儀器分析試驗講義-武漢大學(xué)藥學(xué)院

7/7儀器分析試驗講義-武漢大學(xué)藥學(xué)院儀器分析實驗講義

武漢大學(xué)藥學(xué)院

2008.2.21

目錄

儀器分析實驗注意事項(1)

實驗一色氨酸紫外吸收光譜定性掃描及定量分析(2)

實驗二不同物態(tài)樣品紅外透射光譜的測定(3)

實驗三二氯熒光素量子產(chǎn)率的測定(5)

實驗四核磁共振波譜法測定乙基苯的結(jié)構(gòu)(7)

實驗五循環(huán)伏安法測定鐵氰化鉀的電極反應(yīng)過程(9)

實驗六氣相色譜定量分析(12)

實驗七高效液相色譜法分離巴比妥與苯巴比妥(15)

實驗八毛細管區(qū)帶電泳（CZE）分離硝基苯酚異構(gòu)體(165)

實驗九液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定飲用水中一氯酚異構(gòu)體(19)

實驗十飲料中咖啡因含量的測定（設(shè)計實驗）(20)

儀器分析實驗注意事項

1.實驗前必須詳細預(yù)習(xí)實驗講義，明了實驗?zāi)康摹⒃矸椒安僮鞑襟E。

2.要聽從老師的指導(dǎo)，嚴(yán)格按照實驗步驟進行，切勿隨意亂動。

3.實驗中所遇難題，應(yīng)先獨立思考，再與指導(dǎo)老師共同討論研究。

4.必須如實記錄觀察到的現(xiàn)象和實驗數(shù)據(jù)。

5.保持實驗環(huán)境和儀器的清潔整齊。

6.必須遵守實驗室的規(guī)則：

(1)確保人身安全，使用強酸、強堿、有毒試劑時尤其要細心。

(2)室內(nèi)不得高聲談笑，必須保持安靜的實驗環(huán)境。

(3)按時到實驗室，不遲到，不早退。

(4)愛護儀器，不浪費藥品，節(jié)約水電，遵守實驗室的安全措施。

(5)濾紙、火柴棒、碎玻璃等應(yīng)投入廢物缸，切勿丟入水池內(nèi)。

(6)各組及同學(xué)之間應(yīng)相互協(xié)作，合理安排實驗時間及實驗內(nèi)容。

(7)每次實驗后由班長安排同學(xué)輪流值日，值日要負責(zé)當(dāng)天實驗室的衛(wèi)生，安

全和一些服務(wù)性工作。最后離開實驗室時，應(yīng)檢查水、電、門窗等是否關(guān)閉。

(8)對實驗的內(nèi)容和安排不合理的地方可提出改進意見。對實驗中出現(xiàn)的一切反常

現(xiàn)象應(yīng)進行討論，并大膽提出自己的看法，做到生動活潑，主動地學(xué)習(xí)。

(9)實驗室禁止吸煙。

實驗一色氨酸紫外吸收光譜定性掃描及定量分析

一、實驗?zāi)康?/p>

1．了解紫外-可見光譜定性分析原理。

2．掌握紫外-可見光譜定性圖譜數(shù)據(jù)的處理方法。

3．熟悉紫外-可見光譜分析儀的定性、定量掃描實驗操作方法。

二、基本原理

紫外-可見光譜是用紫外-可見光的物質(zhì)電子光譜，它研究產(chǎn)生于價電子在電子能級間的躍遷，研究物質(zhì)在紫外-可見光區(qū)的分子吸收光譜。當(dāng)不同波長的單色光通過被分析的物質(zhì)時能測得不同波長下的吸光度或透光率，以ABS為縱坐標(biāo)對橫坐標(biāo)波長λ作圖，可獲得物質(zhì)的吸收光譜曲線。一般紫外光區(qū)為190~400nm，可見光區(qū)為400~800nm。

紫外吸收光譜的定性分析為化合物的定性分析提供了信息依據(jù)。雖然分子結(jié)構(gòu)各不相同，但只要具有相同的生色團，它們的最大吸收波長值就相同。因此，通過對未知化合物的掃描光譜、最大吸收波長值與已知化合物的標(biāo)準(zhǔn)光譜圖在相同溶劑和測量條件下進行比較，就可獲得基礎(chǔ)鑒定。

