2022年醫(yī)學(xué)專題-第三章-細(xì)菌的遺傳與變異

第三章細(xì)菌(xìjūn)的生長和遺傳變異第一頁，共九十八頁。第一節(jié)細(xì)菌(xìjūn)的生長及其特性細(xì)菌(xìjūn)在適宜的環(huán)境條件下，不斷吸收營養(yǎng)物質(zhì)，按照自己的代謝方式進(jìn)行新陳代謝活動。正常情況下，同化作用大于異化作用，細(xì)菌大量繁殖，數(shù)量增多的現(xiàn)象叫做生長。這里的生長是細(xì)菌群體數(shù)量的增長。第二頁，共九十八頁。細(xì)菌個體生長到一定階段，就會以二分裂的方式形成二個子細(xì)胞，細(xì)菌個體數(shù)目增加，這種繁殖方式似乎與動植物的繁殖方式大不相同，但如果(rúguǒ)我們將細(xì)菌看作是一個植物的種子或動物的受精卵，把細(xì)菌繁殖產(chǎn)生的群體作為整體來考慮的話，細(xì)菌與其他生物則是完全相同的。細(xì)菌更像是一個“沒有固定形狀，沒有組織分化，可分可合”的多細(xì)胞生物，更象是特殊植物，這里之所以說它是植物是因?yàn)橹灰o以合適的條件細(xì)菌也可以像植物一樣永遠(yuǎn)生長下去。各類細(xì)菌都是抱團(tuán)群居，研究表明群居的細(xì)菌獲得營養(yǎng)的能力大大高于游離的細(xì)菌，同時群居的細(xì)菌還象高等動植物一樣釋放類似激素的調(diào)節(jié)因子，使群體主動適應(yīng)環(huán)境的變化，并對環(huán)境產(chǎn)生影響，因此研究單個細(xì)菌的生長意義不大，通常都是將細(xì)菌群體作為研究對象，考察細(xì)菌群體的生長規(guī)律，“生、老、病、死”。在介紹細(xì)菌的生長規(guī)律之前，先介紹細(xì)菌生長數(shù)量的測定方法。第三頁，共九十八頁。一、細(xì)菌(xìjūn)生長測定方法（1）直接測定

直接測定是常用的細(xì)菌生長(shēngzhǎng)測定方法，它借助顯微鏡直接觀察計(jì)數(shù)，其優(yōu)點(diǎn)是測定過程快速，缺點(diǎn)是不能區(qū)分細(xì)菌的死活。直接測定法根據(jù)不同的測定方法原理，可以分成以下幾類：1.涂片染色法

將已知體積(0．01ml)的待測樣品，均勻地涂布在載玻片的已知面積內(nèi)(1cm2)，經(jīng)固定染色后，在顯微鏡下選擇若干個視野計(jì)算細(xì)胞的數(shù)量，每個視野的直徑和面積、對應(yīng)的細(xì)菌體積用目鏡測微尺測出，結(jié)合視野中的細(xì)菌數(shù)量從而推算0．01ml菌樣的細(xì)菌數(shù)量。第四頁，共九十八頁。涂片(túpiàn)染色法第五頁，共九十八頁。2．計(jì)數(shù)器測定法將菌液滴在血球計(jì)數(shù)板0．1ml

的計(jì)數(shù)格中，細(xì)菌被固定(gùdìng)染色后，在顯微鏡下選擇數(shù)出若干個小格中的細(xì)菌數(shù)目，（一般數(shù)125個小格），根據(jù)比例關(guān)系折算出單位體積菌液中細(xì)菌的數(shù)量。第六頁，共九十八頁。例如數(shù)了125個小格中有90個細(xì)菌則(90÷125)÷0.0025=288個/ml菌液中細(xì)菌數(shù)目就為288個/ml。這種方法只能測定個體較大的細(xì)菌，細(xì)菌個體r若太小，則由于每一小格中細(xì)菌層層(cénɡcénɡ)疊加，相互遮擋，難以準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。若適當(dāng)稀釋，效果較好。第七頁，共九十八頁。3．比例(bǐlì)計(jì)數(shù)法將待測樣品溶液與等體積的血液(xuèyè)混合，然后涂片，在顯微鏡下測定細(xì)菌與紅血球數(shù)的比例，因血液(xuèyè)中的紅血球數(shù)已知(男性400~500萬個／ml，女性350~450萬個／ml)，由此可以測得細(xì)菌數(shù)量。第八頁，共九十八頁。4．比濁計(jì)數(shù)法這是測定懸浮細(xì)胞的快速方法。其原理是細(xì)菌細(xì)胞是不完全透光的，光束通過懸浮液時會引起光的散射或吸收，降低透光度，在一定范圍內(nèi)透光度與溶液的混濁度即細(xì)胞濃度成正比，藉此可以測定細(xì)菌濃度。采用這種方法時；為了得到實(shí)際的細(xì)胞絕對含量，通常須將已知細(xì)胞濃度的樣品按上述測定程序制成標(biāo)準(zhǔn)(biāozhǔn)曲線，然后根據(jù)透光度或光密度值從標(biāo)準(zhǔn)(biāozhǔn)曲線中直接查得細(xì)菌含量。第九頁，共九十八頁。

（1）制標(biāo)準(zhǔn)(biāozhǔn)曲線（2）測定菌液濁度，查表得出(déchū)細(xì)菌數(shù)量第十頁，共九十八頁。（二）間接(jiànjiē)計(jì)數(shù)法間接(jiànjiē)計(jì)數(shù)法又稱活菌計(jì)數(shù)法。它是通過測定樣品中活的細(xì)菌數(shù)量來間接地表示細(xì)菌的含量。這種方法優(yōu)點(diǎn)在于只計(jì)數(shù)樣品中的活細(xì)菌數(shù)目，缺點(diǎn)在于測定所需的時間較長，手續(xù)繁瑣。它分下述幾種方法：1.平板計(jì)數(shù)法將待測細(xì)菌樣品先作10倍梯度稀釋，然后取相應(yīng)稀釋度的樣品涂布于固體平板培養(yǎng)基上，或與未經(jīng)融化的固體培養(yǎng)基混合、搖勻，培養(yǎng)一定時間后觀察并計(jì)數(shù)(jìshù)生長的菌數(shù)，最終根據(jù)細(xì)菌數(shù)和取樣量計(jì)算出細(xì)菌濃度。第十一頁，共九十八頁。第十二頁，共九十八頁。各取1ml，均勻(jūnyún)涂布于固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，每一個(yīɡè)細(xì)菌會生成一個(yīɡè)菌落稀釋度過小，菌落(jūnluò)密集無法計(jì)數(shù)可以計(jì)數(shù)，但數(shù)量過多，費(fèi)時費(fèi)力數(shù)量合適，統(tǒng)計(jì)計(jì)算，作為結(jié)果數(shù)量太少，誤差因素太大，不做計(jì)數(shù)第十三頁，共九十八頁。一般計(jì)數(shù)平板的細(xì)菌生長菌落數(shù)以30~300個為宜。細(xì)菌數(shù)量=數(shù)出的菌落數(shù)/稀釋度例如：10-5稀釋度時菌落數(shù)為100個則細(xì)菌數(shù)量=100/10-5=107個/mL

