第九章-發(fā)育毒性與致畸作用課件1

生殖毒理學(xué)生殖毒理學(xué)1內(nèi)容概述化學(xué)物生殖能力損傷機制化學(xué)物生殖能力損傷的檢測與評價內(nèi)容2第一節(jié)概述一、定義：生殖毒理學(xué)（reproductivetoxicology)主要研究環(huán)境化學(xué)物對生殖系統(tǒng)損害作用的原因、機制和后果。對生殖功能損害表現(xiàn)為：對性成熟、配子生成、性行為、生育力、妊娠、分娩和哺乳等的不良影響。第一節(jié)概述一、定義：生殖毒理學(xué)（reproductive3二、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物Environmentalendocrinedisruptors,EEDs,指環(huán)境中天然存在或污染的可模擬天然激素生理、生化作用，干擾或抑制生物體內(nèi)分泌、神經(jīng)或免疫系統(tǒng)功能，產(chǎn)生可逆或不可逆生物學(xué)效應(yīng)的化學(xué)物。二、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物Environmentalendocr4第二節(jié)、外源化學(xué)物對雄性生殖能力的損害作用與機制１、對下丘腦－垂體—睪丸軸雄性內(nèi)分泌功能的影響，表現(xiàn)為內(nèi)分泌器官的病理損害和性激素／促性激素水平改變２、對支持細胞的影響１）破壞支持細胞間和支持細胞與生殖細胞間連接，血－睪屏障受損以及生殖細胞丟失；２）破壞細胞骨架，導(dǎo)致生殖細胞輸送障礙，丟失；３）支持細胞空泡變性４）分裂異常５）代謝和信號傳導(dǎo)異常第二節(jié)、外源化學(xué)物對雄性生殖能力的損害作用與機制１、對下丘腦5３、對間質(zhì)細胞的影響增生／肥大、死亡４、對成熟精子的影響精子胞核ＤＮＡ損傷精子運動功能、受精力降低

３、對間質(zhì)細胞的影響6第三節(jié)、外源化學(xué)物對雌性生殖能力的損害作用與機制１、對下丘腦－垂體－卵巢軸雌性內(nèi)分泌功能的影響，表現(xiàn)為內(nèi)分泌器官的病理損害和性激素／促性激素水平改變；動情周期／月經(jīng)周期改變，排卵異常和性行為異常。２、配子／胚胎轉(zhuǎn)運異常３、卵巢毒性等。第三節(jié)、外源化學(xué)物對雌性生殖能力的損害作用與機制１、對下丘腦7第四節(jié)、外源化學(xué)物對生殖能力影響的檢測與評價目的和意義：

1、評價化學(xué)物對親代生殖系統(tǒng)和子代安全性

2、生殖毒性化學(xué)物的管理和中毒預(yù)防

3、優(yōu)生優(yōu)育提高人口素質(zhì)

第四節(jié)、外源化學(xué)物對生殖能力影響的檢測與評價目的和意義：8生殖毒性評價需四方面資料1、動物毒性試驗2、控制下的臨床研究3、環(huán)境流行病學(xué)資料4體外試驗第九章-發(fā)育毒性與致畸作用課件19一動物試驗

分為四個部分：

一般生殖毒性試驗致畸試驗圍產(chǎn)期毒性試驗繁殖實驗

第九章-發(fā)育毒性與致畸作用課件110‘（一）一般生殖毒性試驗

目的：評價化學(xué)毒物對生殖細胞（雌、雄）、胚胎、胎兒的影響（以下引自新藥臨床前研究指導(dǎo)原則匯編——藥學(xué)、藥理學(xué)、毒理學(xué)）

動物：多用大鼠，雌、雄各20只如必要可用家兔，避孕藥還需用猴子試驗。

劑量與給藥途徑：根據(jù)亞急性毒性試驗結(jié)果和毒代動力學(xué)試驗數(shù)據(jù)設(shè)定至少兩個劑量組，高劑量組可產(chǎn)生輕微毒性反應(yīng)，給藥途徑原則上與臨床擬用途徑同。

