植物細胞懸浮培養(yǎng)技術課件

植物細胞懸浮培養(yǎng)技術目錄1.植物單細胞的獲得2.懸浮培養(yǎng)的特點3.懸浮培養(yǎng)途徑與植株再生4.懸浮培養(yǎng)基的條件控制5.懸浮培養(yǎng)細胞的同步化處理6.懸浮培養(yǎng)細胞數(shù)目的測定7.懸浮培養(yǎng)細胞活性的測定8.胡蘿卜的懸浮培養(yǎng)

1.單細胞的獲得從植物器官中分離單細胞從如愈傷組織中分離單細胞1.1.1機械法

方法A：用刀片刮葉片

(花生成熟葉片)具體方法:撕去表皮露出葉肉細胞用解剖刀刮下細胞

方法B：葉片研碎、離心輕輕研磨加研磨介質過濾、離心

研磨介質：40ml20umolSucrose10umolMgCl2

20umolTris—HCL(三羥甲基氨基甲烷

)PH7.8注意：只有薄壁組織排列松散，細胞間結觸點很少時用機械法分離葉肉細胞才能取得成功。例分離籬天劍葉肉細胞的機械方法葉片消毒勻漿過濾離心植板75％酒精，7％次氯酸鈉10ml培養(yǎng)基1.5克1cm2葉片低速，去碎屑，游離細胞沉降1.1.3機械法和酶解法比較機械法酶解法細胞不受到酶的傷害；不用質壁分離；細胞產量低；細胞易破。細胞受到酶的傷害；要質壁分離；細胞產量高；細胞不易破。2.植物細胞懸浮培養(yǎng)技術（Suspensionculture）特點：細胞可以不斷增殖，形成高密度的細胞群體，適于大規(guī)模培養(yǎng)；能夠提供大量較為均勻的細胞，為研究細胞的生長、分化創(chuàng)造方法和條件。必須指出：懸浮培養(yǎng)中既有單細胞，也有小細胞團。概念：是指一種在受到不斷搖動的液體培養(yǎng)基里，培養(yǎng)單細胞及小細胞團的組織培養(yǎng)系統(tǒng)。搖床用于振蕩繼代懸浮2Subculture:懸浮培養(yǎng)將愈傷組織在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，建立懸浮培養(yǎng)物優(yōu)點：細胞團成小細胞團或單細胞；在培養(yǎng)基中均勻分布；有空氣交流。2.1起始懸浮液的制備愈傷組織液體培養(yǎng)基搖床振蕩懸浮培養(yǎng)質地疏松，細胞分散程度大；質地緊密，細胞分散程度小，不適于懸浮培養(yǎng)轉速30～150rpm防細胞破裂2.2、懸浮培養(yǎng)的基本形式分批培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)2.2.1.1分批培養(yǎng)的特點

培養(yǎng)基體積固定當培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質耗盡時，細胞的分裂和生長也停止必須適當攪拌，促進氧氣的溶解，和廢氣的排放。2.2.1.2繼代的方法和最佳時期繼代方法：用注射器或移液管吸取一定量的含單細胞和小細胞團的懸浮培養(yǎng)物，并移到含有新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶里，繼續(xù)進行培養(yǎng)。注意：要適當稀釋（可以一瓶稀釋成2瓶，或者3瓶。最佳繼代時期：

選擇指數(shù)生長期和直線生長期。2.2.1.3細胞生長曲線在整個培養(yǎng)過程中，細胞數(shù)目不斷發(fā)生變化，呈現(xiàn)出明顯的由慢到快，再到慢，最后增長停止的細胞周期。

細胞的生長呈S形曲線起始期

(lagphase)

細胞很少分裂，其時間長短取決于在繼代時原種培養(yǎng)細胞所處的生長期和轉入細胞數(shù)量的多少，細胞適應培養(yǎng)基的生長環(huán)境。培養(yǎng)時間培養(yǎng)細胞數(shù)目123451指數(shù)生長期(exponentialphase)

