霍亂弧菌實驗室檢測課件

霍亂弧菌的實驗室檢測

目的:提高檢出率,減少漏檢以及誤判的發(fā)生手段:檢測人員是否有足夠的責任心?檢測試劑準備是否齊全且符合要求?是否嚴格按照檢測流程進行操作?

什么是霍亂?

霍亂是由01群和0139群霍亂弧菌（V．cholerae）引起的急性腸道傳染病，發(fā)病急、傳播速度快、波及范圍廣、危害嚴重的甲類傳染病。霍亂概述古典生物型小川型Ogawa(AB)O1群稻葉型Inaba(AC)埃爾托生物型彥島型Hikojim(ABC)霍亂弧菌霍亂病原菌O139群（Bengal）非O1群O2-O200群腹瀉病原菌

霍亂的實驗室檢測

樣品的采集和運輸不同樣品的病原分離流程及技術要點

糞便

水體

水產(chǎn)品，食品等平板分離及可疑菌落挑取菌落鑒定常用快速檢測方法

膠體金檢測條

熒光PCR檢測檢測工作中應關注的事項

樣品的采集和運輸采集：

病例：糞便、肛拭子、嘔吐物未使用抗生素之前“健康”人：糞便、肛拭子其他傳播環(huán)節(jié)的標本：食物、水、環(huán)境類樣品……

監(jiān)測：水樣，水產(chǎn)品等運輸：一般要求在3小時內(nèi)室溫（20-25℃）條件下送達實驗室檢測

C-B運輸培養(yǎng)基（pH8.4）;（或文臘二氏保存液）

堿性蛋白胨水（pH8.4-9.2）

：不是最佳的，尤其6小時內(nèi)還不能進行培養(yǎng)時，盡量采用C-B運輸培養(yǎng)基。糞便的采集與保存運送

以采集病人自然排除的新鮮糞便為主，水樣便采取1～3mL，成形便采取指甲大小的糞量，亦可用直腸棉拭或采便管由肛門插入直腸內(nèi)3～5cm處采取，采集后的樣品應盡快挑取接種于堿性蛋白胨水（ＰＨ8.６-9.2），同時劃線分離選擇性培養(yǎng)基（慶大／四號／ＴＣＢＳ平板），如不能在６小時內(nèi)送達實驗室檢測的樣品，應插入Cary-Blair二氏半固體保存培養(yǎng)基（或文臘二氏保存液）中送檢。標本與保存液比例約為1∶5。分離培養(yǎng)要點（兩管三板法）：

挑取糞便，直接接種于堿性蛋白胨水（第一管）中，同時劃線分離選擇性平板（慶大／四號／ＴＣＢＳ平板，第一板）。

第一管堿性蛋白胨水在３７℃增菌６－８小時，沾取菌膜下表層液體，劃線分離選擇性平板（慶大／四號／ＴＣＢＳ平板，第二板），同時吸取0.1～0.2ml表層培養(yǎng)物，接種堿性蛋白胨水（第二管）。

第二管堿性蛋白胨水增菌１８小時后劃線分離選擇性平板（慶大／四號／ＴＣＢＳ平板，第三板）。

糞便分離流程及技術要點水體的采集與保存運送

水體的采集一般用無菌的500ml水樣瓶采集相對靜止的表層水(深度為30cm以內(nèi))500ml，密封加蓋后于室溫（20-25℃）3小時內(nèi)送達實驗室檢測。分離培養(yǎng)要點（十倍濃縮堿胨水增菌培養(yǎng)法）：

取450ml水樣，用1M氫氧化鈉調(diào)整至pH8.4-9.2。然后加10倍濃縮堿性胨水50ml。再加入1%亞碲酸鉀0.25～0.5ml和1000單位/ml青霉素1ml。37℃培養(yǎng)過夜，取菌膜下表層培養(yǎng)物接種選擇性培養(yǎng)基（慶大／四號／ＴＣＢＳ平板）分離培養(yǎng)，同時吸0.1～0.2ml表層培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于堿性胨水管中作二次增菌，37℃培養(yǎng)6～8h再劃線接種于選擇性培養(yǎng)基（慶大／四號／ＴＣＢＳ平板）。

水體分離流程及技術要點O1群和O139群抗原構(gòu)造與血清分型型別群特異性抗原型特異性抗原AO139BC小川+++少量稻葉+—+彥島+++O139—+——國內(nèi)商品化的霍亂檢測血清國外血清：日本生研，泰國S&A血清等進一步實驗氧化酶試驗1％鹽酸對氨基二甲基苯胺或鹽酸二甲基對苯二胺水溶液粘絲試驗0.5％去氧膽酸鈉水溶液

生化鑒定

生化鑒定管：發(fā)酵葡萄糖、甘露醇、蔗糖、產(chǎn)酸不產(chǎn)氣能分解色氨酸賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶（+）精氨酸雙水解酶（-）

霍亂弧菌生化鑒定管（11種生化,套裝，環(huán)凱）；

生化鑒定條：梅里埃API20E鑒定條等全自動生化檢測儀檢測：梅里埃VITEK2COMP全自動生化鑒定卡等進一步分型鑒定(省CDC進行)

噬菌體分型

PFGE脈沖場分型

進一步實驗針對原始樣品（如病人糞便）以及初始增菌后的菌液進行快速檢測膠體金快速檢測卡

O1群霍亂膠體金標記快診卡

O139群霍亂膠體金標記快診卡熒光PCR快速檢測試劑盒

O1群、O139群雙色熒光檢測試劑盒

霍亂CTX毒力基因熒光檢測試劑盒注：快速檢測并不能替代常規(guī)檢測的進行，只是作為輔助檢測的一種手段霍亂快速檢測技術的應用

熒光PCR檢測霍亂弧菌病例標本檢測環(huán)境和食品調(diào)查的初篩方法O1群、O139群雙色熒光檢測試劑盒深圳生科源生物技術有限公司O1群和O139群霍亂弧菌的檢驗程序鑒定分型確診報告