‘11給藥時間：交配前，雄60—80天，雌14天，連續(xù)給藥。雌動物交配后繼續(xù)給藥至多數(shù)器官形成期。大鼠器官形成期一般為：6-15d對照：陰性（溶劑）對照，也可設(shè)陽性對照觀察指標與報告：動物一般狀況、體重變化、受孕率、死胎數(shù)、活胎數(shù)、活胎重量、外觀和內(nèi)臟及骨骼變化，必要時做組織學(xué)檢查，統(tǒng)計處理，結(jié)果綜合分析第九章-發(fā)育毒性與致畸作用課件112（二）致畸試驗?zāi)康模侯A(yù)測環(huán)境有害物質(zhì)對人體的胚胎毒性及致畸性原理：母體在受孕期間受到可通過胎盤屏障的某種有害物質(zhì)作用，影響胚胎的器官分化與發(fā)育，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)和機能的缺陷，出現(xiàn)胎兒畸形。在受孕動物的胚胎著床后，并已開始進入細胞及器官分化期時投以受試物，可檢出該物質(zhì)對胎兒的致畸作用。動物：首選性成熟大鼠（Wistar或S.D)，80—90只，雌、雄各半，鼠齡90—100d，體重雄180g,雌150g（二）致畸試驗13動物也可用小鼠或家兔劑量分組：一般設(shè)四個組，一個空白對照，三個實驗組，必要時設(shè)陽性對照?？刹捎?/4、1/16、1/64LD50或以亞急性毒性試驗的最大無作用劑量為最高劑量組，其1/30左右為低劑量組，在中間設(shè)一組。

劑量設(shè)定原則：高劑量組應(yīng)有母體毒性，如攝食量減少、體重增長緩慢或下降，陰道流血、流產(chǎn)等。藥物可用最大給藥量，但限制劑量為1g/Kg。低劑量應(yīng)無母體毒性和胚胎反應(yīng)。動物也可用小鼠或家兔14給藥途徑：藥物擬用給藥途徑或灌胃、自由攝取，但不宜用腹腔注射。給藥時間：于胚胎器官形成期連續(xù)給藥。大鼠：孕后6-15天小鼠：孕后6-15天家兔：孕后6-18天對照：必須設(shè)溶劑對照，必要時設(shè)陽性對照?？晒┻x擇的陽性對照物有敵枯雙（0.5-1.0mg/kg體重），五氯酚納（30mg/kg/體重）阿斯匹林（250-300mg/kg）及維生素A(25000-40000IU)等.給藥途徑：藥物擬用給藥途徑或灌胃、自由攝取，但不宜用腹腔注射15觀察與檢查：妊娠零天（判定方法）開始，記錄實驗動物癥狀、體重（0、3、7、10、16、20d）；20天處死，記錄孕鼠重、黃體數(shù)、死胎數(shù)、（著床數(shù)、吸收胎、早期死胎、晚期死胎）、活胎數(shù)、活胎重、外觀異常等；一半胎鼠用Bouin氏液固定做內(nèi)臟檢查，一半茜素紅染色做骨骼畸形檢查。報告：將以上數(shù)據(jù)整理成表，并計算各種畸形率，骨骼還要分析骨化程度判定：各項數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計處理后判定胚胎毒性和致畸潛力。觀察與檢查：妊娠零天（判定方法）開始，記錄實驗動物癥狀、體重16LD50致畸指數(shù)=最小致畸劑量用來評價致畸強度，10以下為不致畸，10-100為致畸，100以上為強致畸第九章-發(fā)育毒性與致畸作用課件117注意事項：1、該試驗不能肯定或排除由于兩性配子損傷所引起的畸形和胚胎毒性2、給藥劑量、時間、途徑、動物敏感性對實驗結(jié)果有明顯影響3、陰性（溶劑）對照也會有個別畸形或/和變異4某些畸形或變異如多肋、短尾不影響后代存活和健康；某些部位或器官的骨化遲緩，如胸骨、脊椎骨、趾骨、枕骨，可在出生后趕上正常動物，屬于胚胎毒性而非畸形。5、變異與畸形的內(nèi)在聯(lián)系注意事項：18（三）圍產(chǎn)期毒性實驗?zāi)康模涸u價化學(xué)物于孕后期至斷乳期之間對孕鼠/哺乳鼠和胎兒/新生仔的潛在不良影響動物：通常用小鼠、大鼠或家兔，每組孕鼠15-20只，家兔8-12只劑量與給藥途徑：與一般生殖毒性試驗同