參與蛋白質(zhì)組成的20種氨基酸，在可見光區(qū)都無光吸收；在紫外光區(qū)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸具有光吸收能力，其中以色氨酸吸收紫外光的能力最強，色氨酸、酪氨酸最大紫外吸收峰在280nm。因此，可以根據(jù)它們的紫外吸收光譜特征，在紫外-可見光譜分析儀的定性測量模式中通過光譜掃描測量其吸光度-波長的圖譜，對它進行準(zhǔn)確可靠的定性鑒別。蛋白質(zhì)在280nm處有特征性的最大吸收峰是由它所含有的色氨酸和酪氨酸所引起的。利用這一性質(zhì)可測定蛋白質(zhì)的含量。

三、實驗方法

1．配置20μg·mL-1色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2．打開紫外-可見光譜儀，初始化儀器，預(yù)熱5min。

3．定性掃描：在應(yīng)用菜單中選擇定性分析模式，在配置菜單中設(shè)置好需要的橫坐標(biāo)（波長值）掃描范圍200~400nm和縱坐標(biāo)（ABS或％T值）0~1ABS記錄范圍以及掃

描。

4．定量分析：定波長掃描。將波長設(shè)定，改變分析物的濃度，可得不同的ABS值，

據(jù)此可達定量測定的目的。

5．不同的儀器型號參照不同的使用說明。

四、結(jié)果處理

1．確定色氨酸在不同波長時的最大波長峰值。

2．固定波長掃描，繪制定量測量的工作曲線，計算未知濃度。

五、思考題

1.綜述紫外吸收光譜分析的基本原理。

2.影響紫外光譜定性掃描的各種因素有哪些？

3.根據(jù)自己所學(xué)知識，總結(jié)紫外吸收光譜分析在生物醫(yī)藥方面有哪些應(yīng)用？

實驗二不同物態(tài)樣品紅外透射光譜的測定

一、實驗?zāi)康?/p>

1.了解紅外光譜儀的基本組成和工作原理。

2.掌握紅外光譜分析時各種物態(tài)試樣的制備及測試方法。

3.熟悉化合物不同基團的紅外吸收頻率范圍，學(xué)會用標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫進行圖譜檢索及化合

物結(jié)構(gòu)鑒定的基本方法。

二、基本原理

紅外光譜分析是研究分子振動和轉(zhuǎn)動信息的分子光譜。當(dāng)化合物受到紅外光照射，化合物中某個化學(xué)鍵的振動或轉(zhuǎn)動頻率與紅外光頻率相當(dāng)時，就會吸收光能，并引起分子永久偶極矩的變化，產(chǎn)生分子振動和轉(zhuǎn)動能級從基態(tài)到激發(fā)態(tài)的躍遷，使相應(yīng)頻率的透射光強度減弱。分子中不同的化學(xué)鍵振動頻率不同，會吸收不同頻率的紅外光，檢測并記錄透過光強度與波數(shù)（1/cm）或波長的關(guān)系曲線，就可得到紅外光譜。紅外光譜反映了分子化學(xué)鍵的特征吸收頻率，可用于化合物的結(jié)構(gòu)分析和定量測定。

根據(jù)實驗技術(shù)和應(yīng)用的不同，我們將紅外光劃分為三個區(qū)域：近紅外區(qū)（0.75~2.5μm；ν：13158~4000），中紅外區(qū)（2.5~25μm；ν：4000~400）和遠紅外區(qū)（25~1000μm；ν：400~10）。分子振動伴隨轉(zhuǎn)動大多數(shù)在中紅外區(qū)，一般的紅外光譜都在此波數(shù)區(qū)間進行檢測。

紅外光源傅里葉變換紅外光譜儀主要由紅外光源、邁克爾遜干涉儀、檢測器、計算機和記錄系統(tǒng)五部分組成。紅外光經(jīng)邁克爾遜干涉儀照射樣品后，再經(jīng)檢測器將檢測到的信號以干涉圖的形式送往計算機，進行傅里葉變換的數(shù)學(xué)處理，最后得到紅外光譜。