細胞分裂活躍，細胞數(shù)目迅速增加培養(yǎng)時間培養(yǎng)細胞數(shù)目123452對數(shù)生長期(linearphase)細胞生長和發(fā)育最快的時期培養(yǎng)時間培養(yǎng)細胞數(shù)目123453

生長幾乎處于停止狀態(tài)，細胞數(shù)目增加極少，甚至開始死亡。穩(wěn)定期(stationaryphase)培養(yǎng)時間培養(yǎng)細胞數(shù)目123455小結：

（1）起始的長短主要取決于在繼代時原種培養(yǎng)細胞所處的生長期和轉入細胞數(shù)量的多少。（2）加入條件培養(yǎng)基可以縮短滯后期。條件培養(yǎng)基：曾培養(yǎng)過一段時間組織或細胞的培養(yǎng)基。（3）縮短兩次繼代時間間隔，則可使懸浮培養(yǎng)的細胞一直保持指數(shù)生長期。（4）如果使處在靜止期的細胞懸浮液保持時間太長，則會引起細胞的大量死亡和解體。操作注意事項：對懸浮培養(yǎng)細胞繼代時，進液口的孔徑要小，只能通過單細胞或小細胞團（2～4細胞），使用吸管或注射器。繼代前，培養(yǎng)容器靜置短時間，大細胞團沉降，再吸上層懸浮液。依此，多次，可建立良好的細胞懸浮培養(yǎng)物。2.2.2連續(xù)培養(yǎng)（Continuousculture）加入培養(yǎng)基排出培養(yǎng)基及其培養(yǎng)物

二者體積相等分：開放式連續(xù)培養(yǎng)封閉式連續(xù)培養(yǎng)開放式和封閉式區(qū)別封閉式中：排出液中的細胞用機械方法收集后，又放入原培養(yǎng)基，所以其培養(yǎng)細胞數(shù)目不斷增加；開放式中：在注入新鮮培養(yǎng)基的同時，培養(yǎng)細胞隨同培養(yǎng)液一起流出。連續(xù)培養(yǎng)意義：1.植物細胞代謝調節(jié)的研究2.某種生長限制因子對細胞生長的影響3.次生產物的大量生產

紫杉醇是獲得美國FDA(1992)認證的優(yōu)良抗腫瘤藥物。紅豆杉樹皮中紫杉醇的含量為萬分之二，其在國際市場上售價為20萬美元/kg3由懸浮細胞再生植株的途徑由懸浮細胞直接形成體細胞胚先將懸浮細胞在半固體培養(yǎng)基上誘導形成愈傷組織，然后再由愈傷組織分化植株3.1懸浮培養(yǎng)對培養(yǎng)基的要求能用來建立生長快、易散碎的愈傷組織的培養(yǎng)基，一般也適用于建立該物種的懸浮培養(yǎng)。在活躍生長的懸浮培養(yǎng)物中，無機磷酸鹽的消耗很快，不久成為限制因子。要及時繼代。

Noguchi等(1977)證明，把煙草懸浮培養(yǎng)物保存在一種含有標準的MS無機鹽培養(yǎng)基中，培養(yǎng)開始3d之內無機磷酸鹽的濃度就幾乎下降為零，即使把培養(yǎng)基中磷酸鹽的濃度提高到原來的水平的3倍，5d之內也會被細胞全部用完。

高等植物的懸浮培養(yǎng)，B5和ER培養(yǎng)基。3.2條件培養(yǎng)基把在液體培養(yǎng)基里培養(yǎng)4～6周的高濃度細胞濾掉，而用他的培養(yǎng)基制成懸滴或薄層來培養(yǎng)單細胞或低密度細胞群體。3.3培養(yǎng)基的振蕩的意義防治細胞缺氧死亡防治大的細胞團的形成4懸浮培養(yǎng)細胞的同步化