給藥時間：大、小鼠于妊娠第15天開始給藥，至分娩后21天（小鼠）和28天（大鼠），家兔于妊娠后22天開始給藥，至分娩后31天。（三）圍產(chǎn)期毒性實驗19對照：陰性（溶劑）對照，也可設(shè)陽性對照觀察與報告：觀察動物一般狀況，記錄胎仔數(shù)、一般發(fā)育狀況和外觀畸形等。取一定數(shù)量幼仔配對飼養(yǎng)，繼續(xù)觀察其存活、生長發(fā)育，包括行為、生殖功能及其它異常癥狀，必要時可對F1代動物進行運動和學(xué)習(xí)能力的測定等。根據(jù)上述資料的統(tǒng)計分析結(jié)果結(jié)合病理組織學(xué)檢查，對圍產(chǎn)期給藥的毒性及程度做出綜合評價第九章-發(fā)育毒性與致畸作用課件120（四）繁殖試驗（reproductionstudies）又稱多代繁殖試驗（multigenerationreproductionstudies）目的：評價受試物對親代生殖和后代發(fā)育與生殖的影響，尤其那些人類長期或世代接觸并可能在體內(nèi)累積的化學(xué)物。優(yōu)點：可同時分析化學(xué)物的生殖、母體及發(fā)育毒性。動物：大鼠，雌、雄各20只（或雄10只）劑量分組：設(shè)對照組、低劑量組（可按最大無作用劑量的1/30或可能攝入量的100倍），高劑量組（為最大耐受量或有胚胎毒性的閾劑量）（四）繁殖試驗（reproductionstudies）21給藥方式：加入飼料或飲水中，親代、子代接受相同的劑量、飼料、飲水。受試物占飼料的比例不超過20%。觀察指標：一般健康狀況、體重、進食量、死亡情況、受孕率、妊娠率、出生存活率、哺乳存活率（4d、21d）、產(chǎn)仔總數(shù)、宮重及平均仔重。第九章-發(fā)育毒性與致畸作用課件122計算：

