分子病理學實驗基礎

分子病理學實驗基礎隨著分子生物學技術的發(fā)展，病理學科在認識疾病，探討疾病的發(fā)生、發(fā)展的基礎研究方面，從原來的表型分析水平深入到基因分析水平；在疾病的診斷方面，從傳統(tǒng)病理形態(tài)診斷(組織病理診斷)進展到基因診斷。分子生物學技術的應用，對研究疾病的病理變化和病變機制在傳統(tǒng)病理學基礎上有了比較大的進步，能較特異、靈敏而快速地對一些傳染病、代謝或內(nèi)分泌疾病、遺傳性疾病等作出診斷，對于腫瘤的診斷、鑒別診斷、評價療效和估計預后提供了基因分子水平的指標。第一節(jié)DNA的基本知識核酸由脫氧核糠核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)組成。在真核生物細胞中，DNA主要存在于細胞核內(nèi)，線粒體、葉綠體也含有DNA，RNA主要分布在細胞漿內(nèi)。核酸的單體單位是核苷酸(有3個特有的成分組成即堿基、戊糖和磷酸)。參與DNA組成的堿基有腺嘌吟(A)、鳥嘌吟(G)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)。所有DNA中的A=T，G=C，因此A+G=T+C。DNA堿基組成只有種的特異性，而沒有組織和器官的特異性。DNA由2條反向平行的磷酸核糖骨架并互相繞成雙螺旋結(jié)構(gòu)；通過互補的堿基形成氫鍵，互相緊密地結(jié)合在一起形成堿基對。核酸形成DNA復制是按堿基配對的方式，以一條鏈為模板形成另一條互補的新鏈。這種復制的穩(wěn)定性和準確性，是DNA具有遺傳信息貯存和傳遞的分子基礎。一、DNA的理化性質(zhì)DNA的紫外吸收DNA在240-290nm的紫外波段具有強烈的吸收值。最大吸收值在260nm附近；蛋白質(zhì)在280nm處。分光光度計測量：樣品必須是均一的，搖勻后再測量結(jié)果會準確些。它是利用分光光度法對物質(zhì)進行定量定性分析。核酸的定量是分光光度計使用頻率最高的功能?？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長260nm。每種核酸的分子構(gòu)成不一，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對應的系數(shù)。如：1OD的吸光值分別相當于50ug/ml的dsDNA，37ug/ml的ssDNA，40ug/ml的RNA，。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算，從而得出相應的樣品濃度。。測試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測試空白液和樣品液。然而，實驗并非一帆風順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實驗者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀器，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大A260/A280的比值，用于評估樣品的純度，因為蛋白的吸收峰是280nm。純凈的樣品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8或者2.0,表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A320一般是0。（二） DNA的沉降特性溶液中的核酸分子在引力場中可以下沉。不同構(gòu)象的核酸（線形，開環(huán)，超螺旋結(jié)構(gòu)）、蛋白質(zhì)及其他雜質(zhì)在超離心機的強大引力場中，沉降的速率有很大差異，所以可以用超離心法純化核酸，或?qū)⒉煌瑯?gòu)象的核酸進行分離，也可以測定核酸的沉降常數(shù)與分子量。應用不同介質(zhì)組成密度梯度進行超離心分離核酸時，效果較好。RNA分離常用蔗糖梯度。分離DNA時用得最多的是氯化銫梯度。氯化銫在水中有很大的溶解度。可以制成濃度很高（8mol/L）的溶液。應用啡啶漠紅一氯化銫密度梯度平衡超離心，很容易將不同構(gòu)象的DNA、RNA及蛋白質(zhì)分開。這個方法是目前實驗室中純化質(zhì)粒DNA時最常用的方法。如果應用垂直轉(zhuǎn)頭，當轉(zhuǎn)速為65000r/min（BeckmanL-70超離心機），只要6h即可以完成分離工作。但是如果采用角轉(zhuǎn)頭，轉(zhuǎn)速為45000r/min時，則需36h。離心完畢后，離心管中各種成分的分布可以在紫外光照射下顯示得一清二楚。蛋白質(zhì)漂浮在最上面，RNA沉淀在底部。超螺旋DNA沉降較快，開環(huán)及線形DNA沉降較慢。用注射針頭從離心管側(cè)面在超螺旋DNA區(qū)帶部位刺入，收集這一區(qū)帶的DNA。用異戊醇抽提收集到的DNA以除去染料，然后透析除CsCl，再用苯酚抽提1?2次，即可用乙醇將DNA沉淀出來。這樣得到的DNA有很高的純度，可供DNA重組、測定序列及繪制限制酶圖譜等。在少數(shù)情況下，需要特別純的DNA時，可以將此DNA樣品再進行一次氯化銫密度梯度超離心分離。（三）DNA的變性與復性1、 變性DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)稱為自然狀態(tài)，如果這種狀態(tài)受到破壞，使DNA分子變成為單鏈結(jié)構(gòu)，以一種紊亂的、隨機的線團構(gòu)型狀態(tài)存在，這種狀態(tài)成為DNA變性狀態(tài)。從自然狀態(tài)到變性狀態(tài)的過程稱變性。引起DNA變性的因素：溫度升高引起熱變性，加酸堿引起的變性等。DNA變性時，一系列理化性質(zhì)隨之發(fā)生改變，260nm處吸收值升高，粘度降低，浮力密度升高，同時其二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，甚至失去生物學活性。2、 復性在一定的條件下，變性的DNA可以再變?yōu)樽匀粻顟B(tài)的DNA，這一過程為復性或退火。復性作用是在生物學研究中最常用的特性。DNA-DNA之間或DNA-RNA之間的分子雜交，就是復性的應用。單鏈之間的復性，是一個隨機的過程，復性后的DNA分子中的2條鏈，并不是該DNA分子變性的那2條鏈。