10%2B細(xì)菌的生理生化反應(yīng)幻燈片

實(shí)驗(yàn)十細(xì)菌的生理生化反應(yīng)

一、

目的1.1

了解細(xì)菌鑒定中常用的生理生化試驗(yàn)反應(yīng)原理1.2

掌握測定細(xì)菌生理生化反應(yīng)的技術(shù)和方法

二、

原理

各種微生物在代謝類型上表現(xiàn)了很大的差異。不同微生物因具有不同的酶系統(tǒng)，分解利用糖類、脂肪類和蛋白類物質(zhì)的能力不同，其發(fā)酵的類型和產(chǎn)物也不相同。細(xì)菌的生理生化反應(yīng)在菌株的分類鑒定中有很大作用。

三、

材料3.1

菌種大腸桿菌（Escherichia

coli）產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter

aerogenes）普通變形桿菌（Proteus

vulgaris）枯草芽孢桿菌（Bacillus

subtilis）的斜面菌種

3.2

培養(yǎng)基

糖發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖、乳糖）、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基、H2S試驗(yàn)培養(yǎng)基、檸檬酸鹽培養(yǎng)基

3.3

試劑

V.P試劑、甲基紅試劑、吲哚試劑、乙醚、1.6%溴甲酚紫指示劑、碘液。

3.4

器具

恒溫培養(yǎng)箱、試管、移液管、杜氏小管。四、步驟(一)

糖類發(fā)酵試驗(yàn)（二）

乙酰甲基甲醇試驗(yàn)(V．P試驗(yàn))（三）

甲基紅試驗(yàn)（M.R.試驗(yàn)）（四）吲哚試驗(yàn)（五）檸檬酸鹽試驗(yàn)（六）硫化氫試驗(yàn)（七）淀粉水解試驗(yàn)與對照管比較，若接種培養(yǎng)液保持原有顏色，其反應(yīng)結(jié)果為陰性，表明該菌不能利用該種糖，記錄用“－”表示；如培養(yǎng)液呈黃色，反應(yīng)結(jié)果為陽性，表明該菌能分解該種糖產(chǎn)酸，記錄用“＋”表示。培養(yǎng)液中的杜氏小管內(nèi)有氣泡為陽性反應(yīng)，表明該菌分解糖能產(chǎn)酸并產(chǎn)氣，記錄用“＋”表示；如杜氏小管內(nèi)沒有氣泡為陰性反應(yīng)，記錄用“－”表示。結(jié)果觀察（二）

乙酰甲基甲醇試驗(yàn)(V．P試驗(yàn))

原理

某些細(xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)液中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱V.P（+）反應(yīng)。

材料

菌種:大腸桿菌（Escherichia

coli）、產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter

aerogenes）

培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)液

步驟

1

標(biāo)記試管:取2支裝有葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管，分別標(biāo)記大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌。

2

接種培養(yǎng):以無菌操作分別接種少量菌苔至以上相應(yīng)試管中。置37℃恒溫箱中，培養(yǎng)24～48h。取出以上試管，振蕩2min。加入等量V.P試劑；振蕩試管，以使空氣中的氧溶入，置37℃恒溫箱中保溫15～30min。若培養(yǎng)液呈紅色，記錄為V.P.試驗(yàn)陽性反應(yīng)（用“＋”表示）；若不呈紅色，記錄為V.P.試驗(yàn)陰性反應(yīng)（用“－”表示）。結(jié)果觀察（三）

甲基紅試驗(yàn)（M.R.試驗(yàn)）原理

腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基pH值下降至pH4.2以下，使甲基紅指示劑變紅。

材料

菌種同V.P試驗(yàn)培養(yǎng)基同V.P試驗(yàn)步驟

同V.P試驗(yàn)1

標(biāo)記試管:取2支裝有葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管，分別標(biāo)記大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌。

2

接種培養(yǎng):以無菌操作分別接種少量菌苔至以上相應(yīng)試管中。置37℃恒溫箱中，培養(yǎng)24～48h。取出以上試管，各加入2～3滴甲基紅指示劑，注意沿管壁加入，仔細(xì)觀察培養(yǎng)液上層。若培養(yǎng)液上層變成紅色，即為陽性反應(yīng)，用“＋”表示；若仍呈黃色，則為陰性反應(yīng)，用“－”表示。結(jié)果觀察（四）吲哚試驗(yàn)原理:有些細(xì)菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚。吲哚本身沒有顏色，不能直接看見，但當(dāng)加入吲哚試劑（對二甲基氨基苯甲醛試劑）時，該試劑與吲哚作用，形成紅色的玫瑰吲哚。

材料菌種：同V．P試驗(yàn)

