蛋白質(zhì)學(xué)分析技術(shù)5課件

發(fā)育生物學(xué)科教研室第五章:酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)教師:藍(lán)興國蛋白組學(xué)分析技術(shù)課程之日期:2014.6.酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）5.1ELISA的概念；5.2ELISA相關(guān)的理論知識；5.3ELISA的類型；5.4ELISA的步驟及考慮因素；5.5ELISA的應(yīng)用5.1ELISA的概念：酶聯(lián)免疫吸附分析（Enzyme-linkerImmunosorbentAssay,ELISA）：它是一種特殊的試劑分析方法，是在免疫技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術(shù)。原理：它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)，將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。5.2ELISA相關(guān)的理論知識：5.3ELISA的類型：

直接ELISA間接ELISA夾心ELISAELISA板（固相載體）：聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學(xué)活性。良好的ELISA板：1）吸附性能好，空白值低，孔底透明度高；2）各板之間、同一板各孔之間性能相近。96孔ELISA板（不可拆）96孔ELISA板（可拆）384孔ELISA板（一）包被（Coating）：包被：將抗原或抗體固定化在ELISA板的過程。原理：蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。大分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。**抗原、抗體的包被A、包被的緩沖液（CoatingBuffer）pH9.6碳酸鹽緩沖液(50mM)pH7.2磷酸鹽緩沖液(10mM)pH8.5Tris-HCl緩沖液(20mM)**抗原、抗體、多糖類等B、包被的濃度（Concentration）

濃度范圍：1-10μg/mL（50μL）飽和濃度：50-500ng，1-10mg/mL（50μL）

（二）洗滌：在包被抗體或抗原完成后，一般需要洗滌3-4次，將未結(jié)合在ELISA板上的抗體或抗原洗掉。在板式ELISA中，常用的洗液為PBS磷酸鹽緩沖液（0.1M，pH7.4）。去污劑，如Tween-20（0.05%）。形式：手工和自動（三）封閉（Blocking）：封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。封閉目的是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥后面步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。常用封閉劑：

0.5

%-2

%的BSA

0.5

%-5

%的脫脂奶粉（五）酶、底物和生色物質(zhì)：HRP,HorseradishPeroxidase,辣根過氧化物酶AP,AlkalinePhosphatase,堿性磷酸酶Hydrogenperoxide,過氧化氫;Chromophore發(fā)色團(tuán);citrate,檸檬酸鹽;Diethanolamine二乙醇胺;magnesiumchloride,氯化鎂OPD鄰苯二胺ABTS2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽TMB3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺5-AS5-氨基水楊酸pnpp對硝基苯磷酸酯（六）顯色：顯色：ELISA最好一步溫育反應(yīng)，酶催化無色的底物生成有色的底物。TMB：室溫下進(jìn)行30分鐘；受光照影響不大，顯色后加入終止液。OPD：室溫或37℃反應(yīng)20-30分鐘；OPD底物液應(yīng)避光進(jìn)行，顯色后加入終止液。（八）讀板與分析：酶標(biāo)儀：也叫酶標(biāo)比色儀，通常用于測讀ELISA結(jié)果吸光度的光度計(jì)。指標(biāo)：測讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精密度。（八）讀板與分析：5.5ELISA的應(yīng)用：敏感性（檢測線可達(dá)ng或pg級）特異性操作性標(biāo)準(zhǔn)化5.5ELISA的應(yīng)用：免疫學(xué)（單克隆抗體篩選、抗體滴度）臨床醫(yī)學(xué)（腫瘤標(biāo)志物、產(chǎn)前診斷、病毒檢測）食品分析（黃曲霉素M1）其它方面進(jìn)一步閱讀：JohnR.Crowther,MethodsinMo