溶解性DNA易溶于水，不溶于乙醇。常用的DNA樣品往往是溶解在TE緩沖液.Tris+EDTA緩沖液，TE緩沖液是弱堿性，對DNA的堿基有保護性，穩(wěn)定性較好，不易破壞其完整性或產(chǎn)生開環(huán)及斷裂,包括提取好的DNA也要放在TE緩沖液是保存.二、DNA的復制DNA的復制是一個復雜的過程，有許多酶、蛋白質(zhì)因子在復制中起重要作用。1、 DNA復制的特點 DNA復制的起始意味著細胞將要進行下一次的分裂。2、 DNA復制的形式半保留復制：在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中，兩條多核苷酸的鏈的堿基互補，在DNA的合成過程中，每一條鏈均可作為模板合成與原來DNA完全的DNA分子。每一代的DNA分子的一條鏈來自親代，另一條鏈是新合成的互補鏈，這種復制的方式稱為半保留復制。全保留復制：2個子代DNA子代分子中一個分子完全是親代的分子，另一個分子完全是新合成的分子，這種復制方式稱為全保留復制。散布式復制： 親代鏈被分解成很多片段，散布在新的DNA分子中，這種復制方式稱為散布式復制。第二節(jié)聚合酶鏈式反應聚合酶鏈反應(PolymreaseChainReaction，簡稱PCR)技術，是根據(jù)生物體內(nèi)DNA復制的某些特點而設計的在體外對特定DNA序列進行快速、特異和大量擴增的一項新技術。隨著熱穩(wěn)定性TaqDNA聚合酶的研究應用和自動化熱循環(huán)儀的設計成功，PCR技術的操作程序大大簡化，很快被廣泛地應用于基因研究的各個頃域，對分子生物學及其相關學科的基礎研究和臨床診斷等方面起了重大的作用。一、PCR的基本原理PCR有2個重要特性：一是能合成DNA的特定序列；二是特定序列的大量擴增。DNA聚合酶能以單鏈DNA為模板，合成一個與其互補的新鏈DNA。將雙鏈DNA加熱至接近100°C時，DNA變性，形成單鏈DNA，此單鏈DNA可用于合成互補鏈的模板。PCR反應中，2條人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補序列結(jié)合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度下，DNA聚合酶即將dNTP中的脫氧單核苷酸加到引物3’-OH末端，并以此為起始點，沿模板以5’ 3’方向延仲，合成一條新的互補鏈。引物的位置將決定合成的DNA序列。PCR反應中，雙鏈DNA的高溫變性、引物與模板的低溫退火和適溫下引物延伸3個步驟反復（一定次數(shù)）循環(huán)。每一循環(huán)中所合成的新鏈，又都可以作為下一個循環(huán)中的模板。PCR的特定DNA序列產(chǎn)量隨著循環(huán)次數(shù)呈指數(shù)增加，達到迅速大量擴增的目的。二、反應體系PCR反應體系中的基本成分應包括模板DNA、引物、4種脫氧核苷三磷酸、DNA聚合酶和適宜的緩沖液。（一） 模板DNAPCR的起始材料可以是單鏈或雙鏈DNA。如果起始材料是mRNA，則先要通過逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，然后cDNA模板進行PCR擴增。常用的PCR樣品DNA/mRNA是從細胞中提取的。PCR樣品不需要純化，細胞加熱變性所釋放的DNA可直接用于擴增。若用DNA粗品做樣品，應避免混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑及能結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)。用純化的DNA做樣品，增加了模板的濃度，除去了抑制PCR反應的雜質(zhì)，可提高PCR擴增的成功率。提取DNA的基本過程：1、 用蛋白酶K及SDS，在EDTA存在的的條件下，裂解細胞，消化蛋白質(zhì)，使核蛋白解聚及胞內(nèi)的DNA酶失活。2、 用酚/氯仿多次提取，去除蛋白質(zhì)。在DNA中若混有少量的RNA，可以用RNA酶去除。3、 最后用乙醇沉淀即可得到純的DNA。PCR所需DNA的量極微，不到1微克的基因組DNA序列就足以進行PCR分析。PCR其至可以從1個DNA分子擴增特定的DNA序列。DNA分子是非常穩(wěn)定的，使用PCR技術可以從血清、新鮮組織及石蠟包埋組織等中測出多種病原體、原癌基因和抑癌基因°PCR檢測技術為醫(yī)學的發(fā)展起到了不可估量的作用。（二） 引物引物是指2段與模板DNA序列側(cè)翼片段互補的寡核苷酸。當2段引物與變性雙鏈DNA的2條單鏈DNA模板退火后，兩引物的5’端即決定了擴增產(chǎn)物的2個5’末端位置。擴增是從引物的3’延伸的，擴增片段的長度等于引物A加兩引物間的序列加引物B。因此，引物決定了PCR擴增的長度、位置和結(jié)果。選揮高效而特異性強的引物是PCR成敗的關鍵因素。引物的長度大多住20一30個堿基。引物設計：1、 寡核苷酸引物用自動DNA合成儀合成。設計引物的先決條件是與引物結(jié)合的靶DNA序列片段必須是清楚的，而與2個結(jié)合的2個片段之間的靶DNA序列未必清楚。2、 應盡可能選擇堿基隨機分布的序列。盡可能避免具有多聚嘌吟、多聚嘧啶或其他異常序列。3、 引物內(nèi)部應避免具有明顯的二級結(jié)構(gòu)，尤其是發(fā)夾結(jié)構(gòu)。4、 人工合成的寡核苷酸引物要用層析法或聚丙烯酰胺電泳（PAGE）法進行純化。純化的引物應在25%乙臘溶液中4°C保存。5、 在PCR反應體系中，引物適宜濃度為0.1-1umol/L。（三） PCR反應體系不同實驗的反應條件各不相同，反應體系中有關成分包應做相應的調(diào)整。一般反應體系包括以下內(nèi)容：1、 PCR反應體積一般為50ul或100ul。2、 DNA樣品；反應體系還包括KCl、50mmol/L，Tris-HCl、10mmol/L（pH8.4），MgCl2、1.5mmol/L，明膠100ug/m1，每種引物0.25mmol/L。3、 各種脫氧核苷三磷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP為0.2mmol/L，TaqDNA聚合酶以及4XdNTPs（dATP、dDTP、dGTP和dTTP）。4、 ATP貯存液的pH應為7.0，4種dNTP的濃度應相同。（四） TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶最初在美國黃石國家公園的一個溫泉中發(fā)現(xiàn)的一種嗜熱菌水生棲熱菌的丫丁菌株中分離出來。