平板計(jì)數(shù)法是采用(cǎiyòng)最廣的一種活菌計(jì)數(shù)法。

第十四頁，共九十八頁。2.液體(yètǐ)計(jì)數(shù)法液體計(jì)數(shù)法是根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理設(shè)計(jì)的一種方法。具體做法是：先將待測菌液作10倍梯度稀釋，然后取相應(yīng)(xiāngyīng)稀釋度的樣品分別接種到3管或5管一組液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一定時間后，觀察各管及各組中細(xì)菌是否生長、記錄結(jié)果，再查與之匹配的統(tǒng)計(jì)表，即最可能數(shù)表(MPN)，算出細(xì)菌的最終含量。因此，這種方法又叫最可能數(shù)法或MPN法。例如測定硫酸鹽還原菌的數(shù)量，這種菌是厭氧菌，生長中形成了硫化氫氣體，這些硫化氫會與鐵生成大量黑色的硫化亞鐵沉淀，在顯微鏡下這些沉淀很難與細(xì)菌區(qū)分；由于它是厭氧菌，不能在空氣狀態(tài)下生長，因此平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)也無法使用(shǐyòng)，對這類菌可以利用它們生長時產(chǎn)生的硫化亞鐵黑色特征進(jìn)行液體培養(yǎng)，按MPN法進(jìn)行計(jì)數(shù)。第十五頁，共九十八頁。（1）10倍梯度(tīdù)稀釋第十六頁，共九十八頁。第十七頁，共九十八頁。(3)統(tǒng)計(jì)(tǒngjì)、查表、計(jì)算

①統(tǒng)計(jì)確定(quèdìng)數(shù)量指標(biāo)取生長的管數(shù)最多的且稀釋度最高稀釋度的生長管中生長的管數(shù)，為數(shù)量指標(biāo)的第一位數(shù)字，后面兩個稀釋度的生長管數(shù)后兩位數(shù)，就上例情況而言，3個重復(fù)生長的10-3和10-4兩個稀釋度，但兩者中高稀釋度的是10-4，其生長管數(shù)“3”為數(shù)量指標(biāo)的第一位數(shù)字；第二和第三位數(shù)則為2和0。因此所得的數(shù)量指標(biāo)為“320”。②查表所查的統(tǒng)計(jì)表是通過其他精確的計(jì)數(shù)方法，確定的各種數(shù)量指標(biāo)時細(xì)菌(xìjūn)數(shù)量的可能的最大值，在確定了數(shù)量指標(biāo)后，可從MPN三管法統(tǒng)計(jì)表查相應(yīng)的細(xì)菌最大可能數(shù)量。第十八頁，共九十八頁。MPN三管法測數(shù)統(tǒng)計(jì)表上面(shàngmiɑn)例子中數(shù)量指標(biāo)“320”對應(yīng)的細(xì)菌最大可能數(shù)為9.5個菌/毫升。雜質(zhì)過多的污水不適宜(shìyí)用其他方法測定大腸桿菌，同樣可以MPN法進(jìn)行測定，除此之外，厭氧的鐵細(xì)菌也只能用這種方法進(jìn)行數(shù)量統(tǒng)計(jì)。第十九頁，共九十八頁。3.薄膜計(jì)數(shù)法對于某些細(xì)菌(xìjūn)含量較低的樣品(如空氣或飲用水)，可采用薄膜計(jì)數(shù)法。將待測樣品通過帶有許多小孔但又不讓細(xì)菌透過的微孔濾膜，藉助膜的作用將細(xì)菌濃縮，再將膜放于固體培養(yǎng)基表面培養(yǎng)，然后類似于平板計(jì)數(shù)那樣計(jì)算結(jié)果。這種計(jì)數(shù)法要求樣品中不得含有過多的懸浮性固體或小顆粒。（1）抽濾第二十頁，共九十八頁。（2）濾膜培養(yǎng)(péiyǎng)（3）統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)樣品中的細(xì)菌數(shù)量=菌落數(shù)÷抽濾樣品的體積數(shù)例如上圖測出5個菌落，抽濾了100ml自來水則自來水中的細(xì)菌數(shù)=5÷100ml=50個/L自來水上述各種活菌計(jì)數(shù)法中，根本原理都是利用一個細(xì)菌可以繁殖生成一個菌落的特點(diǎn)。因此被測的細(xì)菌都應(yīng)處于均勻(jūnyún)分散的懸浮狀態(tài)。對于本身為絮體或顆粒狀的細(xì)菌樣品，如好氧水處理中的活性污泥，在測定計(jì)數(shù)之前要采取預(yù)處理方法(如勻漿器搗碎等)進(jìn)行強(qiáng)化分散。第二十一頁，共九十八頁。(三)重量(zhòngliàng)法細(xì)菌細(xì)胞盡管很微小，但是仍然具有一定的體積和重量，在細(xì)菌生長過程中，測定單位體積液體中細(xì)菌群體重量變化直接表示細(xì)菌生長數(shù)量的方法稱為重量法。1.測定細(xì)胞干重法測定干重時，需先將細(xì)菌分離，再烘干稱量。分離可采用離心法或過濾法。取已經(jīng)培養(yǎng)一段時間的待測細(xì)菌樣品，用離心機(jī)收集(shōují)生長后的細(xì)菌細(xì)胞，或用濾紙、濾膜過濾截取生長后的細(xì)菌細(xì)胞，然后在105～110℃下進(jìn)行干燥，稱取干燥后的重量，以此代表細(xì)菌生長量的多少。從細(xì)菌細(xì)胞的化學(xué)組分可知，干重約為濕重的10％~20％。原核細(xì)菌的細(xì)胞重量是10-15~10-11g/個細(xì)胞，真核單細(xì)胞微生物重量為10-11~10-7g/個細(xì)胞。第二十二頁，共九十八頁。水處理工程設(shè)施中的細(xì)菌生長量通常采用這種細(xì)胞干重測定法。這種方法實(shí)際上測得的是水中懸浮物重量，它是將細(xì)菌作為(zuòwéi)所有懸浮物來進(jìn)行測定，如果水中非細(xì)菌類的懸浮物很多的話，勢必會嚴(yán)重干擾細(xì)菌計(jì)數(shù)的結(jié)果。非細(xì)菌的懸浮物通常大部分是一些固體無機(jī)物及少量的油類等有機(jī)物，有機(jī)物與無機(jī)物在物理性質(zhì)上有一個最大的區(qū)別，即在很高的溫度下，有機(jī)物會被空氣中的氧氣徹底氧化為CO2和H2O，只留下非常少的殘?jiān)?，而無機(jī)物化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，高溫下不會分解，這樣我們可以利用高溫灼燒的方法來區(qū)分細(xì)菌與固體無機(jī)物。第二十三頁，共九十八頁。（1）懸浮物中絕大多數(shù)為細(xì)菌(xìjūn)時細(xì)胞(xìbāo)數(shù)目=細(xì)菌群體的重量÷個體細(xì)菌的平均重量第二十四頁，共九十八頁。（2）除細(xì)菌外還有大量(dàliàng)無機(jī)懸浮物時