受孕率（%）=懷孕動物數(shù)/交配雌性動物數(shù)x100

妊娠率（%）=分娩活體的動物數(shù)/懷孕動物數(shù)x100

出生存活率（%）=產(chǎn)后4d仔鼠存活數(shù)/出生時活仔數(shù)x100

哺乳存活率（%）=21d斷乳時仔鼠存活數(shù)/出生4d后仔鼠存活數(shù)x100計算：23繁殖試驗流程圖：見附頁第九章-發(fā)育毒性與致畸作用課件124結(jié)果評價：1、交配至分娩數(shù)據(jù)反映母體毒性和胚胎/發(fā)育毒性2、出生至斷乳數(shù)據(jù)反映乳母感受性和仔鼠生長發(fā)育3、斷乳至性成熟數(shù)據(jù)提示早期效應(yīng)的持續(xù)性和對未成年個體的直接效應(yīng)4F0和F1代數(shù)據(jù)的比較反映受試物對親代生殖細胞和激素系統(tǒng)影響第九章-發(fā)育毒性與致畸作用課件125二、環(huán)境流行病學(xué)研究可采用前瞻性隊列研究以及回顧性或橫斷面研究研究內(nèi)容包括：問卷調(diào)查檢查及化驗：生殖功能、臨床檢驗如精液、激素、分子生物學(xué)化學(xué)毒物污染的檢測生物標記物檢測第九章-發(fā)育毒性與致畸作用課件126三、控制下的臨床研究如新藥臨床終試以確定對病人的安全性對于化學(xué)毒物可選擇暴露人群，特別是高危/敏感人群以及志愿者，如保健食品的人群試食。但控制下的臨床研究有一定局限性，只適用于那些引起短期效應(yīng)和能較快逆轉(zhuǎn)的效應(yīng)，不適于那些主要引起慢性疾病的效應(yīng)。第九章-發(fā)育毒性與致畸作用課件127四、體外試驗研究1、大鼠全胚胎培養(yǎng)（wholeembryoculture）取材：從孕9-10天大鼠子宮取出胚胎，去胎膜，在含受試物的培養(yǎng)液中O2、CO2、N2環(huán)境下培養(yǎng)。觀察：胚胎發(fā)育情況，記錄肢芽數(shù)量和長度、卵黃囊直徑、體節(jié)和體長等評價：根據(jù)Brown量表平分。2、胚胎細胞微團培養(yǎng)（micromassculture）用來評價細胞毒性和發(fā)育毒性從孕11天的大鼠胚胎取不同部位的細胞微團在含受試物的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)5天。四、體外試驗研究28分析：中性紅染色判斷細胞存活率其他染色檢測細胞分化程度。3、生精細胞與間質(zhì)細胞共培養(yǎng)4胚胎干細胞分析：中性紅染色判斷細胞存活率29生殖毒理學(xué)生殖毒理學(xué)30內(nèi)容概述化學(xué)物生殖能力損傷機制化學(xué)物生殖能力損傷的檢測與評價內(nèi)容31第一節(jié)概述一、定義：生殖毒理學(xué)（reproductivetoxicology)主要研究環(huán)境化學(xué)物對生殖系統(tǒng)損害作用的原因、機制和后果。對生殖功能損害表現(xiàn)為：對性成熟、配子生成、性行為、生育力、妊娠、分娩和哺乳等的不良影響。第一節(jié)概述一、定義：生殖毒理學(xué)（reproductive32二、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物Environmentalendocrinedisruptors,EEDs,指環(huán)境中天然存在或污染的可模擬天然激素生理、生化作用，干擾或抑制生物體內(nèi)分泌、神經(jīng)或免疫系統(tǒng)功能，產(chǎn)生可逆或不可逆生物學(xué)效應(yīng)的化學(xué)物。二、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物Environmentalendocr33第二節(jié)、外源化學(xué)物對雄性生殖能力的損害作用與機制１、對下丘腦－垂體—睪丸軸雄性內(nèi)分泌功能的影響，表現(xiàn)為內(nèi)分泌器官的病理損害和性激素／促性激素水平改變２、對支持細胞的影響１）破壞支持細胞間和支持細胞與生殖細胞間連接，血－睪屏障受損以及生殖細胞丟失；２）破壞細胞骨架，導(dǎo)致生殖細胞輸送障礙，丟失；３）支持細胞空泡變性４）分裂異常５）代謝和信號傳導(dǎo)異常第二節(jié)、外源化學(xué)物對雄性生殖能力的損害作用與機制１、對下丘腦34３、對間質(zhì)細胞的影響增生／肥大、死亡４、對成熟精子的影響精子胞核ＤＮＡ損傷精子運動功能、受精力降低

３、對間質(zhì)細胞的影響35第三節(jié)、外源化學(xué)物對雌性生殖能力的損害作用與機制１、對下丘腦－垂體－卵巢軸雌性內(nèi)分泌功能的影響，表現(xiàn)為內(nèi)分泌器官的病理損害和性激素／促性激素水平改變；動情周期／月經(jīng)周期改變，排卵異常和性行為異常。２、配子／胚胎轉(zhuǎn)運異常３、卵巢毒性等。第三節(jié)、外源化學(xué)物對雌性生殖能力的損害作用與機制１、對下丘腦36第四節(jié)、外源化學(xué)物對生殖能力影響的檢測與評價目的和意義：