產(chǎn)生TaqDNA聚合酶的水生棲熱茵能在70-75C下生長，具有熱穩(wěn)定性.。大量實驗表明，TaqDNA聚合在高溫下不會發(fā)生不可逆性變化TaqDNA聚合酶在950C的半衰期為40min。TaqDNA聚合酶在PCR中的常用濃度為1-2.5U/100ul反應液。若酶量過多，會導致非特異性PCR產(chǎn)物增加；相反，酶量過少又會引起PCR產(chǎn)量的不足。TaqDNA聚合酶的特點：1、 簡化PCR操作。TaqDNA聚合酶能抵抗PCR每次循環(huán)開始時雙鏈DNA變性所需的高溫處理，不需要在每次循環(huán)中添加新鮮酶。2、 提高退火溫度，增加PCR特異性。3、 延長到達平臺的循環(huán)次數(shù)，提高PCR產(chǎn)量。4、 能擴增較長的靶DNA序列，而不易形成二級結(jié)構(gòu)。（五） 緩沖液及其它成分1、一般用10-50mmol/Ltri-HCl緩沖液，200C時PH8.3。Tris是一種雙極離子緩沖液。2、適宜的Mg2+濃度：它會影響引物的退火、模板和PCR產(chǎn)物雙鏈的變性溫度、PCR產(chǎn)物的特異性、引物的二聚體的形成以及酶的活性和錯摻率。各種dNTP濃度為0.25mmol/L時，Mg2+濃度為1.5mmol/L較為適宜。螯合劑EDTA和高濃度的帶負電荷離子基團（如dNTP的磷酸根）對Mg2+濃度也會產(chǎn)生影響，因為它們可與Mg2+結(jié)合而降低Mg2+濃度。一般用作模板的DNA應溶與10mmol/Ltris-HCl、0.1mmol/LEDTA中。三、循環(huán)參數(shù)PCR擴增是由變性、退火和延伸3個步驟反復循環(huán)而實現(xiàn)的。循環(huán)參數(shù)是指循環(huán)中每一步驟的溫度和時間，以及循環(huán)次數(shù)。（一） 變性溫度和時間模板DNA和PCR產(chǎn)物的變性不完全，是PCR反應失敗常見的原因之一。典型的變性條件是95°C，30s。對G、C含量多的靶DNA序列，宜用較高的變性溫度。DNA的變性僅需要幾秒鐘。過度變性也是不必要的，變性溫度過高、時間過長，會加快酶的失活。原則上變性步驟應高溫、短時.既要保證變性充分，又要保證聚合酶在整個反應中的活性。（二） 引物遲火引物退火的溫度和時間取決于引物的長度，堿基組成及在反應體系中的濃度。一般退火溫度低于引物的融解溫度（Tm）5C。G、C含量約為50%，20個堿基的典型寡核苷酸引物，最佳的退火溫度為55C。在溫度較高的條件下退火，可減少引物與模板的錯配，提高PCR的特異性。在典型的PCR反應體系中，引物的濃度為0.2umol/L，在這一引物過量的條件下，退火可在瞬間完成。（三） 引物延伸引物延伸是DNA合成酶將脫氧核苷酸逐一地加入到引物的3,-0H末端、依據(jù)模板序列合成一條互補新鏈的過程。引物延伸溫度取決于DNA聚合酶的最適溫度。延伸步驟的時間則取決于靶序列長度、濃度和延伸溫度。靶序列越長、濃度越低、延伸溫度越低，則所需的延伸時間則越長；反之，靶序列越短、濃度越高、延伸溫度越高，所需的延伸時間則越短。一般而言，每1000個堿基的序列，延伸1min便足夠了。（四）平臺效應期平臺效應期是指PCR循環(huán)的后期，合成產(chǎn)物達到0.3-1pmol水平，由于產(chǎn)物的堆積，使原來以指數(shù)的增加的速率變成平坦曲線。影響因素1、 dNTP或引物等的消耗。2、 反應物（dNTP或酶）的穩(wěn)定度。3、 最終產(chǎn)物（焦磷酸鹽，雙鏈DNA）的阻化作用。4、 非特異產(chǎn)物或引物的二聚體參與競爭作用。5、 在濃度大于10-8M時，特異產(chǎn)物的重退火（延伸率減低，TaqDNA酶消耗，產(chǎn)物鏈分叉，引物移位）。6、 變性或高產(chǎn)物濃度下產(chǎn)物分離不完全。7、 如循環(huán)次數(shù)不合理，低濃度錯配的非特異產(chǎn)物開始大量擴增，也可以出現(xiàn)反應的平臺期。（五）循環(huán)次數(shù)PCR的循環(huán)次數(shù)一般為25-40個周期。在PCR各項參數(shù)適宜的情況下，PCR的適宜循環(huán)次數(shù)主要取決于靶DNA的起始濃度。在設定循環(huán)參數(shù)時.還應考慮到所用的熱循環(huán)儀從一溫度轉(zhuǎn)變到另一種溫度所需的過渡時間，因此要測定管內(nèi)的實際溫度，要考慮到因熱傳導造成的管內(nèi)溫度滯后情況。四、模板的制備PCR擴增技術對模板的質(zhì)量和數(shù)量要求不高，常規(guī)的DNA和RNA制備方法能滿足PCR擴增的要求。（一）血液取15%50u1EDTA加入Ep管內(nèi)，再加200u1血液輕輕混勻，12000rpm離心5s，棄上清，將沉淀懸浮于50ul溶液（10mmol/Ltris-HCl、pH7.6,5mmol/LMgCl2,10mmol/LNaCl）中，離心，棄上清，重復3次。沉淀內(nèi)加入100ul的雙蒸水，輕輕混勻，1000C下作用5min，12000rpm離心5min，取適量進行PCR擴增。（二） 陳舊的精斑剪碎污染物后放入Ep管內(nèi)，用堿性TE浸泡30min，加入SDS和蛋白薛K使其終濃度達1%或100ug/ml，50°C消化過夜。酚、氯仿抽提，乙醇沉淀DNA。（三） 新鮮組織取1-2g組織塊，剪碎，放人研缽或玻璃勻漿器，加入1-2mlPBS液，充分勻漿處理后，取0.2-0.15m1放人Ep管內(nèi)再加入1%SDS、蛋白酶K（100ug/ml），消化2h；或加入1%TLS消化5min。酚、氯仿抽提，乙醇沉淀DNA。（四） 石蠟包理組織1、石蠟切片將石蠟包埋組織切5um左右厚的薄片10-15張，放人Ep管內(nèi)，加入500ul的二甲苯，不時搖勻脫蠟15min,8ooorpm離心10min,重復脫蠟。然后用75%乙醇脫二甲苯2次，棄上清，沉淀處理同新鮮組織。2、微量石蠟包埋組織1） 將石蠟包埋組織切5um左右厚的薄片10-15張，放入Ep管內(nèi)，加入500ulSTE,置于70-80°C水浴10min，期間不時地用濾紙吸取石蠟，反復多次，以后處理同上。2） 將石蠟包埋組織，切5um左右厚薄片10-15張，放人Ep管內(nèi)，直接進行PCR擴增。3） 采用凍融一裂解法提取結(jié)核菌DNA。