W1

W2細(xì)菌(xìjūn)群體的重量=W2－W1細(xì)胞數(shù)目=細(xì)菌群體的重量÷個體細(xì)菌的平均重量第二十五頁，共九十八頁。（3）除細(xì)菌(xìjūn)外還有大量有機(jī)懸浮物時過多的有機(jī)物懸浮物會對測定結(jié)果干擾(gānrǎo)很大，此時不能用重量法，應(yīng)改用其他方法?？傮w來說重量法方法較之其他方法誤差較大，一般只能作為粗率估計(jì)的計(jì)數(shù)方法。第二十六頁，共九十八頁。2.細(xì)胞(xìbāo)含氮量法所有生物包括細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)氮含量比較穩(wěn)定，一般在15％~16％，平均為16％。根據(jù)樣品中屬于有機(jī)來源的氮含量測定結(jié)果，就可以求出細(xì)菌生長量的多少。這種方法首先確定三項(xiàng)已知數(shù)，細(xì)菌中的蛋白質(zhì)平均含量、水樣中的氮來源、水樣中的有機(jī)氮含量。細(xì)菌中的蛋白質(zhì)含量可以通過實(shí)驗(yàn)室純細(xì)菌的分離破碎及氮含量測定來得出；水樣中的氮來源可通過分析水的來源進(jìn)行定性分析，如細(xì)菌培養(yǎng)液中起始的成分是無機(jī)氮化合物則水樣中的有機(jī)氮都來源于細(xì)菌的蛋白質(zhì)，這種情況下通過凱氏定氮測定出的有機(jī)氮含量就是細(xì)菌中的蛋白質(zhì)含量，繼而通過計(jì)算得出水中的細(xì)菌數(shù)量。細(xì)菌的數(shù)目=有機(jī)氮含量÷16%÷單個細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量如果水中非細(xì)菌的蛋白質(zhì)比例過大，如屠宰廠廢水(fèishuǐ)及食品加工廠廢水(fèishuǐ)，這時細(xì)菌與游離蛋白質(zhì)難以區(qū)分，這種方法不易參用。第二十七頁，共九十八頁。3.DNA含量(hánliàng)法這種方法與細(xì)胞含氮量法思路是一樣的，不同的細(xì)菌(xìjūn)細(xì)胞DNA含量是不同的，但同種細(xì)菌的DNA含量卻是基本一致。利用這一特性，可以通過測定DNA的含量來表示細(xì)菌的生長量，故可采用適當(dāng)?shù)臒晒庵甘緞┗蛉旧珓┡c菌體DNA作用，用熒光比色或分光光度法測得DNA的含量。這種方法對樣品純度以及儀器和人員的要求較高，通常只作為少量細(xì)菌純培養(yǎng)時細(xì)菌數(shù)量的測定，條件合適時，這種方法的精確性是非常高的。第二十八頁，共九十八頁。(四)其它生理(shēnglǐ)生化指標(biāo)法細(xì)菌的生長生命活動過程中，不可避免地要吸收和消耗一些物質(zhì)，同時產(chǎn)生和分泌另一些物質(zhì)。測定這些物質(zhì)的變化與細(xì)菌數(shù)量的變化有著直接的關(guān)系，通過測定這類物質(zhì)的變化可以間接表示細(xì)菌生長的情況。水處理中通常采用的生理生化指標(biāo)有：營養(yǎng)物質(zhì)(COD)的消耗，溶解氧的消耗(如好氧細(xì)菌的瓦呼儀測定法)，有機(jī)酸的產(chǎn)生，H2和CH4的產(chǎn)生(如厭氧細(xì)菌的生長及活性測定)。利用這類方法時，首先要確定(quèdìng)細(xì)菌的數(shù)量與這些物質(zhì)變化的對應(yīng)關(guān)系，作出相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。繼而查表計(jì)算。第二十九頁，共九十八頁。如好氧細(xì)菌，利用COD消耗速率與細(xì)菌數(shù)量的比例關(guān)系，由COD消耗情況(qíngkuàng)判斷細(xì)菌數(shù)量時，通常按如下方法進(jìn)行（1）測定COD消耗速率與細(xì)菌數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

分批細(xì)菌培養(yǎng)，固定時間取樣測定培養(yǎng)條件下細(xì)菌數(shù)量與COD的值，作COD消耗速率與細(xì)菌數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。第三十頁，共九十八頁。（2）應(yīng)用(yìngyòng)實(shí)際中我們只需要測定COD的消耗速率，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線查相應(yīng)的細(xì)菌數(shù)量，這類方法的準(zhǔn)確性受細(xì)菌種類、標(biāo)準(zhǔn)測定情況與實(shí)際水環(huán)境情況的可比性等因素的影響，一般只用于實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌生理研究使用。以上(yǐshàng)細(xì)菌的各類測定方法各有長短，使用時應(yīng)該根據(jù)具體情況加以選取。第三十一頁，共九十八頁。二、細(xì)菌(xìjūn)的生長特性將細(xì)菌整個群體作為研究對象，來研究它們生長的特點(diǎn)就是我們這里所說的細(xì)菌生長特性，大體上可以分為兩種情況，一種是間歇式培養(yǎng)（又叫分批式培養(yǎng)），另一種是連續(xù)式培養(yǎng)。一般通過測定細(xì)菌重量或數(shù)量隨培養(yǎng)時間延續(xù)的曲線(qūxiàn)關(guān)系來考察細(xì)菌的生長特性。1.間歇培養(yǎng)和生長曲線