1、評價化學(xué)物對親代生殖系統(tǒng)和子代安全性

2、生殖毒性化學(xué)物的管理和中毒預(yù)防

3、優(yōu)生優(yōu)育提高人口素質(zhì)

第四節(jié)、外源化學(xué)物對生殖能力影響的檢測與評價目的和意義：37生殖毒性評價需四方面資料1、動物毒性試驗2、控制下的臨床研究3、環(huán)境流行病學(xué)資料4體外試驗第九章-發(fā)育毒性與致畸作用課件138一動物試驗

分為四個部分：

一般生殖毒性試驗致畸試驗圍產(chǎn)期毒性試驗繁殖實驗

第九章-發(fā)育毒性與致畸作用課件139‘（一）一般生殖毒性試驗

目的：評價化學(xué)毒物對生殖細胞（雌、雄）、胚胎、胎兒的影響（以下引自新藥臨床前研究指導(dǎo)原則匯編——藥學(xué)、藥理學(xué)、毒理學(xué)）

動物：多用大鼠，雌、雄各20只如必要可用家兔，避孕藥還需用猴子試驗。

劑量與給藥途徑：根據(jù)亞急性毒性試驗結(jié)果和毒代動力學(xué)試驗數(shù)據(jù)設(shè)定至少兩個劑量組，高劑量組可產(chǎn)生輕微毒性反應(yīng)，給藥途徑原則上與臨床擬用途徑同。

‘40給藥時間：交配前，雄60—80天，雌14天，連續(xù)給藥。雌動物交配后繼續(xù)給藥至多數(shù)器官形成期。大鼠器官形成期一般為：6-15d對照：陰性（溶劑）對照，也可設(shè)陽性對照觀察指標與報告：動物一般狀況、體重變化、受孕率、死胎數(shù)、活胎數(shù)、活胎重量、外觀和內(nèi)臟及骨骼變化，必要時做組織學(xué)檢查，統(tǒng)計處理，結(jié)果綜合分析第九章-發(fā)育毒性與致畸作用課件141（二）致畸試驗?zāi)康模侯A(yù)測環(huán)境有害物質(zhì)對人體的胚胎毒性及致畸性原理：母體在受孕期間受到可通過胎盤屏障的某種有害物質(zhì)作用，影響胚胎的器官分化與發(fā)育，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)和機能的缺陷，出現(xiàn)胎兒畸形。在受孕動物的胚胎著床后，并已開始進入細胞及器官分化期時投以受試物，可檢出該物質(zhì)對胎兒的致畸作用。動物：首選性成熟大鼠（Wistar或S.D)，80—90只，雌、雄各半，鼠齡90—100d，體重雄180g,雌150g（二）致畸試驗42動物也可用小鼠或家兔劑量分組：一般設(shè)四個組，一個空白對照，三個實驗組，必要時設(shè)陽性對照。可采用1/4、1/16、1/64LD50或以亞急性毒性試驗的最大無作用劑量為最高劑量組，其1/30左右為低劑量組，在中間設(shè)一組。