石蠟包埋組織切片常規(guī)脫蠟后，在經(jīng)干燥沉淀后的DNA中，加入100ul的蛋白酶K，37C過夜，70~-80C速凍2-5min后，立即煮沸5min，冰浴5min后8000rpm離心數(shù)秒，取上清液適量進行PCR擴增。（五）mRNA的提取整個mRNA的提取過程均在冰浴上進行。細胞按每106（取米粒大小的新鮮組織，剪碎經(jīng)玻璃勻漿器勻漿后）加100ul變性液，震蕩混勻，依次加入醋酸鈉、1m1飽和酚和0.2ml氯仿/異戊醇（49：1）混勻，用力震蕩min，置冰浴15min，12000rpm離心15min，取水相層（mRNA）加入3倍體積的無水乙醇，-20C下作用山，離心。干燥沉淀，加水溶解RNA。五、 PCR操作程序1、 取500ulEP管，分別設實驗、對照管（陽性，陰性和空白）根據(jù)不同實驗條件加入各反應成分一定體積。2、 混勻上述成分后，加入模板DNA，1000rpm離心數(shù)秒，置94C作用10min，使模板DNA變性，同時滅活樣品中雜酶的活性。3、 同上短時離心數(shù)秒、待冷至55C，加入2ulTaqDNA聚合酶（0.5U）搖勻。4、 加入液體石蠟20-30ul，短時離心使之分層良好。5、 設循環(huán)（94C、1min;55C、1min；72C、2min）次數(shù)30次。6、 72C延伸5min。取出擴增產(chǎn)物檢測或置4C保存。六、 逆轉(zhuǎn)錄-PCR（RT-PCR）RT-PCR是以rnRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的乍用下，合成與模板DNA互補DNA（cDNA），并再以此為模板進行常規(guī)PCR的一種的方法。在檢測某些基因表達和RNA病毒方面，具有實用性。1） cDNA的合成。取一定量的模板mRNA，在EP管內(nèi)依次加入KCl、Tris-HCI（PH8.4）、MgCl2、dNTP、RNase抑制劑及逆轉(zhuǎn)錄酶，37C或42C水浴30-40min。取出Ep管，95C滅活5min，以除去逆轉(zhuǎn)錄酶對TaqDNA聚合酶活性的抑制。2） 取一定量的cDNA模板進行常規(guī)PCR擴增并檢測。七、 PCR操作技術的有關問題及注意點（一）假陽性在PCR擴增系統(tǒng)中污染了模板序列，造成假陽性，會直接影響結(jié)果的判斷。污染機會與PCR循環(huán)周期的次數(shù)成正相關，標本中的病原微生物、病毒的污染機會和范圍是極大的。許多實驗強調(diào)設陽性對照和陰性對照。應注意事項：1）樣品的收集及處理過程應多換1次手套；打開EP管之前，將離心管離心，打開Ep管時要小心外濺。減少樣品操作環(huán)節(jié)扣次數(shù)，樣品應在其他成分加人后再加人管內(nèi)，樣品一旦加入管內(nèi)，立即加蓋。2）做陽性對照時，避免交叉污染，尤在病原體的檢測方面，每次操作務必認真做陰性對照和空白對照，排除污染因素。3） 所用EP管、槍頭均為一次性使用。4） 每切一份組織都要用二甲苯和無水乙醇充分擦潔切片刀。5） 所用試劑的配制、分裝和保存都應在無PCR產(chǎn)物的環(huán)境中進行。試劑應分裝保存，避免使用時造成污染。6） 實驗結(jié)果應與臨床聯(lián)系，時有懷疑的結(jié)果要重復實驗。（二）假陰性造成假陰性的因素主要與PCR整個試劑是否失效有關；DNA/mRNA提取的量及質(zhì)也是關鍵。1） 標本存放的時間，尤其是蠟塊不僅受時間的影響，而且還受固定劑類型等方面的影響，DNA分子經(jīng)福爾馬林固定后脆性增加，提取過程中的機械損傷更易發(fā)生斷裂，因此提取的每一步都必須輕柔。2） Rnase（一種核糖核酸酶Rnase）可降解RNA。因Nase到處都有，尤其在手上，故操作者要多換一次手套，以防止RNA在制備和反轉(zhuǎn)錄過程中降解；提取模板時，要在冰浴上進行。3） 檢查酶的活性（所用酌類應保存在-20°C中，用后應立即凍存）。4） 試劑盒中的所有成分必須貯存于-20C，盡量避免反復凍融試劑盒中的所有成分。5） PCR每一反應成分是否漏加；加完各成分后要再離心數(shù)秒，以使微量的反應成分完全參與PCR循環(huán)。6） 檢查設置的每個參數(shù)是否正確。八、PCR的質(zhì)量控制（一）PCR的室內(nèi)控制核心問題就是要避免交叉污染，跟其他檢測技術一樣，PCR室內(nèi)控制也是從實驗室及實驗室操作人員本身著手，所要強調(diào)的是，PCR對實驗室及實驗操作人員的要求更高，稍不注意，就因為交叉而使PCR的測定結(jié)果出現(xiàn)假陽性。1、實驗室管理主要包括2個方面：一是PCR實驗室要有嚴格的操作規(guī)程；二是實驗室的特殊設置。一個完整的PCR實驗由標本準備、PCR擴增及擴增后產(chǎn)物的分析檢測三個步驟組成。前二個步驟常有大量的特異NDA存在，是對以后PCR污染的主要來源。所以以上三個步驟應分開在不同的區(qū)域進行，而且所用的實驗器具如加樣器、吸頭、離心管等不能混合使用。實驗室的日常清潔是避免污染的最基本措施。室內(nèi)控制外源核酸污染的幾個方法（1） 紫外線照射。（2） “巢式引物”的應用在這種技術中，從第一輪PcR產(chǎn)物中，取出一部分使用位于第一對引物擴增的DNA內(nèi)的引物再次擴增（稱謂“巢式”PCR），因此處于高濃度的第二次擴增后的終產(chǎn)物對以后的使用第一對引物的初次PCR無影響。在一定情況下，這種方法對減少與PCR后擴增的污染問題極為有用，可有效地控制來自先前擴增的DNA出現(xiàn)的污染，但不能控制在原始標本收集、核酸提取及擴增等由于操作不當而出現(xiàn)的污染。陰、陽性對照（1） 陰性對照的目的在于監(jiān)測PCR整個過程中可能出現(xiàn)的污染.因此應對PCR的每一個階段都設置適當?shù)年幮詫φ?。?） 陽性對照也是監(jiān)測PCR檢驗質(zhì)量的組成部分，可有2種類型：一是原標本（如血清、痰、分泌物等陽性對照；另一是已純化的接近特定的PCR測定敏感性的DNA（亦可為質(zhì)粒DNA）標本。原標本陽性對照，與特異純化或質(zhì)粒DNA一樣，除可以監(jiān)測PCR擴增產(chǎn)物的有效性外，還可監(jiān)測待測標本核酸提取過程中核酸的丟失情況，如純化的DNA經(jīng)PCR測定陽性，而原標本陽性對照陰性則表明核酸的提取有問題，標本的測定結(jié)果不可靠。PCR結(jié)果的判讀PCR假陽性結(jié)果最可能源于以前擴增的DNA的“遺留物”或標本間的交叉污染。