通常情況實(shí)驗(yàn)室的細(xì)菌培養(yǎng)都采用細(xì)菌的間歇培養(yǎng)，這種培養(yǎng)只有開始時的一次投料和接種細(xì)菌，其余時間細(xì)菌根據(jù)環(huán)境變化自行生滅。這種培養(yǎng)方式主要用于細(xì)菌的生理特性研究。同時生物工程和廢水生物處理中也有一些是以分批式反應(yīng)器進(jìn)行操作的。典型的細(xì)菌間歇式培養(yǎng)狀態(tài)下細(xì)菌有下面一種共通的生長曲線特征。第三十二頁，共九十八頁。（1）活細(xì)菌重量(zhòngliàng)變化曲線在培養(yǎng)的不同時間取一定體積菌液，通過(tōngguò)死活細(xì)胞物理化學(xué)性質(zhì)上的差別直接或間接的方法稱量出活細(xì)胞的重量，得出單位體積菌液中活細(xì)胞重量與時間的變化曲線。在正常生長的情況，曲線關(guān)系如下圖所示第三十三頁，共九十八頁。①生長速率上升(shàngshēng)階段細(xì)菌培養(yǎng)(péiyǎng)初期，營養(yǎng)物豐富，細(xì)菌同化作用旺盛，細(xì)菌數(shù)量呈級數(shù)增加，同時細(xì)菌開始在細(xì)胞內(nèi)以糖原、油滴等形式儲存營養(yǎng)物，細(xì)菌個體重量增大，活細(xì)菌的總重量也迅速升高，體現(xiàn)為重量生長速率隨時間不斷增大，這個階段為生長速率上升階段。第三十四頁，共九十八頁。②生長(shēngzhǎng)速率下降階段隨著時間的延續(xù)，可利用的營養(yǎng)物濃度（好氧細(xì)菌還包括氧氣）下降，同時代謝產(chǎn)物積累對細(xì)菌的某些酶產(chǎn)生抑制，這些限制性因素還不是十分嚴(yán)重，細(xì)菌的同化代謝速度變慢，沒有停止，因此活細(xì)菌的總體重量還是在不斷升高。只是重量生長速率下降，但隨著時間的延續(xù)，外界營養(yǎng)物越來越少，最終(zuìzhōnɡ)無可利用，細(xì)菌的同化作用停止。細(xì)菌總體重量不再變化，達(dá)到最大值。第三十五頁，共九十八頁。③內(nèi)源呼吸及死亡(sǐwáng)階段外界營養(yǎng)物不足，細(xì)菌只能利用體內(nèi)儲存的能源物質(zhì)進(jìn)行內(nèi)源代謝，以維持生命，活細(xì)菌個體不斷消瘦，并開始出現(xiàn)餓死和被環(huán)境中的有害代謝產(chǎn)物毒死的現(xiàn)象。但活菌數(shù)量總體還會維持一個短時期的增長，這是由于尚有前期儲備的營養(yǎng)物提供繁殖所需的物質(zhì)和能量，然而也只是2=1+1，且1和1還在繼續(xù)縮水，變?yōu)?.8、0.6,因此活細(xì)胞的總體重量是在下降。隨著內(nèi)部營養(yǎng)物的耗盡和外界有毒代謝產(chǎn)物濃度的進(jìn)一步加大，更多的細(xì)菌死亡，死亡率超過了出生率，活菌數(shù)量下降，每個活菌的重量也由于內(nèi)源代謝而不斷下降，從曲線上反映(fǎnyìng)為活細(xì)菌重量的進(jìn)一步持續(xù)下降。第三十六頁，共九十八頁。值得一提的是細(xì)菌總體不會在短期內(nèi)完全死亡，死亡趨勢不斷減緩，這是由于死亡細(xì)胞分解釋放出的細(xì)胞物質(zhì)被作為殘存細(xì)菌新的營養(yǎng)物，這種積極因素隨著更多細(xì)菌的死亡而不斷顯著，個別細(xì)菌得以繼續(xù)生長(shēngzhǎng)甚至繁殖，但不管怎樣，從總體上看殘存細(xì)菌的生存環(huán)境還是在不斷惡化，活細(xì)胞重量的下降趨勢是無法扭轉(zhuǎn)的。以上就是封閉體系，細(xì)菌間歇式培養(yǎng)的生長情況，本質(zhì)上與其他生物，包括我們?nèi)祟惗际且粯拥?。這種以活菌重量反應(yīng)的細(xì)菌生長曲線，能夠清晰的反映間歇培養(yǎng)時，細(xì)菌的生老病死，但由于活細(xì)胞分離稱重方法繁瑣，細(xì)菌計(jì)數(shù)相對簡單，因而實(shí)驗(yàn)室通常采用細(xì)菌的數(shù)量變化繪制生長曲線。雖然兩種曲線在本質(zhì)上是相同的，但數(shù)量曲線也有它自身的特點(diǎn)和用途。第三十七頁，共九十八頁。2．細(xì)菌(xìjūn)數(shù)量生長曲線細(xì)菌數(shù)量的生長(shēngzhǎng)曲線大體趨勢與活細(xì)菌重量法是相同的，如下圖（之所以細(xì)菌數(shù)目用其數(shù)量的對數(shù)值表示是由于細(xì)菌的數(shù)量很大，通常都是10的幾次方，取對數(shù)作圖時可以更方便(fāngbiàn)一些）總菌數(shù)活菌數(shù)第三十八頁，共九十八頁。（1）遲緩(chíhuǎn)期當(dāng)細(xì)菌被接種到新鮮培養(yǎng)基中，開始一段時間內(nèi)，通常不立即(lìjí)進(jìn)行細(xì)胞分裂、增殖，生長速率近于零，細(xì)胞數(shù)目幾乎保持不變，甚至稍有減少，這段時間被稱為遲緩期。①特征遲緩(chíhuǎn)期是細(xì)胞分裂啟動之前的恢復(fù)或調(diào)整期。而不是生長的休眠或停留期。遲緩期細(xì)胞的主要特征是代謝活躍，體積增大，從介質(zhì)中快速吸收各種營養(yǎng)物質(zhì)，大量合成細(xì)胞分裂所需的酶類，ATP和其他細(xì)胞成分，為細(xì)胞分裂作準(zhǔn)備。由于細(xì)胞重量持續(xù)增大，因此重量圖中沒有類似的遲緩期。第三十九頁，共九十八頁。②產(chǎn)生(chǎnshēng)原因遲緩期可以很長，也可以很短甚至不明顯。遲緩期的形成有多種原因。但都與接種細(xì)菌的狀態(tài)(zhuàngtài)有關(guān)。接種細(xì)菌時的狀態(tài)(zhuàngtài)大體有以下幾種情況Ⅰ.接種生長對數(shù)期的細(xì)菌處于生長對數(shù)期的培養(yǎng)物被接種到與原先同樣的生長條件和同樣培養(yǎng)基中后，幾乎能夠以同樣速率進(jìn)行對數(shù)生長，遲緩期不明顯；Ⅱ.接種生長穩(wěn)定期或衰亡期的細(xì)菌如果被接種的是處于生長穩(wěn)定期或衰亡期的培養(yǎng)物，即使此時培養(yǎng)物中所有細(xì)胞都是活的，遲緩期也會發(fā)生。這是因?yàn)榉€(wěn)定期細(xì)胞生理上已經(jīng)衰老，其合成機(jī)制處于損傷狀態(tài)，基本耗盡了各種輔酶或其他細(xì)胞成分，因而需要一定時間進(jìn)行生理修復(fù)和物質(zhì)的再合成。第四十頁，共九十八頁。Ⅲ.接種受損細(xì)胞如果接種菌是因熱、輻射或有毒化學(xué)物質(zhì)處理而受到損傷的細(xì)菌，遲緩期也會發(fā)生，因?yàn)?yīnwèi)細(xì)胞需要時間修復(fù)這種損傷。Ⅳ.接種富集培養(yǎng)基的細(xì)菌當(dāng)細(xì)菌被從營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)貧乏培養(yǎng)基后，為了合成新培養(yǎng)基中所缺乏的某種營養(yǎng)物質(zhì)以滿足自身生長，結(jié)果也導(dǎo)致遲緩期的出現(xiàn)(chūxiàn)。此外，菌種的遺傳特性和接種體積的大小也會影響遲緩期的長短。第四十一頁，共九十八頁。在實(shí)際工作中如接種菌種以啟動新的水處理設(shè)施，投加新鮮污泥時，接種的細(xì)菌不習(xí)慣于新環(huán)境，會出現(xiàn)或長或短的遲緩期，遲緩期的出現(xiàn)會增加操作(cāozuò)時間，降低工作效率，此時我們可以通過增加接種量、采用最適種齡(處于對數(shù)期的菌種)、選用繁殖速率快的菌種以及盡量保持接種前后所處的培養(yǎng)介質(zhì)和條件一致等方法來縮短或消除遲緩期。應(yīng)用(yìngyòng)第四十二頁，共九十八頁。（2）對數(shù)(duìshù)期一旦細(xì)菌細(xì)胞的生理修復(fù)或調(diào)整完成，遲緩期即告結(jié)束，細(xì)胞開始進(jìn)入快速分裂階段。這一時期細(xì)胞數(shù)目的增加(zēngjiā)以2n級數(shù)進(jìn)行，細(xì)菌的數(shù)目X的增長率只與細(xì)菌的初始數(shù)量有關(guān)。故稱對數(shù)期。相當(dāng)于重量法細(xì)菌(xìjūn)曲線的生長率上升階段。第四十三頁，共九十八頁。①特點(diǎn)(tèdiǎn)對數(shù)(duìshù)期的細(xì)胞分裂速度最快、繁殖一代的時間最短、代謝活動旺盛、對環(huán)境變化敏感，并且細(xì)胞內(nèi)的核糖體等組分也像細(xì)胞數(shù)目一樣以同樣的對數(shù)生長速率增加，細(xì)胞合成核糖體以及蛋白質(zhì)越多，其生長速率也越快。不同細(xì)菌對數(shù)期的生長速率卻變化很大，這與菌種本身的遺傳特性有關(guān)，同時受環(huán)境條件(如溫度、培養(yǎng)基成分等)的影響。如大腸桿菌(dàchánɡɡǎnjūn)在20℃時其代時是35℃條件下的2倍；傷寒桿菌在含0．125％的蛋白陳水培養(yǎng)基中的代時為800min，而在含1．0％時僅為40min。第四十四頁，共九十八頁。②細(xì)菌(xìjūn)代時的計(jì)算細(xì)菌的代時即世代時間，或稱倍增時間是指細(xì)菌繁殖一代即個體數(shù)目增加一倍的時間。細(xì)菌在不同的生長期，不同培養(yǎng)(péiyǎng)溫度、pH、營養(yǎng)物濃度和性質(zhì)的情況下，倍增時間不一樣，對數(shù)期的細(xì)菌細(xì)胞代謝活性最強(qiáng)，組成新細(xì)胞物質(zhì)最快，細(xì)菌數(shù)目呈幾何級數(shù)增加，代時穩(wěn)定，因此細(xì)菌代時的測定必須以對數(shù)期的生長細(xì)胞作為對象。其測定計(jì)算如下：

第四十五頁，共九十八頁。在對數(shù)期分別測定t0時刻與t時間(shíjiān)細(xì)菌的數(shù)量X0與X，基于細(xì)菌的二分裂生長

t0t1→2→22→23（（22）×2）→24→25……2nX0→……X0·24→……X0·2n(n=1、2、3…)…Xn就是細(xì)菌的代數(shù)