三、實驗方法

1.樣品的制備

a固體樣品的制備。（L-酪氨酸壓片）

(1)溴化鉀壓片。

取約1mg固體試樣于干凈的瑪瑙研缽中，在紅外燈下研磨成細粉，再加約200mg干燥溴化鉀粉末一起研磨，直至二者完全混合均勻（顆粒約為2μm以下）。取出壓片模具，將一壓舍光面向上放入模芯中，套上套環(huán)，用樣品勺將樣品小心加入模具中，堆積均勻，另取一壓舌光面向下放入模芯中，稍加壓力使樣品鋪平，蓋上罩子。把裝好的模具放在油壓機上，關(guān)閉氣壓閥，手動加壓直至壓力表指示約為400kgf時，停止加壓，保持1~3min后放氣泄壓。取出模具，將樣品脫模，得一透明圓片，用小鑷子將其放在試樣架上，插入檢測池測定紅外光譜圖。

(2)液體石蠟研糊。

取2~3mg固體試樣于干凈的瑪瑙研缽中研細，滴加1~2滴液體石蠟后，充分研磨混勻呈糊狀，在紅外燈下干燥，取出樣品架和溴化鉀（或氯化鈉）鹽片，將研磨好的樣品用不銹鋼勺刮到鹽片上，涂勻后壓上另一鹽片，裝入樣品架下面板，位置調(diào)整適當(dāng)后，插入上面板，將樣品架的對角用螺絲旋緊固定，然后插入檢測池測定紅外光譜圖。

(3)薄膜法（多用于高分子化合物的測定）。

通常將試樣熱壓成膜，將膜夾在兩鹽片之間，放入樣品架固定，測定其紅外圖譜（薄膜樣品可直接采用此法測定）。也可將聚合物溶于適當(dāng)?shù)娜軇┲校舛葹?％~20％），然后將溶液滴在鹽片上攤勻，在紅外燈下使溶劑逐漸揮發(fā)成膜后，蓋上另一鹽片，裝入樣品架固定，插入檢測池測定紅外光譜圖。

b液體樣品的制備。（水楊酸甲酯）

液膜法：對于高沸點、低粘度的樣品，可將樣品直接滴在鹽片上，蓋上另一鹽片；對于粘度較大的樣品，用不銹鋼勺將少許樣品涂在鹽片表面，在紅外燈下烘烤，將樣品刮勻，蓋上另一鹽片，使兩鹽片之間形成一定厚度的液膜，裝入樣品架固定，插入檢測池測定紅外光譜圖。對于低沸點易揮發(fā)的樣品，應(yīng)采用封閉式液體池檢測。

c氣體樣品的制備。

取出氣體進樣槽，打開進樣槽兩活塞中任意一個，將其與真空泵相連接；打開真空泵，抽出空氣槽內(nèi)原有的空氣，關(guān)閉抽氣活塞及油泵開關(guān)。將氣體樣品接入樣槽任意一個人口，打開活塞注樣，氣體樣品吸收峰強度的大小是通過調(diào)整氣槽內(nèi)樣品壓力實現(xiàn)的，因此在注樣時，可將氣槽另一入口和壓力計相連，使氣槽壓力控制在所需范圍內(nèi)進行檢測。