但還有下面2種可能可導致假陽性結(jié)果：1、類似大小的但非目的產(chǎn)物的擴增；2、在對實驗結(jié)果的錯誤判讀。前一種可能性在PCR中頗為常見，尤其是以大的復雜基因作為模扳時。對實驗結(jié)果的判讀不準確或者缺乏統(tǒng)一的標準，不但易于得到假陽性結(jié)果，也可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。在PcR實驗中，如果靶DNA順序出現(xiàn)變異，則很可能出現(xiàn)弱陽性或假陰性結(jié)果，原則上講PCR結(jié)果的最后判讀應是清楚明確的。（二）PCR的室間質(zhì)量控制室間質(zhì)量控制是臨床檢驗質(zhì)量控制的一個基本部分，由獨立的組織機構(gòu)進行。該機構(gòu)定期地向參加室間質(zhì)評的各個實驗室寄送已知的經(jīng)編號的標本，實驗室應用其日常方法檢測這些標本后，將結(jié)果匯報給上述組織機構(gòu)，于是該機構(gòu)在進行適當?shù)慕y(tǒng)計學處理、分析后，再將實驗室的成績反饋參加實驗室，如果實驗室成績不佳，則向其提供切實可行的建議和幫助。假陰性和假陽性結(jié)果難以避免，為保證PCR用于臨床診斷的可靠性，就必須引入室間質(zhì)評系統(tǒng)，以測PCR的敏感性和特異性可能存在的問額。九、PCR技術的臨床評價PCR能在體外大量擴增DNA特異性片段，具有靈敏度高、特異性強、操作簡單、省時和對原材料質(zhì)量要求低等特點。PCR技術主要用于病毒的檢測(如乙型肝炎病毒等)，后來又用于細菌、原蟲、霉菌、立克次氏體和支原體等，尤是對那些難以培養(yǎng)的病原體、及受感染細胞很少的潛伏病毒感染，PCR技術的應用顯得更為突出。PCR的敏感性和特異性都優(yōu)于傳統(tǒng)的生物和免疫測定法。目前，國內(nèi)已有乙型肝炎、丙型肝炎、巨細胞病毒、結(jié)核桿菌、淋球菌、乳頭瘤病毒、沙眼衣原體和單純瘡疹病毒等PCR診斷試劑盒生產(chǎn)、出售。PCR的局限性；費用比較昂貴，不適用于較大的初步篩選，該技術僅能檢出病原體DNA，不能反應感染的程度，如結(jié)核及乙型肝炎等。不能鑒定組織中病原體的存在狀態(tài)，對標本中游離型、整合型的病毒DNA的判斷，一般PCR也難以做到。PCR實質(zhì)上并不是一種定量技術，因此，PCR擴增條帶的強弱，并不一定與病原體的原始濃度呈正比。敏感性高而檢測出的假陽性結(jié)果對臨床的正確診斷帶來了一定的困難。第三節(jié)DNA凝膠電泳技術電泳是PCR擴增產(chǎn)物的分離、純化和鑒定最常用的方法，簡單、操作迅速，能分辨其他(如密度梯度離心)方法不能分開的DNA片段混合物。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，用漠化乙錠(EB)染色，在紫外燈下便可以直接確定DNA片段在凝膠板中的位置。瓊脂糖凝膠電泳還常用于DNA的southern吸印或限制性內(nèi)切酶簡單的噬菌體或質(zhì)粒克隆降解產(chǎn)物的位置圖譜及吸印分析。一、瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳都是以水平板進行的。優(yōu)點：①可使用低濃度瓊脂糖；②可以制備不同大小的凝膠：③易于灌膠制板、加樣和操作；④儀器耐用，造價不高。緩沖液瓊脂糖凝放電泳常用的緩沖浪為50mmo1/LTris-HAc(TAE)、Tris-硼酸(TBE)、Tris-磷酸(TPE)。先配制成10-20倍母液。目前最常用的緩沖液是Tris-HCl，它的緩沖能力較低，長時間電泳會使其能力耗盡（陽極變?yōu)閴A性，陰極變?yōu)樗峒?。解決的辦法除經(jīng)常換液外，也可在2個貯液槽之間進行緩沖液的循環(huán)。Tris-硼酸和Tris-磷酸都能獲得良好的DNA片段分離效果，并且由于具有較高的緩沖能力不需緩沖液循環(huán)。（二）瓊脂糖凝膠制備過程在制備過程中可以使用不同等級的瓊脂糖。一般常使用II型的低內(nèi)滲瓊脂糖，II瓊脂糖中常會混雜有一部分雜質(zhì)，因此從這種凝膠洗脫出來的DNA片段必需經(jīng)過高度提純后才能用作這些酶的模板或底物。制備過程：1、 配制1.5%瓊脂糖凝膠20ml.2、 將水平制膠板兩端擋板插好，用滴管吸取少量瓊脂糖分別滴于2塊擋板底部及兩側(cè)，膠板厚度一般約為0.4cm。3、 待溶液冷卻至50°C左右，加入10mg/mlEB（終濃度為0.5ug/m1）趁熱例膠至模板內(nèi)，并立即插人梳子以形成加樣孔。4、 當凝膠完全凝固后，小心水平拔出插板和梳子，然后將膠板放入電泳槽中，加入足量的電泳緩沖液，使膠浸在液中約1mm處。（三）電泳1、 樣品與載樣緩沖液混合后，取出一定量加入膠孔內(nèi)。2、 加樣端接負極，另一端接正極，接通電源，電泳約30-60min，停止電泳。取出膠板在紫外燈下觀察熒光帶，必要時照相。（四）瓊脂糖凝膠中DNA的染色與脫色EB可摻入到DNA分子內(nèi)，在紫外線照射下，可產(chǎn)生按強的熒光，因此，可以使用EB檢測單鏈或雙鏈DNA。通常將EB滲入到瓊脂糖凝膠中或瓊脂糖凝膠電泳后，再用EE染色。在紫外線燈下直接觀察。一般不脫色，如果DNA產(chǎn)物含量少時，可將凝膠浸入1mmol/LMgsoSO4溶液中室溫脫色1h，以減低背景熒光，使觀察清楚。二、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）垂直平板電泳，也稱聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），是根據(jù)物質(zhì)所帶電荷及其分子大小、形狀的差異，在電場作用下產(chǎn)生不同泳動速度而得到的分離技術。主要用于分離制備小于1kb長度的低分子量基因片段。PAGE有靜電效應和分子篩效應，分辨率很高。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺在催化劑過硫酸銨和加速劑N，N，N’，N’?四甲基乙二胺的同時作用下發(fā)生聚合作用，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，強度好，彈性好，透明，化學性質(zhì)穩(wěn)定，不受PH及溫度的影響。往往采用垂直平板型電泳。（一）試劑的貯存固體丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺貯存于棕色瓶內(nèi)，4°C保存，不超過2個月。