第四十六頁，共九十八頁。（3）穩(wěn)定期如果對數(shù)期的細(xì)胞分裂不受節(jié)制的連續(xù)進(jìn)行，理論上一個代時為20min。重10—12g的細(xì)菌，經(jīng)過48h的對數(shù)生長之后，其群體重量可達(dá)到地球重量的4000倍。然而由于營養(yǎng)物的有限，這種情況不會發(fā)生。在一個封閉的系統(tǒng)中，細(xì)菌的對數(shù)生長只能維持一個短暫的時期，最終生長將會降低(jiàngdī)，代時延長，細(xì)胞活力減退。此時新生的細(xì)胞數(shù)目與死亡的細(xì)胞數(shù)目相等，總菌數(shù)達(dá)到最大值，活菌數(shù)保持恒定。圖中的生長速率為一定值，故將其稱為穩(wěn)定期。相當(dāng)于重量生長曲線中的生長率下降階段。第四十七頁，共九十八頁。①特征(tèzhēng)穩(wěn)定期細(xì)胞的特征是從生理上的年輕轉(zhuǎn)化為衰老，表現(xiàn)為細(xì)菌的代謝活力鈍化，細(xì)胞含有較少的核糖體，RNA和蛋白質(zhì)合成緩慢，mRNA的水平低下，因此細(xì)胞的生長變得不平衡，細(xì)胞的形狀有的也發(fā)生改變。因不能維持細(xì)胞壁的合成與修復(fù)(xiūfù)，細(xì)胞的染色特點(diǎn)也發(fā)生變化，如G+轉(zhuǎn)變?yōu)镚—。但此時細(xì)胞的很多功能，如能量代謝和某些生物合成過程還在繼續(xù)進(jìn)行(jìnxíng)，生物化工中作為產(chǎn)品的某些細(xì)菌代謝產(chǎn)物如抗生素和某些酶就是在穩(wěn)定期，特別是在對數(shù)期與穩(wěn)定期轉(zhuǎn)換階段所產(chǎn)生的。某些細(xì)菌的芽孢產(chǎn)生也發(fā)生在穩(wěn)定期。第四十八頁，共九十八頁。（3）死亡(sǐwáng)期如果處于穩(wěn)定期的細(xì)菌繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞的死亡率將逐漸增加，最終群體中活的細(xì)胞數(shù)目將以對數(shù)(duìshù)速率急劇下降，此階段就被稱為死亡期。相當(dāng)于重量法的內(nèi)源呼吸階段。第四十九頁，共九十八頁。①特點(diǎn)(tèdiǎn)死亡期細(xì)胞的總數(shù)雖然鏡檢直接計(jì)數(shù)可能(kěnéng)會保持不變，但間接菌落計(jì)數(shù)檢測到的活細(xì)胞數(shù)目卻在減少，同時伴隨著細(xì)胞的裂解或自溶可釋放出一些代謝產(chǎn)物，如氨基酸、轉(zhuǎn)化酶、外膚酶或抗生素等。個體細(xì)胞呈現(xiàn)多種形態(tài)，有時產(chǎn)生畸形，細(xì)胞大小懸殊，有的細(xì)胞內(nèi)含很多的空泡，G+染色反應(yīng)轉(zhuǎn)變成G—染色反應(yīng)。第五十頁，共九十八頁。死亡期的長短與對數(shù)生長期一樣在不同微生物中變化是很大的，主要與菌種的遺傳特性有關(guān)。有些細(xì)菌的培養(yǎng)物經(jīng)歷所有的各個生長時期，幾天以后死亡；另一些細(xì)菌培養(yǎng)物在幾個月甚至幾年以后仍然含有一些活的細(xì)菌。產(chǎn)芽孢的細(xì)菌其芽孢比代謝活躍的營養(yǎng)細(xì)胞更易于幸存下來。通過補(bǔ)充營養(yǎng)和能源，以及中和環(huán)境毒性，可以減緩死亡期的細(xì)胞死亡速率(sùlǜ)，延長細(xì)菌培養(yǎng)物的存活時間。第五十一頁，共九十八頁。3．細(xì)菌(xìjūn)生長曲線在污(廢)水微生物處理中的應(yīng)用不同的廢水生物活性污泥處理法中，其活性污泥中細(xì)菌的生長(shēngzhǎng)狀態(tài)不同，或處于靜止期，或處于對數(shù)生長(shēngzhǎng)期，或處于衰亡期，等等。在廢水生物處理設(shè)計(jì)時，按廢水的水質(zhì)情況(主要是有機(jī)物濃度)，可利用不同生長階段的微生物處理廢水。第五十二頁，共九十八頁。第五十三頁，共九十八頁。之所以利用的是細(xì)菌特定(tèdìng)的生長階段，是由于水處理大多為連續(xù)化操作，細(xì)菌處于一個相對穩(wěn)定的環(huán)境中，細(xì)菌必然維持在一個與環(huán)境相適應(yīng)的生長階段。只有當(dāng)環(huán)境發(fā)生變化時，細(xì)菌的生長狀態(tài)才會發(fā)生變化。從這里可以看到細(xì)菌的連續(xù)培養(yǎng)與分批培養(yǎng)時的規(guī)律是不同的。第五十四頁，共九十八頁。4.連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)(liánxù)培養(yǎng)與間歇培養(yǎng)不同，它的特點(diǎn)是一方面連續(xù)(liánxù)進(jìn)料，另一方面又連續(xù)(liánxù)出料。它又分為兩種：恒濁連續(xù)培養(yǎng)和恒化連續(xù)培養(yǎng)。第五十五頁，共九十八頁。（1）恒濁連續(xù)培養(yǎng)

是一種(yīzhǒnɡ)使培養(yǎng)液中細(xì)菌的濃度恒定，以濁度為控制指標(biāo)的培養(yǎng)方式。培養(yǎng)基提供足夠量的營養(yǎng)元素，細(xì)菌保持最大速率生長。通過控制進(jìn)料流速使裝置內(nèi)細(xì)菌濁度保持一定，保持理論上的對數(shù)生長期，可獲得大量菌體或與菌體代謝相平衡的代謝產(chǎn)物。這種方式往往用于細(xì)菌的生理生化研究。第五十六頁，共九十八頁。（2）恒化連續(xù)培養(yǎng)

