具有統(tǒng)計(jì)意義〔P＜0.01〕。本實(shí)驗(yàn)提示，氨甲喋呤與咖啡因結(jié)合，可以進(jìn)步對(duì)骨肉瘤細(xì)胞株的抑制作用。但由于體外細(xì)胞培養(yǎng)不能模擬體內(nèi)的三維構(gòu)造，不能準(zhǔn)確地反映藥物在人體中的全面作用，因此，本試驗(yàn)結(jié)果需要更進(jìn)一步的驗(yàn)證。【參考文獻(xiàn)】〔1〕郭全義，盧世璧，張莉，等.骨肉瘤的治療及生存率的多因素分析［J］.中國(guó)矯形外科雜志，2022，14：497-499.〔2〕SandbergAveryA,BridgeJuliaA.Updatesntheytgenetisandleulargenetisfbneandsfttissuetursstesaraandrelatedturs［J］.anerGenetytgenet,2022,145:50-55.〔3〕YaSL,AkharAJ,kennaKA,etal.Seletiveradisensitivizatinfp53defiientellsbyaffEine-ediatedativatinfp34d2kinase［J］.Nated,1996,2:1140-1143.〔4〕Hayashi,TsuhiyaH,YaatN