四甲基乙二胺要密封保存。過硫酸銨溶液最好當天配制，4C貯藏不超過1周。（二） 凝膠板的制作垂直型平板凝膠的制作方法較多，簡單的是用2塊4mm厚的平正玻璃板制成。玻璃板大小可根據(jù)需要而定。凝膠的長度為l0cm，常用30cmX50cm。將2塊玻璃夾在一起，前短后長，玻璃之間用塑料條隔開，厚2-4mm。（三） 試劑的配制1、 30%丙烯酰胺丙烯酰胺29g，甲叉雙丙烯酰胺1g，加蒸餾水至100ml。2、 Tris-HCl緩沖液。3、 3%過硫酸銨過硫酸銨3g，加蒸餾水至100ml。（四）聚丙烯酰胺凝膠的配制（五）操作步驟1、 在100ml凝狡中加人30ulTEMD混合立灌入兩玻璃之間的空隙內(nèi)。2、 立即插入適當?shù)氖嶙樱鹗过X下有氣泡。3、 使丙烯酰胺在室溫下聚合約60min，如凝膠有明顯的回縮，可添加丙烯酰胺。4、 小心水平去出梳子，立即用水沖洗孔格。5、 把凝膠放人電泳槽內(nèi)。6、 將1XTBE電泳緩沖液加入貯存槽中。7、 取一滴管緩沖液沖洗孔格。8、 加樣同瓊脂糖凝膠法，電冰。9、 電泳結(jié)束時，玻璃板從電泳槽中取出，平放在桌子上，干穩(wěn)地先掀開一張玻璃的一角，使凝膠附在下面的玻璃上。10、 把凝膠放在染料溶液中染45min。11、 將凝膠置于紫外光透射燈下，去掉玻璃板后觀察，必要時拍照。第四節(jié)原位雜交一、基本原理定義：原位雜交是以標記的DNA或RNA為探針，在原位檢測組織細胞內(nèi)特定的DNA或RNA序列，其基本原理是含有互補順序的標記DNA或RNA片段，在適宜的條件下與細胞內(nèi)特定的DNA或RNA形成穩(wěn)定的雜交體。分類:根據(jù)所用的探針和靶核酸的不同，原位雜交可分為DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA雜交3類。方法：根據(jù)雜交的標記物是否能直接被檢測，可將原位雜交分為直接法和間接法2種。直接法原位雜交，探針與組織細胞內(nèi)靶核酸形成的雜交體不經(jīng)免疫組織化學即可顯色。間接法原位雜交一般都用半抗原標記探針，探針與組織細胞內(nèi)靶核酸所形成的雜交體則通過免疫組織化學對半抗原的定位間接地顯示。二、 DNA/cDNA探針的制備用于基因診斷的各種DNA/cDNA的探針，通常是重組在質(zhì)粒上。此種重組質(zhì)粒，再經(jīng)轉(zhuǎn)化、擴增、提取和純化，可得到大量的重組質(zhì)粒，進一步經(jīng)限制性內(nèi)切酶將特異的基因片段切下來回收，得到特異基因片段。重組質(zhì)粒DNA/cDNA的轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中去，以得到含質(zhì)粒的菌株，用此菌擴增此質(zhì)粒DNA。（一） 傳統(tǒng)CaCl2處理大腸細菌轉(zhuǎn)化法1、 原理將外源DNA序列導入原核或真核細胞的過程稱為轉(zhuǎn)化。常用的方法有CaCl2法。以氯化鈣處理對數(shù)生長期的細菌，使細胞壁的通透性增加，短時間的熱休克使質(zhì)粒DNA能更多、更容易地被細菌攝入，以得到大量的含質(zhì)粒的細菌。由于質(zhì)粒DNA上有抗菌素基因，可以在有其抗性的抗生素的瓊脂上生長，而未轉(zhuǎn)化的細菌則不能生長，轉(zhuǎn)化的細菌形成單一細菌克隆的菌落。2、 試劑LB培養(yǎng)基；20ml/ml鏈酶素；25mg/ml氨芐青霉素；0.1mol/LCaCl2；NTE溶液。3、 操作步驟（1） 相溶菌的制備（2） 質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化（二） 質(zhì)粒NDA的提取1、 快速分離小量質(zhì)粒DNA-堿變性法2、 質(zhì)粒DNA的大量提?。ㄈ?質(zhì)粒DNA的純化（四） 地高辛標記DNA/cDNA三、 基本方法原位雜交方法很多，基本操作步驟包括標本制備、雜交前處理、雜交反應、雜交后處理和雜交體檢測等步驟。（一）標本制備原位雜交標本的制備，要求既保存組織良好的形態(tài)結(jié)構(gòu)，又避免組織中靶核酸的降解。DNA比較穩(wěn)定，mRNA很容易降解。原則上取材要新鮮，標本一般要固定30min。固定劑有沉淀固定劑及交聯(lián)固定劑二類。常用的固定劑有乙醇、甲醇和丙酮等。交聯(lián)固定劑有多聚甲醛、甲醛和戊二醛等。經(jīng)固定的組織細胞透明性較好，利于探針進入組織細胞內(nèi)。多數(shù)情況下，4%多聚甲醛可獲得較滿意的原位雜交結(jié)果。固定方法可采用灌注法或浸漬法，也可將標本先制備冰凍切片，然后再固定。經(jīng)固定的組織用PBS漂洗后，即可按常規(guī)進行石蠟包埋。常用的原位雜交標本有石蠟切片、冰凍切片和細胞培養(yǎng)標本。為了防止組織和細胞在雜交過程中的脫落，載玻片要涂以銘釩明膠，多聚賴氨酸或進行硅烷處理。制備石蠟切片，展片時要用含0.04%DEPC處理的雙蒸餾水。制成的石蠟切片置于52°C烤箱過夜，隨即可用來做原位雜交。經(jīng)烤干的切片也可在室溫下保存。冰凍切片可從新鮮組或固定的組織用恒冷箱切片制備。制成的冰凍切片置37C干燥4h或過夜后即可進行原位雜交。新鮮組織制備的冰凍切片，最好先用固定劑固定（如用4%多聚甲醛固定10min），然后再干燥，-70C保存或在70%乙醇中（4C）保存。培養(yǎng)細胞標本制備采用細胞離心法。光將生長在培養(yǎng)瓶壁上的細胞用胰蛋白酶處理，制成含1X105細胞/ml濃度的懸液。用離心法將細胞懸液制成細胞離心標本，使細胞貼附于經(jīng)處理的載玻片上。如果細胞直接生長在載波片或蓋玻片上，可直接固定。（二）雜交前處理雜交前處理的目的在于提高組織細胞的通透性，增加靶核酸的可及性，以及防止RNA或DNA探針與細胞、組織或載玻片之間的非特異性結(jié)合，從而增強信號，減低背景。方法和步驟因所采用的固定劑、組織標本以及探引的不同而異。用溫和的非交聯(lián)固定劑固定的細胞培養(yǎng)標本和冰凍切片，不需經(jīng)特殊的雜交前處理，一般都能獲得較好的反應結(jié)果。交聯(lián)固定劑固定的標本，尤其是福爾馬林固定的石蠟切片標本，需要雜交前處理才能獲得較好的結(jié)果。1、 脫蠟石蠟切片必須先脫蠟。標本先入二甲苯37C作用30min，再轉(zhuǎn)入新鮮的二甲苯，室溫脫蠟10min，然后經(jīng)濃度逐漸下降的梯度乙醇入水。