這種方式新鮮培養(yǎng)基以恒定的流速流入，與培養(yǎng)器內(nèi)的培養(yǎng)基瞬間混合，培養(yǎng)器內(nèi)的培養(yǎng)基繼而也以相同的流速恒定流出，進(jìn)水組分及反應(yīng)器中營養(yǎng)物濃度基本不變，因而這種細(xì)菌培養(yǎng)稱為恒化連續(xù)培養(yǎng)。除了分批式間歇曝氣器(SBR)法外，其余的污水生物處理法均采用的是恒化連續(xù)培養(yǎng)。這種方式總是有一種限制性營養(yǎng)物控制生長。如碳源豐富，氮源相對不足；或碳氮源都很充足而微量元素相對較少等，限制性營養(yǎng)物的出現(xiàn)是一種必然現(xiàn)象，這是由于細(xì)菌生長時的營養(yǎng)物繁多，同時(tóngshí)有著固定的配比，培養(yǎng)基或廢水中的成分不可能如細(xì)菌所需要的那樣正好匹配，因此出現(xiàn)這種或那種營養(yǎng)物的相對不足，而成為限制型因子，生產(chǎn)實(shí)踐中，找出該限制因子是提高生物效果的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。第五十七頁，共九十八頁。①稀釋(xīshì)率第五十八頁，共九十八頁。②稀釋(xīshì)率的影響在恒化器中，由于稀釋率大小不僅直接決定限制性因子濃度的多少而且有一沖淡的作用，細(xì)菌群體數(shù)目的凈變化是細(xì)菌生長所引起的細(xì)胞數(shù)目增加(zēngjiā)與連續(xù)流入的新培養(yǎng)基稀釋帶出細(xì)菌引起的細(xì)胞數(shù)目減少的總增量。細(xì)菌(xìjūn)隨排出液排出，細(xì)菌(xìjūn)量減少細(xì)菌生長，細(xì)菌量增加第五十九頁，共九十八頁。稀釋率的大小對細(xì)菌菌體生長的影響可以分為以下幾種(jǐzhǒnɡ)情況（如圖中所示）第六十頁，共九十八頁。Ⅰ.當(dāng)稀釋(xīshì)率高于細(xì)菌的最大生長速率稀釋率很高時，進(jìn)料流速太高，A點(diǎn)位置后，菌體數(shù)目在最大生長速率時的增加低于因稀釋作用而使菌體數(shù)目減少的速率，則反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量持續(xù)減少，最終容器中的細(xì)菌被流加的新培養(yǎng)基完全洗去。這一原理，常被用于特殊菌的篩選，當(dāng)容器中有幾種細(xì)菌時，在容器培養(yǎng)基環(huán)境中比較而言生長速率最大的細(xì)菌，隨著稀釋率的升高，必然是最后被洗出。例如為篩選能降解丙烯腈的細(xì)菌，我們(wǒmen)可以先使培養(yǎng)基中唯一的碳源是丙烯腈，繼而向容器中加入足夠數(shù)量有潛在可能降解丙烯腈的混合細(xì)菌，逐步提高稀釋率，此時完全不能利用丙烯腈生長的細(xì)菌由于生長速率最低，將首先被洗出，繼而是能微弱利用丙烯腈的細(xì)菌，最后是能較好地利用丙烯腈的細(xì)菌，這樣最后被洗出的細(xì)菌就可以被用于丙烯腈廢水的生物降解工作中。第六十一頁，共九十八頁。Ⅱ.當(dāng)稀釋(xīshì)率小于細(xì)菌的最大生長速率稀釋率太低時，A點(diǎn)以前，營養(yǎng)物的供給總量不足，細(xì)菌不能以最大生長速率繁殖，但細(xì)菌通過限制繁殖分裂的頻率即代時，維持一個較對數(shù)期低的代時，這時反應(yīng)器中的基質(zhì)濃度維持不變，其中限制因子濃度保持不變，該濃度的大小就成為細(xì)菌數(shù)量變化的唯一制約因素，細(xì)菌數(shù)量將達(dá)到該濃度許可的最大量，由于細(xì)菌消耗營養(yǎng)物的成比例關(guān)系，基質(zhì)中的濃度必然降到限制性營養(yǎng)因子耗盡時的平衡濃度，隨著稀釋率的提高(tígāo)，細(xì)菌的代時由于生存條件的改善提高(tígāo)，由于稀釋率升高營養(yǎng)物流入反應(yīng)器的重量增加而引起的細(xì)菌總量的提高部分全部從反應(yīng)器中隨流出液帶出，反應(yīng)器中的基質(zhì)濃度與細(xì)菌的數(shù)量繼續(xù)維持恒定，細(xì)菌生理趨向于對數(shù)期的最大生長速率。第六十二頁，共九十八頁。Ⅲ.當(dāng)稀釋(xīshì)率等于細(xì)菌的最大生長速率即A點(diǎn)位置，此時細(xì)菌的代時縮短到受自身遺傳因素限制的最短時間，即對數(shù)期的代時，反應(yīng)器中的細(xì)菌數(shù)目繼續(xù)維持在限制性營養(yǎng)物濃度耗盡時的細(xì)菌最大數(shù)量并保持恒定(héngdìng)。恒化反應(yīng)器中細(xì)菌生長的規(guī)律提示我們，從盡可能地提高生物量的角度出發(fā)，廢水的生物處理中，一定要調(diào)查清楚廢水中的限制性因子是什麼，并設(shè)法改善，這樣才可以在同樣廢水狀態(tài)下，進(jìn)一步的提高進(jìn)水量，提高處理能力并保持細(xì)菌較高的數(shù)量和良好的處理效果。這對于挖潛增效，有著十分重要的指導(dǎo)意義。

第六十三頁，共九十八頁。第二節(jié)細(xì)菌(xìjūn)的遺傳與變異所謂細(xì)菌的遺傳性是指每種細(xì)菌所具備的親代性狀在子代重現(xiàn)(zhònɡxiàn)，子代性狀與親代基本上一致的現(xiàn)象。1.遺傳的保守性遺傳的作用在于保持生物物種的存在和延續(xù)，并保持物種的相對穩(wěn)定性。遺傳引起的親代與子代嚴(yán)格的相似性，稱為遺傳的保守性。第六十四頁，共九十八頁。例大腸桿菌是短桿菌，生活條件要求pH為7．2，溫度37℃，在糖類物質(zhì)存在的條件下產(chǎn)酸、產(chǎn)氣。大腸桿菌的親代將這些特性傳給子代，這就是大腸桿菌遺傳的保守性，其他生物也是如此。遺傳的保守性程度即親代與子代的相似程度與物種差異和個體(gètǐ)生長狀態(tài)不同有關(guān)，高等生物遺傳保守程度比低等生物大。老齡菌遺傳保守程度比幼齡菌大（這與老年人思想比年輕人保守倒是十分相似）。細(xì)菌遺傳的保守性既有有利的一面也有不利的一面，當(dāng)環(huán)境條件改變，細(xì)菌會因?yàn)檫z傳的保守性，不適應(yīng)改變了的外界環(huán)境條件而死亡。第六十五頁，共九十八頁。2.變異(biànyì)的多樣性任何一種生物的親代和子代以及個體之間，在形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理機(jī)能方面都有所差異，這一現(xiàn)象叫做變異。變異是生物對環(huán)境能動適應(yīng)性的表現(xiàn)。在新的生活條件下細(xì)菌基因突變，有些突變會產(chǎn)生適應(yīng)新環(huán)境的酶(適應(yīng)酶)，從而適應(yīng)新環(huán)境并生長良好，基因突變是變異的分子本質(zhì)。內(nèi)在的變化必然帶來外在的變化，細(xì)菌變異外在表現(xiàn)形式很多，例如：個體形態(tài)的變化，菌落(jūnluò)形態(tài)(光滑型／粗糙型)的變異，營養(yǎng)要求的變異，對溫度、pH要求的變異，毒性的變異，抗毒能力的變異，生理生化特性的變異及代謝途徑、產(chǎn)物的變異等。第六十六頁，共九十八頁。3.遺傳(yíchuán)與變異的辯證關(guān)系遺傳與變異是所有生物包括細(xì)菌最基本的屬性，兩者相輔相成，相互依存，遺傳中有變異，變異中有遺傳，遺傳是相對的，變異是絕對的，有些變異了的形態(tài)(xíngtài)或性狀，又會以相對穩(wěn)定的形式遺傳下去，但是并非一切變異都具有遺傳性。第六十七頁，共九十八頁。4．遺傳與變異的分子(fēnzǐ)機(jī)制與其他生物一樣，細(xì)菌的遺傳變異是由生物遺傳物質(zhì)DNA所決定的，有關(guān)DNA的生化知識我們在生物化學(xué)課中已作了詳細(xì)介紹，此處只作一簡單回顧。DNA是幾乎所有生物的遺傳物質(zhì)，基因是DNA上指導(dǎo)細(xì)菌蛋白質(zhì)以及RNA合成的DNA片段；DNA以及基因是由許許多多的核苷酸脫水(tuōshuǐ)通過磷酸二脂鍵相互連接而成的核苷酸聚合物，形成DNA的核苷酸主要有四種，即腺嘌呤（A）、鳥嘌呤（G）、胸腺嘧啶（C）、胞嘧啶（T）。這四種核苷酸，每三個為一組的不同組合順序分別對應(yīng)于特定的氨基酸，這樣在DNA通過RNA間接指導(dǎo)細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成時，細(xì)菌DNA的特定核苷酸排列形式就反映在細(xì)菌蛋白質(zhì)的特定氨基酸結(jié)構(gòu)中。第六十八頁，共九十八頁。我們知道蛋白質(zhì)的氨基酸結(jié)構(gòu)決定了蛋白質(zhì)的功能，蛋白質(zhì)的功能體現(xiàn)在催化細(xì)菌的一切生化反應(yīng)，組成細(xì)胞結(jié)構(gòu)等方面，蛋白質(zhì)實(shí)際上對細(xì)菌生理起決定性的作用。由此不同細(xì)菌的不同DNA組成就間接決定了細(xì)菌的一切。DNA通過復(fù)制而將一模一樣的DNA傳給后代，這樣DNA在復(fù)制并傳遞給下一代的穩(wěn)定性，就體現(xiàn)為子代與親代在各方面的相似性，也就是遺傳的保守性。而子代細(xì)菌DNA組成上變異則必然(bìrán)引起子代功能與親代的差異，也就是變異性。