培養(yǎng)基：蛋白胨水培養(yǎng)基

試劑：二甲基氨基苯甲醛溶液、乙醚。

步驟

1

試管標(biāo)記:取裝有蛋白胨水培養(yǎng)液的試管2支，分別標(biāo)記大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌。

2

接種培養(yǎng):以無菌操作分別接種少量菌苔到以上相應(yīng)試管中，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48h。取出以上試管，在培養(yǎng)液中加入乙醚1～2ml，經(jīng)充分振蕩使吲哚萃取至乙醚中，靜置片刻后乙醚層浮于培養(yǎng)液的上面，此時沿管壁緩慢加入5～10滴吲哚試劑（加入吲哚試劑后切勿搖動試管，以防破壞乙醚層影響結(jié)果觀察）。如有吲哚存在，乙醚層呈現(xiàn)玫瑰紅色，此為吲哚試驗(yàn)陽性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)，陽性用“＋”、陰性用“－”表示。

結(jié)果觀察（五）檸檬酸鹽試驗(yàn)原理

有些細(xì)菌能夠利用檸檬酸鈉作為碳源，如產(chǎn)氣腸桿菌；而另一些細(xì)菌則不能利用檸檬酸鹽，如大腸桿菌。細(xì)菌在分解檸檬酸鹽后，產(chǎn)生堿性化合物，使培養(yǎng)基的pH升高，當(dāng)培養(yǎng)基中加入1%溴麝香草酚藍(lán)指示劑時，就會由綠色變?yōu)樯钏{(lán)色。（溴麝香草酚藍(lán)的指示范圍為：pH小于6.0時呈黃色，pH在6.0~7.6時為綠色，pH大于7.6時呈藍(lán)色。）材料菌種：同V．P試驗(yàn)

培養(yǎng)基：檸檬酸鹽培養(yǎng)基（固體斜面）步驟

1

試管標(biāo)記

取裝有檸檬酸鹽培養(yǎng)基固體斜面的試管2支，分別標(biāo)記大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌。

2

接種培養(yǎng)

以無菌操作分別接種少量菌苔到以上相應(yīng)試管斜面上做“之”字形劃線，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48h。結(jié)果觀察（六）硫化氫試驗(yàn)原理

有些細(xì)菌能分解含硫的有機(jī)物，如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等產(chǎn)生硫化氫，硫化氫一遇培養(yǎng)基中的鉛鹽或鐵鹽等，就形成黑色的硫化鉛或硫化鐵沉淀物。材料菌種：大腸桿菌、變形桿菌培養(yǎng)基：H2S試驗(yàn)培養(yǎng)基（固體）步驟

1

試管標(biāo)記:取裝有H2S試驗(yàn)固體培養(yǎng)基的試管2支，分別標(biāo)記大腸桿菌、變形桿菌。

2

接種培養(yǎng):以無菌操作分別用接種針挑取少量菌苔到以上相應(yīng)試管做穿刺接種，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48h。結(jié)果觀察（七）淀粉水解試驗(yàn)原理

有些細(xì)菌可產(chǎn)生淀粉酶水解培養(yǎng)中的淀粉為糊精，或進(jìn)一步水解為麥芽糖，淀粉水解后遇碘不再變藍(lán)。材料菌種：大腸桿菌、枯草桿菌培養(yǎng)基：淀粉培養(yǎng)基（固體）(pH值:7.2)配方:每升培養(yǎng)基含

蛋白胨:10g牛肉膏:5gNaCl:5g可溶性淀粉:2g瓊脂:20g（七）淀粉水解試驗(yàn)步驟

1

培養(yǎng)皿標(biāo)記

取裝有淀粉培養(yǎng)基（固體）的培養(yǎng)皿一只，在培養(yǎng)皿兩側(cè)分別標(biāo)記大腸桿菌、枯草桿菌。

2

接種培養(yǎng)

以無菌操作分別用接種環(huán)挑取少量菌苔到培養(yǎng)皿相應(yīng)部位做十字接種，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48h。結(jié)果觀察取出平板，加上少量碘液，輕輕搖動，使碘液鋪滿平板表面，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈及圈的大小。六實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析1配制培養(yǎng)基糖發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖、乳糖）葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基蛋白胨水培養(yǎng)基淀粉培養(yǎng)基色H2S試驗(yàn)培養(yǎng)基檸檬酸鹽培養(yǎng)

每組配制一種培養(yǎng)基,300mL.實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及分工,時間安排2灌裝試管糖發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖）--水培養(yǎng)液糖發(fā)酵培養(yǎng)基（乳糖）--水培養(yǎng)液葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基--水培養(yǎng)液蛋白胨水培養(yǎng)基---水培養(yǎng)液檸檬酸鹽培養(yǎng)（固體斜面）H2S試驗(yàn)培