2、 去污劑處理去污劑處理的目的是增加組織的通透過，利于雜交探針進入組織細胞。3、 蛋白酶處理蛋白酶消化能使經(jīng)固定后被遮蔽的靶核酸暴露，以增加靶核酸的探針可及性。常用的蛋白酶有蛋白酶K，鏈霉蛋白酶和胃蛋白酶。過度的蛋白酶消化會引起細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞及核酸的減少，也會導致標本從玻片脫落。4、 酸苷處理和酸處理為了防止探針與組織中堿性蛋白之間的靜電結(jié)合，降低背景，雜交前標本可用0.25%乙酸酐處理10min。經(jīng)乙酸酐處理后，組織蛋白中的堿性基團通過乙酰化而被阻斷。這樣不僅增加靶核酸的探針可及性，也可避免堿性蛋白與核酸探針之間的非特異性的結(jié)合，達到降低背景的目的。5、 雜交緩沖液孵育雜交前先用不含探針的雜交緩沖被在雜交溫度下孵育2h，以阻斷載玻片上和組織標本中能與探針產(chǎn)生非特異性結(jié)合的位點，以達到減低背景的目的。6、 內(nèi)源性生物素和酶的抑制非放射性原位雜交，如用生物素、辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶作為標記物，組織中的內(nèi)源性的生物素、辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶則應事先阻斷。用內(nèi)源性生物較為豐富的組織（如肝、腎等）做免疫組織化學時，標本可先依次用不標記的卵白素-生物素作為顯色系統(tǒng)的原位雜交。為了阻斷內(nèi)源性堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶，可分別將標本浸于20%乙酸（4°C）中15s，或0.019g/L過碘酸淋浴和用含1%H2o的蒸餾水或甲酵溶液室溫孵育30min。（三）雜交反應1、 雙鏈。NA探針和靶DNA的變性進行雜交反應時，探針和靶核酸序列部必須是單鏈的。如用雙鏈DNA探針檢測DNA，則探針靶核酸都必須先解鏈。操作時，可先將含有雙鏈探針的雜交液加在組織標本上，再將載玻片加熱至95C，5-15min。這樣，探針與靶DNA之間的雜交反應隨即進行。單鏈的DNA不需要變性，可將探針加在組織標本上，用上述方法使靶DNA變性。使用雙鏈DNA探針檢測RNA時，將10倍濃度的探針加熱至95C，5-15min，隨即將探針置于冰水中5min，再用變性后的探針按要求的濃度加入雜交液中做雜交反應。探針一旦變性后，要馬上進行雜交反應。2、 雜交液雜交液內(nèi)除含一定濃度的標記探針外，還含有較高濃度的鹽、甲酰胺、硫酸葡聚糖、牛血清白蛋白及載體DNA或RNA等。雜交液中含有高濃度的Na+可增加雜交率，減低探針與組織標本之間的靜電結(jié)合。甲酰胺使雜交溫度降低，避免因雜交溫度過離而引起的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞以及標本的脫落。硫酸葡聚糖能與水結(jié)合，減少雜交液的有效容積，提高探針的有效濃度，以達到提高雜交率的目的。牛血清白蛋白及載體DNA或RNA等，都是為了阻斷探針與組織結(jié)構(gòu)成分之間的非特異結(jié)合，以減少背景。3、 探針濃度探針濃度的高低將影響雜交反應的速度，探針濃度低，雜交反應緩慢，探針濃度高，雜交反應快。探針濃度過高，背景也會增加。最適宜的探針濃度應能獲得最強的信號，同時背景又低。探針在不同的組織以及用不同方法制備的標本上、彌散和穿透的情況也不相同，因而所需要的最適宜濃度也可能有差別。4、 雜交溫度雜交溫度應低于雜交體的融解溫度Tm（20-30°C），如所形成的雜交體的Tm為70°C,那么雜交溫度應在40-50C左右。在這一溫度條件下進行雜交反應、雜交率最高。5、 雜交時間雜交反應的時間可能隨著探針的濃度的增加而縮短，但在一個相當大的濃度范圍內(nèi)，雜交反應在4-6h完成。一般可將雜交濃液和標本孵育過夜，雜交反應時間不超過24h，反應時間過長，形成的雜交體會解鏈，雜交信號反而會減弱。6、 嚴格度雜交體雙鏈間堿基對的相配程度，可影響雜交體的穩(wěn)定性。在溫度較低的情況下，探針不僅可與堿基對完全互補的特異性靶核酸序列相結(jié)合，同時也可以與含有不相配堿基對的類似序列結(jié)合。決定探針是否能與含不相配堿基對的核酸序列結(jié)合而形成雜交體的條件即稱為嚴格度。在高嚴格度條件下，只有減基對完全互補的雜交體才穩(wěn)定；在低嚴格度條件下，堿基對并不完全互補的雜交體也可形成。影響嚴格度的因素：影響嚴格度的因素甲酰胺的濃度、溫度和離子強度。在低甲酰胺濃度、低溫度以及高離子濃度的條件下，嚴格度低；反之，嚴格度高。嚴格度可以在雜交反應及雜交后洗滌過程中調(diào)節(jié)。（四）雜交后處理雜交后處理的目的，是除去未參與雜交體形成的過剩探針，除去探針與組織標本之間的非特異性結(jié)合，包括那些與靶核酸相似的序列與探針之間形成的含非互補堿基對的雜交體，從而減低背景。雜交后處理應包括高鹽濃度的漂洗，以減少探針與組織標本間的靜電結(jié)合。當用RNA探針時，雜交后可用RNA酶處理，RNA酶僅使單鏈的RNA降解，而對RNA：RNA雜交體則無影響。在進行雜交后RNA酶處理時，應注意所用的試劑中不要含有對RNA酶有抑制作用的物質(zhì)。（五）雜交體的檢測與結(jié)果分析原位雜交主要通過顯色的方法顯示結(jié)果。放射性同性素標記探針的原位雜交，用放射自顯影術進行檢測。非放射性原位雜交，由于標記物種類較多，所用的檢測方法則要根據(jù)標記物的性質(zhì)而定。如常用的生物素標記探針，可用生物素一卵白紊系統(tǒng)檢測，也可用生物素-抗生物素抗體系統(tǒng)檢測。地高辛標記原位雜交，則可用特異性抗地高辛抗體用免疫組化學技術檢測。1、 定性分析(1)組織或細胞對照用已知的探針互補核酸序列的組織同時進行原位雜交。(2)探針對照未標記的探針進行雜交后，應該出現(xiàn)陰性結(jié)果。方法對照去探針、去抗體等對照。以證明原位雜交實驗操作的準確性以及實驗結(jié)果的特異性，需要設置包括組織對照、探針對照、雜交反應對照和檢測系統(tǒng)對照在內(nèi)的一系列陽性對照和陰性對照。?定量分析放射自顯影的標本可以用數(shù)銀顆粒的方法，生物素標記探針雜交產(chǎn)物可以用圖像分析儀等儀器進行定量。第五節(jié)原位PCR原位PCR(inSituPCR，IS-PCR)，是PCR和原位雜交2種技術相結(jié)合，是一種將靶DNA在原位擴增后進行原位雜交的技術。