第六十九頁，共九十八頁。

決定

決定（1）DNA蛋白質(zhì)細(xì)菌的幾乎一切

復(fù)制（2）親代DNA子代DNA

決定（3）復(fù)制傳遞的穩(wěn)定性遺傳的保守(bǎoshǒu)性

決定（4）子代DNA的變異變異的多樣性第七十頁，共九十八頁。5．細(xì)菌的選育(xuǎnyù)與細(xì)菌的變異廢水生物處理中起決定性作用的自然是具有高效(ɡāoxiào)廢物降解能力的微生物（主要是細(xì)菌），這些微生物菌種通常都是通過對自然界微生物的篩選與定向培育獲得。細(xì)菌及其它微生物的篩選與定向培育就稱為選育。細(xì)菌在自然界是混居的，從中挑選出符合我們需要的細(xì)菌就是細(xì)菌的篩選，一般而言篩選出來的細(xì)菌性能還不是十分理想，通常還需要定向培育，即通過有計(jì)劃、有目的地控制微生物生長條件，改變細(xì)菌遺傳性，使其變異為我們需要的理想的廢物降解菌。第七十一頁，共九十八頁。在水的生物處理中，這種定向培育過程通常又稱為馴化。馴化方法的分子機(jī)制有兩種，一種是誘導(dǎo)細(xì)菌處于(chǔyú)休眠狀態(tài)的功能基因復(fù)蘇，產(chǎn)生相應(yīng)得酶；另一種是改變細(xì)菌的基因；后一種又分為兩條途徑，第一條是利用細(xì)菌的基因突變，另一條則是人為對細(xì)菌進(jìn)行基因重組改造。這里重點(diǎn)介紹細(xì)菌基因改造的馴化方法，我們首先介紹一下細(xì)菌的篩選，它是馴化工作的第一步。第七十二頁，共九十八頁。(1)細(xì)菌的篩選(shāixuǎn)方法細(xì)菌的篩選方法原理是適者生存原理，利用選擇性培養(yǎng)基從混雜的各種細(xì)菌中單獨(dú)培養(yǎng)出能滿足特殊需要的天然細(xì)菌。通常的篩選都是通過人為篩選與天然篩選相結(jié)合來進(jìn)行的。例如篩選能降解石油的細(xì)菌。在長期被石油污染的土壤里，適應(yīng)石油環(huán)境利用石油作為食物的細(xì)菌必然被天然篩選了出來，我們收集這種土壤樣品在實(shí)驗(yàn)室用石油降解菌選擇性培養(yǎng)基，對樣品中的石油降解菌進(jìn)行進(jìn)一步的選擇培養(yǎng)，篩選，富集，為下一步的馴化工作(gōngzuò)奠定基礎(chǔ)。第七十三頁，共九十八頁。（2）細(xì)菌(xìjūn)的馴化①誘導(dǎo)法誘導(dǎo)法通過以毒性底物為培養(yǎng)基中的唯一碳源，并逐漸提高其濃度，促使細(xì)菌由于這種底物的長期缺乏而休眠的基因恢復(fù)活性，產(chǎn)生相應(yīng)的降解酶，從而恢復(fù)對毒性底物降解的能力(nénglì)。這種方法主要常用于有機(jī)毒物降解菌的馴化。優(yōu)點(diǎn)是操作簡便，因而使用較為普遍，但由于受到細(xì)菌固有能力的限制，馴化的潛力有限。第七十四頁，共九十八頁。②基因突變(jīyīntūbiàn)法能動地利用細(xì)菌基因突變原理進(jìn)行(jìnxíng)細(xì)菌馴化的方法就是基因突變法。細(xì)菌的基因突變是細(xì)菌基因中的堿基組成、順序的突然改變。能造成這種改變的因素很多，如因溫度、紫外線、核輻射、酸、堿、人工誘變劑等自然和人為的因素，他們會造成DNA堿基丟失或DNA復(fù)制出現(xiàn)錯配或DNA修復(fù)時出現(xiàn)差錯，這些將引起基因突變，基因突變有這樣幾個特點(diǎn)。第七十五頁，共九十八頁。A．基因突變(jīyīntūbiàn)的特點(diǎn)Ⅰ.無定向性