2.樣品檢測

將預(yù)先制備好的樣品插入樣品架，記錄紅外圖譜。

四、注意事項

1.溴化鉀樣品的濃度和片的厚度應(yīng)適當(dāng)，在樣品研磨、放置的過程中應(yīng)該特別注意干

燥。

2.切不可用手觸摸氯化鈉、溴化鉀鹽片表面；用丙酮清洗鹽片，用鏡頭紙或脫脂棉擦

拭后，放入干燥器中保存。

3.液體樣品制備前應(yīng)干燥除水，水溶液應(yīng)使用CaF2或BaF2窗片；腐蝕性樣品切不可

用常規(guī)鹽片制備。

五、數(shù)據(jù)處理

1.采用常規(guī)圖譜處理功能，對所測圖譜進行基線校正及適當(dāng)?shù)钠交幚恚瑯?biāo)出主要吸

收峰的波數(shù)值，儲存數(shù)據(jù)。

2.判別官能團的歸屬。

3.歸納不同化合物中相同基團出現(xiàn)的頻率范圍。

六、思考題

1.為什么溴化鉀壓片制樣容易造成圖譜傾斜，而液體和薄膜樣品卻沒有這種現(xiàn)象？

2.區(qū)別飽和碳氫與不飽和碳氫的主要標(biāo)志是什么？有機酸、苯環(huán)的光譜特征是什么？

實驗三二氯熒光素量子產(chǎn)率的測定

一、實驗?zāi)康?/p>

1.了解熒光分析法及測量熒光物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率的基本原理。

2.掌握二氯熒光素量子產(chǎn)率的測量方法和相關(guān)影響因素。

二、基本原理

熒光分析法在有機電致發(fā)光、生物醫(yī)藥、臨床診斷等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。高性能熒光材料的制備已成為這些領(lǐng)域的研究熱點與前沿，而這些熒光材料的熒光量子產(chǎn)率的高低直接影響它們的性能優(yōu)劣。熒光量子產(chǎn)率（YF）即熒光物質(zhì)吸光后所發(fā)射的熒光的光子數(shù)與所吸收的激發(fā)光的光子數(shù)之比值。它的數(shù)值在通常情況下總是小于1。YF的數(shù)值越大則化合物的熒光越強，而無熒光的物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率卻等于或非常接近于零。

熒光量子產(chǎn)率一般采用參比法測定。即在相同激發(fā)條件下，分別測定待測熒光試樣和已知量子產(chǎn)率的參比熒光標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)兩種稀溶液的積分熒光強度（即校正熒光光譜所包括的面積）以及對一相同激發(fā)波長的入射光（紫外-可見光）的吸光度，再將這些值分別代入特定公式進行計算，就可獲得待測熒光試樣的量子產(chǎn)率：

Yu=Ys·FsFu·AuAs

Yu、Ys—待測物質(zhì)和參比標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率；

Fu、Fs—為待測物質(zhì)和參比物質(zhì)的積分熒光強度；

Au、As—為待測物質(zhì)和參比物質(zhì)在該激發(fā)波長的入射光的吸光度（A=εbc）。

運用此公式時一般要求吸光度As、Au低于0.05。參比標(biāo)準(zhǔn)樣最好選擇其激發(fā)波長值相近的熒光物質(zhì)。有分析應(yīng)用價值的熒光化合物的Yu一般常在0.1-1之間。

三、實驗方法

1.配制二氯熒光素（0.25μg·mL-1）待測試樣溶液(含1.0mol·L-1NaOH水溶液)，羅丹

明B（0.25μg·mL-1）參比標(biāo)準(zhǔn)溶液（溶劑為無水乙醇）；

2.打開分子熒光光譜儀和紫外－可見分光光度計；

3.移取所需濃度的二氯熒光素與羅丹明B溶液，用相應(yīng)溶劑稀釋至10.0mL

（A505nm3.0情況下，其內(nèi)表面帶負電，和溶液接觸時形成了一雙電層。在高電壓作用下，一定介質(zhì)中的帶電離子在直流電場作用下的定向運動稱為電泳。單位電場下的電泳速度稱為電泳淌度或電泳遷移率。電泳速度的大小與電場強度、介質(zhì)特性、粒子的有效電荷及其大小和形狀有關(guān)。而雙電層中的水合陽離子引起流體整體地朝負極方向移動的現(xiàn)象叫電滲，單位電場下的電滲速度稱為電滲淌度。電滲速度與毛細管中電解質(zhì)溶液的介電常數(shù)和粘度、雙電層的ζ電勢以及外加直流電場強度有關(guān)。粒子在毛細管內(nèi)電解質(zhì)中的遷移速度等于電泳和電滲流(EOF)兩種速度的矢量和，正離子的運動方向和電滲流一致，故最先流出；中性粒子的電泳流速度為“零”，故其遷移速度相當(dāng)于電滲流速度；負離子的運動方向和電滲流方向相反，但因電滲流速度一般都大于電泳流速度，故它將在中性粒子之后流出，從而因各種粒子遷移速度不同而實現(xiàn)分離。