操作程序基本兼有2種技術的所有過程。首先在適當處理的細胞和組織切片上滴加PCR反應液，然后把載玻片故入熱循環(huán)儀進行擴增，最后通過標記的探針進行原位雜交檢測擴增產(chǎn)物。PCR技術有許多優(yōu)點，但PCR是在液相中進行的。PCR擴增前，要把細胞破壞，從中提取模板。因此很難把PCR的結(jié)果與組織細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征聯(lián)系起來，也很難判斷含特異靶序列的細胞類型。原位雜交是分子雜交與組織化學技術的成功結(jié)合。它能在原位檢測組織細胞內(nèi)特定的DNA或RNA序列。雖然原位雜交技術可以檢測組織細胞內(nèi)的特異靶序列的細胞類型和組織細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)與病理變化，有時原位雜交的結(jié)果受到其敏感性的限制，不能檢出組織細胞內(nèi)單拷貝序列和低于10-20拷貝的RNA序列。一、 原位PCR的基本原理原位PCR的待測樣品需經(jīng)化學固定，以保持組織細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。PCR擴增所需的必要成分，如引物、DNA聚合酶、4種三磷酸核苷酸等進入組織細胞內(nèi)或核內(nèi)，以固定的DNA或RNA為模板，在原位進行擴增。PCR反應在由細胞膜組成的"囊袋”中進行。原位PCR綜合了PCR和原位雜交的特點，既能檢測細胞內(nèi)單拷貝或低拷貝的DNA或RNA序列，同時還可以對含靶序列的組織細胞進行形態(tài)學分析。二、 常用的原位PCR法直接法原位PCR特點是擴增產(chǎn)物直接攜帶標記分子。該法反應體系中使用標記的三磷酸核苷酸或引物。放射性同位京35S、生物素和地高辛是3種最常用的標記物。當標本進行PCR時，標記分子就接人到擴增產(chǎn)物中。可用放射自顯影術、免疫組織化學或親合組織化學等方法擴增產(chǎn)物直接法原位PCR的優(yōu)點是操作簡便、流程短、省時；缺點是特異性較差、易出現(xiàn)假陽性，擴增效率較低。（二） 間接法原位PCR是目前最常用的靶核苷酸序列原位擴增技術。當PCR原位擴增后，再用原位雜交技術檢測特異擴增產(chǎn)物。該法擴增效率高，特異性較好。因為原位雜交所用的探針可以特異地檢出擴增產(chǎn)物中的靶序列。（三） 原位-反轉(zhuǎn)錄PCR是結(jié)合反轉(zhuǎn)錄反應和PCR擴增檢測細胞內(nèi)低拷貝mRNA的方法。反應分2步進行：第一步以mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下合成cDNA；第二步則以cDNA為模板，用PCR對靶序列進行擴增。進行原位反轉(zhuǎn)求PCR過程是在固定的組織細胞標本上進行的，標本先用DNA酶處理，破壞組織內(nèi)的DNA，以確保PCR擴增的模板是從mRNA反轉(zhuǎn)入合成的cDNA，而不是細胞內(nèi)原有的DNA。三、原位PCR的基本步驟包括標本制備、預處理、原位PCR、后處理和原位檢測等。（一）標本制備1、 標本種類原位PCR可以在細胞懸液、細胞涂片、細胞離心標本、細胞分裂中期染色體標本、冰凍切片以及石蠟切片中進行。懸浮的完整細胞做效果最好，細胞涂片和細胞離心標本次之，切片標本較差。完整細胞中的核酸序列損害較少，完整的細胞膜和核膜可作為防止擴增產(chǎn)物擴散的自然屏障，而在切片標本上，很多細胞都沒有完整的細胞膜和核膜，擴增產(chǎn)物不易在原位保留。大部分病理標本都是以福爾馬林固定、石蠟包埋的PCR。原位PCR一般一般切片厚一些，效果較好。做PCR前要充分暴露細胞中的靶DNA，注意PCR中合適的引物、多聚酶、Mg+和dNTP濃度，更重要的是擴增的DNA保持在原來細胞該內(nèi)而不彌散，這是IS-PCR成功的關鍵。為了防止細胞、組織標本在原位PCR操作過程中脫落，玻片涂多聚賴氨酸或進行烷硅處理。2、 固定固定的目的不僅保存組織細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)便于定位，還能保存用做PCR模板的起始物DNA或RNA。常用的固定劑有緩沖福爾馬林（10%,4°C固定4-6h）、4%多聚甲醛和丙酮。（二） 預處理制備好的組織標本，在進行原位PCR之前，一般都要用蛋白酶預處理，增加通透性，反應試劑易進入組織細胞內(nèi)，并暴露靶序列用以擴增。蛋白酶消化不足，組織細胞的通透性差，蛋白質(zhì)與核酸間的交聯(lián)廣泛，影響PCR反應，導致假陰性；消化過度則會破壞組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，使PCR產(chǎn)物易于通過破裂的膜結(jié)構(gòu)向外彌散，影響結(jié)果。蛋白酶消化強度要根據(jù)組織固定的程度來調(diào)整。組織細胞固定得越充分，蛋白酶消化也要強。消化后，要加熱將酶滅活.或通過充分洗滌將酶完全除去。也可用去污劑代替蛋白酶進行標本出處理，以增加通透性。（三） 原位擴增引物PCR所用引物一般為長18-28個核苷酸，擴增的片段100一1000bP。原位PCR宜用較短的引物。在原位PCR組織標本的制備過程中，DNA和RNA常有一定程度的降解，尤其是存檔組織的石蠟切片，DNA和RNA的降解就更明顯。從蠟塊中提取的DNA很少超過400bP，RNA則不超過200個bp。長序列的擴增易引起非特異的擴增。一般情況下，用1對引物就可以，有時需用2對引物來提高PCR反應的特異性。反應體系原位的反應體系與常規(guī)的液相PCR基本相同，不同的是原位PCR的靶序列DNA或RNA在固定的細胞內(nèi)，由于空間位置的緣故，標本中的靶序列并不與引物結(jié)合而獲得擴增。靶序列的完整性也常在標本制備過程中受到損害。為了獲待較好的擴增效果，有人主張反應體系中引物、TaqDNA聚合酶和Mg2+的濃度比常規(guī)PCR中的要高一些。用細胞懸液做原位PCR，擴增反應像普通PCR一樣在Ep管內(nèi)進行。反應納束后再離心將細胞沉淀在玻片上，對擴增產(chǎn)物過行原位雜交。用細胞涂片、細胞離心標本或切片標本做原位PCR，擴增反應在被片上進行，要將反應混合物滴加在玻片上，覆以蓋玻片。反應體系中要加牛血清白蛋白，以防DNA聚合酶與破片結(jié)合而減低擴增效率。熱循環(huán)玻片上原位PCR的