無定向性是指突變的發(fā)生沒有固定的方向。如在紫外線作用下，除產(chǎn)生抗紫外線的突變體外，還可誘發(fā)任何其他性狀的變異。其他誘變因子也是一樣，這樣突變體發(fā)生后，既可能造成細(xì)菌的死亡，也可能使細(xì)菌獲得了更適應(yīng)環(huán)境的能力，沒有特定的方向。對環(huán)境的適應(yīng)程度將決定突變后的細(xì)菌能否生存、繁殖。Ⅱ.稀有性突變發(fā)生的頻率很低，即稀有性。突變率是指每一細(xì)胞在每一世代(shìdài)中發(fā)生某一性狀突變的機(jī)率，通常為10—5~10-10。也就是說十萬至一百億個細(xì)菌中產(chǎn)可能有一個細(xì)菌的基因發(fā)生突變。Ⅲ.自發(fā)性細(xì)菌基因突變的發(fā)生可以在沒有人為誘變因素的處理下自然發(fā)生。第七十六頁，共九十八頁。Ⅳ.獨(dú)立性某一基因的突變，既不提高也不降低其他任何基因的突變率，說明基因突變不僅對某一個細(xì)胞是隨機(jī)的，而且對某一基因也是隨機(jī)的。Ⅴ.穩(wěn)定性穩(wěn)定性是指由于突變的根源是遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)上發(fā)生了穩(wěn)定的變化，所以產(chǎn)生的新的變異性狀也是穩(wěn)定的、可遺傳的。Ⅵ.可逆性突變可以由原始的野生型向突變型方向進(jìn)行，稱正向突變。也可以反過來，由突變型向野生型的轉(zhuǎn)變，稱回復(fù)突變。Ⅶ.誘變性自發(fā)突變的發(fā)生頻率很低，但是(dànshì)通過人為施加誘變劑處理后突變率可大大提高，一般可提高10～105倍。這是人工誘變情況下的基因突變特點(diǎn)突變利用基因突變的特點(diǎn)，人們通常通過人工誘變進(jìn)行細(xì)菌的基因改造。第七十七頁，共九十八頁。B．誘變(yòubiàn)人為地利用物理化學(xué)因素，引起細(xì)胞DNA分子中堿基對發(fā)生變化叫誘變。所利用的物理化學(xué)因素稱為誘變劑。常用的誘變劑有紫外線、5—溴尿嘧啶、亞硝酸、卟啶染料等。誘變的步驟為Ⅰ.制出發(fā)菌株的單細(xì)胞懸浮液為了使出發(fā)菌株均勻(jūnyún)的接觸誘變劑，應(yīng)向細(xì)菌培養(yǎng)液中加入玻璃珠，并保持在誘變過程中始終進(jìn)行振蕩攪拌形成出發(fā)細(xì)菌的單細(xì)胞懸浮液；第七十八頁，共九十八頁。Ⅱ.選擇合適的誘變劑劑量進(jìn)行誘變誘變劑對細(xì)菌而言都是毒藥，量太少起不到誘變作用，量太大則會完全殺死細(xì)菌，因此每一種誘變劑在使用時都有一定(yīdìng)的最佳劑量。例如在進(jìn)行細(xì)菌紫外誘變時，通常使用15或20W的紫外燈距離細(xì)菌單細(xì)胞懸浮液15~30cm，照射15~20min。Ⅲ.篩選利用特制的選擇性培養(yǎng)基再從各種突變體中篩選出我們需要的突變體，并進(jìn)行富集培養(yǎng)。至此誘變的任務(wù)就算完成了，獲得了理想的菌種，這種方法的潛力要遠(yuǎn)大于誘導(dǎo)法，但操作復(fù)雜，在實(shí)際誘變中，往往要經(jīng)過幾次不同誘變方法的誘變處理以及大量繁瑣的篩選分離工作才有可能獲得理想的突變體。最后這些突變體將會在實(shí)驗(yàn)室小試、中試的基礎(chǔ)上被投放到生產(chǎn)實(shí)踐中。第七十九頁，共九十八頁。通常生產(chǎn)上更多利用的是細(xì)菌的自發(fā)誘導(dǎo)與突變，而不采用基因誘變，如馴化活性污泥及生物膜的方法，一般是把培養(yǎng)、選擇、淘汰結(jié)合在一起，在特定廢水中有些菌種不能適應(yīng)被淘汰，能產(chǎn)生誘導(dǎo)酶的菌株及自發(fā)突變體中能來降解此類廢水的菌種能夠生存而被保留下來，同時大量繁殖，使廢水達(dá)到預(yù)期的排放標(biāo)準(zhǔn)；另一方面，國外目前正在研究針對某種廢水用人工誘變方法篩選大量具有很強(qiáng)分解能力及絮凝能力的菌株，并把它們做成干粉狀的產(chǎn)品，如同市面出售的酵母干粉一樣，這時細(xì)菌處于休眠狀態(tài)。當(dāng)工廠處理(chǔlǐ)此類廢水時，可把干粉狀菌種置于30℃水中溶解30min，使細(xì)菌恢復(fù)活性，不必再馴化，對所需處理的廢水有較好效果。第八十頁，共九十八頁。③基因(jīyīn)重組法A.定義基因重組法是利用人工手段，將供體細(xì)胞DNA融合入另一個細(xì)胞(xìbāo)的DNA中，使受體細(xì)胞基因重新排列，并出現(xiàn)植入DNA基因?qū)?yīng)生物特性的細(xì)胞改造方法?；蛑亟M是兩種DNA的拼接，不發(fā)生任何堿基對結(jié)構(gòu)上的變化。這是與基因突變最大的不同之處。B．重組形式基因重組同樣有自發(fā)的基因重組與人工的基因重組之分，二者的原理本質(zhì)上是完全相同的。微生物中基因重組的形式很多。在真核微生物中，基因重組是通過二個配子相互融合的有性繁殖的過程中發(fā)生的，故稱為雜交。在細(xì)菌等原核微生物中通常只是部分遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移和重組，如轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合等都是基因重組在細(xì)胞水平上的反映。第八十一頁，共九十八頁。Ⅰ.轉(zhuǎn)化(zhuǎnhuà)轉(zhuǎn)化(Transformation)是供體細(xì)胞研碎物中的DNA片段直接吸收進(jìn)入(jìnrù)活的受體細(xì)胞的基因重組方式。受體細(xì)胞獲得了供體細(xì)胞的部分遺傳性狀。轉(zhuǎn)化現(xiàn)象是1928年英國的細(xì)菌學(xué)家格里菲斯首先發(fā)現(xiàn)的。為紀(jì)念格里菲思先生當(dāng)時發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象的實(shí)驗(yàn)被命名為格里菲斯實(shí)驗(yàn)。第八十二頁，共九十八頁。格里菲斯實(shí)驗(yàn)(shíyàn)第八十三頁，共九十八頁。1928年英國細(xì)菌學(xué)家格里菲斯(Grifftll)發(fā)現(xiàn)肺炎雙球菌中SⅢ型菌株，菌落光滑，產(chǎn)生(chǎnshēng)莢膜，當(dāng)它感染人、小白鼠或家免等時均可致病。其中RⅡ型菌株菌落粗糙，不產(chǎn)生莢膜物質(zhì)，感染人、小白鼠或家免均不致病。當(dāng)將RⅡ型活菌注射小白鼠，小白鼠健康不致病，并可從健康的鼠體分離到RⅡ型肺炎雙球菌菌落；將SⅢ型的肺炎雙球菌注射小白鼠，小白鼠被殺死，從小鼠體內(nèi)會分離出SⅢ型的肺炎雙球菌；將加熱殺死的SⅢ型細(xì)菌破碎細(xì)胞注射入小鼠細(xì)胞，小白鼠健康不致病，小鼠體內(nèi)沒有SⅢ型細(xì)菌；將加熱殺死的SⅢ型細(xì)菌與RⅡ型活細(xì)菌混合后注射小白鼠，小白鼠死亡，并可從死鼠體內(nèi)分離到SⅢ型活細(xì)菌。當(dāng)時雖然發(fā)現(xiàn)了這一有趣的現(xiàn)象，但并不知道其中的原因。第八十四頁，共九十八頁。1944年才通過試驗(yàn)找出了其中的原因(yuányīn)。試驗(yàn)方法如下：第八十五頁，共九十八頁。細(xì)菌轉(zhuǎn)化過程可大體分為以下幾步：感受態(tài)細(xì)胞(xìbāo)的出現(xiàn)吸附外源DNA片段外源DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)受體DNA解鏈形成受體DNA—供體DNA復(fù)合物

DNA復(fù)制和分離其中感受態(tài)細(xì)胞的出現(xiàn)是關(guān)鍵。所謂感受態(tài)細(xì)胞是能吸收外來的DNA片段，并能把它整合到自己的染色體組上以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。感受態(tài)細(xì)胞是由遺傳性決定的，也受細(xì)胞的生理狀態(tài)、菌齡、培養(yǎng)條件的影響。目前發(fā)現(xiàn)自然狀態(tài)下許多其它細(xì)菌、放線菌、真菌和高等動植物中都也有轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。第八十六頁，共九十八頁。Ⅱ.接合

細(xì)菌的接合是細(xì)菌遺傳物質(zhì)染色體DNA片段或質(zhì)粒DNA通過細(xì)菌與細(xì)菌的直接接觸而進(jìn)行的轉(zhuǎn)移和重組的現(xiàn)象。在第一章細(xì)菌的繁殖一節(jié)中，細(xì)菌的有性繁殖實(shí)際上就是這里(zhèlǐ)所說的結(jié)合，有關(guān)內(nèi)容在此不再重復(fù)。Ⅲ.轉(zhuǎn)導(dǎo)

遺傳物質(zhì)通過噬菌體的攜帶而轉(zhuǎn)移的基因重組現(xiàn)象(xiànxiàng)稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。轉(zhuǎn)導(dǎo)是1951年辛德爾(Zinder)和萊德貝爾格(1Jederberg)在研究鼠沙門氏傷寒桿菌重組時發(fā)現(xiàn)的。第八十七頁，共九十八頁。第八十八頁，共九十八頁。實(shí)驗(yàn)中L-22細(xì)菌這一側(cè)出現(xiàn)（A+B+）菌，L-22菌是如何獲得色氨酸合成功能的呢？研究發(fā)現(xiàn)LA—22在培養(yǎng)過程釋放溫和的噬菌體P—22，P—22通過濾板侵染供體LA—2，當(dāng)LA—2裂解后，產(chǎn)生“濾過因子”大部分是P—22，其中極少數(shù)在成熟過程包裹了LA—2的DNA片段(含合成色氨酸的基因)，并通過濾板再度感染LA—22，使LA—22獲得合成Tru—能力，由噬菌體攜帶來的DNA片段與受體細(xì)胞的基因重組，這個現(xiàn)象稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(有關(guān)溫和噬菌體的內(nèi)容(nèiróng)將在第四章病毒中介紹)。

基因重組的3種形式，其中細(xì)菌的接合必需兩個細(xì)胞直接接觸，而轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)無需細(xì)胞直接接觸，轉(zhuǎn)化沒有噬菌體作媒介；轉(zhuǎn)導(dǎo)必須通過噬菌體轉(zhuǎn)移