電滲是CE中推動流體前進的驅(qū)動力，它使整個流體像一個塞子一樣以均勻速度向前運動，使整個流型呈近似扁平型的“塞式流”。它使溶質(zhì)區(qū)帶在毛細管內(nèi)原則上不會擴張。但在HPLC中,采用的壓力驅(qū)動方式使柱中流體呈拋物線型，其中心處速度是平均速度的兩倍，導(dǎo)致溶質(zhì)區(qū)帶本身擴張，引起柱效下降，使其分離效率不如CE。

硝基苯酚是弱酸性物質(zhì)，其鄰、間、對位異構(gòu)體由于pKa值不同，在一定pH值的緩沖溶液中電離程度不同。因此，它們在毛細管電泳分離過程中表現(xiàn)出不同的遷移速度，從而實現(xiàn)分離。

圖8-2：樣品組分在毛細管中的遷移情況

三、實驗方法

1.打開毛細管電泳儀，預(yù)熱至檢測器輸出信號穩(wěn)定。

2.準(zhǔn)確測量毛細管長度。距毛細管一端約15cm處去除約2mm的毛細管聚合物保護

層，作為檢測窗口，并測量毛細管進樣端到檢測窗的長度。

3.將毛細管的檢測窗口對準(zhǔn)檢測器光路，并安裝好毛細管。

4.依次用氫氧化鈉溶液（1.0mol·L-1）、二次蒸餾水、鹽酸溶液（0.1mol·L-1）、二次蒸

餾水沖洗毛細管各5min，最后在毛細管注入緩沖溶液，并將毛細管的兩端分別插

入位于電極處的緩沖溶液瓶中。將直流電壓調(diào)至20kV。

5.待記錄儀基線穩(wěn)定后，關(guān)閉高壓電源，用壓力進樣方式進樣，并設(shè)定進樣時間，待

樣品峰出現(xiàn)后記錄其遷移時間，混合樣按同樣步驟進行操作，并記錄圖譜。

6.改變外加電壓（如15kV或25kV）重復(fù)步驟4、5。

7.實驗完畢后，關(guān)閉儀器電源，并用二次蒸餾水沖洗毛細管。

四、結(jié)果處理

1.根據(jù)所得到的實驗數(shù)據(jù)，計算電滲速度、電滲淌度、各組分的電泳淌度、間硝基苯

酚的理論塔板數(shù)。根據(jù)分離圖計算各組分之間的分離度。

2.繪制外加電壓與電滲速度的關(guān)系圖，并給予解釋。

五、思考題

1.為什么本實驗采用pH為7.0左右的緩沖溶液分離硝基苯酚異構(gòu)體？用別的pH值

比如2.0或者8.0的緩沖液可以嗎？

2.如何實現(xiàn)電滲流方向的改變？

實驗九液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用

一、實驗?zāi)康?/p>

1.了解質(zhì)譜儀的基本組成及工作原理，學(xué)習(xí)掌握質(zhì)譜儀簡單的調(diào)諧方法。

2.了解液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的基本功能，掌握利用該技術(shù)進行定性分析的基本操

作。

3.建立一種能同時測定飲用水中一氯酚異構(gòu)體的液相色譜——質(zhì)譜聯(lián)用方法。

二、基本原理

質(zhì)譜分析法是通過對被測樣品離子的質(zhì)荷比的測定來進行分析的一種分析方法。被分析的樣品首先要離子化，然后利用不同離子在電場或磁場的運動行為的不同，把離子按質(zhì)荷比（m/z）分開而得到質(zhì)譜，通過樣品的質(zhì)譜和相關(guān)信息，可以得到樣品的定性定量結(jié)果。

質(zhì)譜分析法主要是通過對樣品的離子的質(zhì)荷比的分析而實現(xiàn)對樣品進行定性和定量的一種方法。因此，質(zhì)譜儀都必須有電離裝置把樣品電離為離子，有質(zhì)量分析裝置把不同質(zhì)荷比的離子分開，經(jīng)檢測器檢測之后可以得到樣品的質(zhì)譜圖，由于有機樣品，無機樣品和同位素樣品等具有不同形態(tài)、性質(zhì)和不同的分析要求，所以，所用的電離裝置、質(zhì)量分析裝置和檢測裝置有所不同。但是，不管是哪種類型的質(zhì)譜儀，其基本組成是相同的。都包括離子源、質(zhì)量分析器、檢測器和真空系統(tǒng)。

質(zhì)譜