劑量設(shè)定原則：高劑量組應(yīng)有母體毒性，如攝食量減少、體重增長緩慢或下降，陰道流血、流產(chǎn)等。藥物可用最大給藥量，但限制劑量為1g/Kg。低劑量應(yīng)無母體毒性和胚胎反應(yīng)。動物也可用小鼠或家兔43給藥途徑：藥物擬用給藥途徑或灌胃、自由攝取，但不宜用腹腔注射。給藥時間：于胚胎器官形成期連續(xù)給藥。大鼠：孕后6-15天小鼠：孕后6-15天家兔：孕后6-18天對照：必須設(shè)溶劑對照，必要時設(shè)陽性對照?？晒┻x擇的陽性對照物有敵枯雙（0.5-1.0mg/kg體重），五氯酚納（30mg/kg/體重）阿斯匹林（250-300mg/kg）及維生素A(25000-40000IU)等.給藥途徑：藥物擬用給藥途徑或灌胃、自由攝取，但不宜用腹腔注射44觀察與檢查：妊娠零天（判定方法）開始，記錄實驗動物癥狀、體重（0、3、7、10、16、20d）；20天處死，記錄孕鼠重、黃體數(shù)、死胎數(shù)、（著床數(shù)、吸收胎、早期死胎、晚期死胎）、活胎數(shù)、活胎重、外觀異常等；一半胎鼠用Bouin氏液固定做內(nèi)臟檢查，一半茜素紅染色做骨骼畸形檢查。報告：將以上數(shù)據(jù)整理成表，并計算各種畸形率，骨骼還要分析骨化程度判定：各項數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計處理后判定胚胎毒性和致畸潛力。觀察與檢查：妊娠零天（判定方法）開始，記錄實驗動物癥狀、體重45LD50致畸指數(shù)=最小致畸劑量用來評價致畸強度，10以下為不致畸，10-100為致畸，100以上為強致畸第九章-發(fā)育毒性與致畸作用課件146注意事項：1、該試驗不能肯定或排除由于兩性配子損傷所引起的畸形和胚胎毒性2、給藥劑量、時間、途徑、動物敏感性對實驗結(jié)果有明顯影響3、陰性（溶劑）對照也會有個別畸形或/和變異4某些畸形或變異如多肋、短尾不影響后代存活和健康；某些部位或器官的骨化遲緩，如胸骨、脊椎骨、趾骨、枕骨，可在出生后趕上正常動物，屬于胚胎毒性而非畸形。5、變異與畸形的內(nèi)在聯(lián)系注意事項：47（三）圍產(chǎn)期毒性實驗?zāi)康模涸u價化學(xué)物于孕后期至斷乳期之間對孕鼠/哺乳鼠和胎兒/新生仔的潛在不良影響動物：通常用小鼠、大鼠或家兔，每組孕鼠15-20只，家兔8-12只劑量與給藥途徑：與一般生殖毒性試驗同

給藥時間：大、小鼠于妊娠第15天開始給藥，至分娩后21天（小鼠）和28天（大鼠），家兔于妊娠后22天開始給藥，至分娩后31天。（三）圍產(chǎn)期毒性實驗48對照：陰性（溶劑）對照，也可設(shè)陽性對照觀察與報告：觀察動物一般狀況，記錄胎仔數(shù)、一般發(fā)育狀況和外觀畸形等。取一定數(shù)量幼仔配對飼養(yǎng)，繼續(xù)觀察其存活、生長發(fā)育，包括行為、生殖功能及其它異常癥狀，必要時可對F1代動物進行運動和學(xué)習(xí)能力的測定等。根據(jù)上述資料的統(tǒng)計分析結(jié)果結(jié)合病理組織學(xué)檢查，對圍產(chǎn)期給藥的毒性及程度做出綜合評價第九章-發(fā)育毒性與致畸作用課件149（四）繁殖試驗（reproductionstudies）又稱多代繁殖試驗（multigenerationreproductionstudies）目的：評價受試物對親代生殖和后代發(fā)育與生殖的影響，尤其那些人類長期或世代接觸并可能在體內(nèi)累積的化學(xué)物。優(yōu)點：可同時分析化學(xué)物的生殖、母體及發(fā)育毒性。動物：大鼠，雌、雄各20只（或雄10只）劑量分組：設(shè)對照組、低劑量組（可按最大無作用劑量的1/30或可能攝入量的100倍），高劑量組（為最大耐受量或有胚胎毒性的閾劑量）（四）繁殖試驗（reproductionstudies）50給藥方式：加入飼料或飲水中，親代、子代接受相同的劑量、飼料、飲水。受試物占飼料的比例不超過20%。觀察指標：一般健康狀況、體重、進食量、死亡情況、受孕率、妊娠率、出生存活率、哺乳存活率（4d、21d）、產(chǎn)仔總數(shù)、宮重及平均仔重。第九章-發(fā)育毒性與致畸作用課件151計算：

受孕率（%）=懷孕動物數(shù)/交配雌性動物數(shù)x100

妊娠率（%）=分