同步培養(yǎng)：指在培養(yǎng)中大多數(shù)細胞都能同時通過細胞周期的各個階段。

應用：為了便于研究細胞分裂和細胞代謝4.1物理方法A按細胞團的大小通過對細胞物理特性（細胞或小細胞團的大小）的控制，以實現(xiàn)高度的同步化B低溫休克法通過對生長環(huán)境條件（光照、溫度等）的控制，以實現(xiàn)高度的同步化4.2化學方法A饑餓法先對細胞斷絕一種細胞分裂所必須的營養(yǎng)物質成分或激素，使細胞停滯在G1或G2期，經過一段時間的饑餓后，當重新在培養(yǎng)基中加入這種限制因子時，靜止細胞就會同步進入分裂。

細胞周期（cellcycle)是指細胞從第一次分裂結束產生新細胞到第二次分裂結束所經歷的全過程，分為間期與分裂期兩個階段。

間期又分為三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期）。細胞分裂期：前期，中期，后期，末期B抑制法使用DNA合成抑制劑，如5-氨基尿嘧啶、羥基尿和胸腺嘧啶脫氧核苷當細胞受到化學藥物抑制時，細胞周期只能進行到G1，細胞滯留在G1期S期的邊界上。5懸浮培養(yǎng)中細胞生長量的計算細胞計數(shù)細胞密實體積（PCV）5％鉻酸或0.25％果膠酶使懸浮細胞團分散用血球計數(shù)板進行。將體積已知、均勻分散的懸浮液放入一個15ml的離心管中，3000rpm離心，用每毫升培養(yǎng)液中細胞總體積的毫升數(shù)表示。細胞鮮重細胞干重細胞鮮重：細胞培養(yǎng)物過濾，洗去培養(yǎng)基，真空抽濾，稱重。細胞干重：60℃干燥12h，稱重。以每毫升培養(yǎng)物或106個細胞的重量表示。6.培養(yǎng)細胞活力的測定相差顯微術法

TTC法（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）FDA法（熒光素雙醋酸酯法）伊凡藍法(Evan’sblue)（FDA的互補法）

根據(jù)細胞質環(huán)流和細胞核存在與否，鑒別細胞的死活。環(huán)流正常、核存在表明有活力；

在活細胞中，TTC被還原成紅色甲鐟，提取甲鐟用分光光度計檢測。

活力受損的細胞能夠攝取這種染料，完整的活細胞則不能，凡染藍色的細胞是不具有活力的細胞。FDA法的原理FDA本身不具有極性，不能發(fā)出熒光，可以自由出入細胞膜。在活細胞中，F(xiàn)DA被酯酶裂解，釋放出有極性的熒光素。熒光素不能自由穿越質膜，在活細胞中積累。熒光素在死細胞中不能積累。在UV照射下，活細胞中的熒光素發(fā)出綠色熒光。FDA熒光素活細胞死細胞步驟：活細胞死細胞FDA先用丙酮配成0.5%的母液，終濃度為0.01%思考題：如何得到植物離體單細胞？植物細胞懸浮培養(yǎng)有哪些方法？簡述懸浮培養(yǎng)細胞同步化的方法簡述懸浮培養(yǎng)中細胞生長的計量方法如何獲得同步化的培養(yǎng)細胞？

胡蘿卜的懸浮培養(yǎng)1、實驗目的：

1.1、過本次實驗，熟練掌握愈傷組織繼代培養(yǎng)的基本操作技術，進一步熟悉、規(guī)范無菌操作技術。

1.2、設計和配制胡蘿卜細胞懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基。

1.3、學習懸浮培養(yǎng)細胞的操作。2.實驗原理在固體培養(yǎng)基中，植物的愈傷組織在生長過程中的營養(yǎng)成分、植物組織產生的代謝物質呈現(xiàn)一個梯度分布，隨著植物對營養(yǎng)物質的吸收，離愈傷組織越遠，營養(yǎng)物質的含量逐漸增高。而且瓊脂本身也有一些不明的物質成分可能對培養(yǎng)物產生影響。當植物的組織在液體培養(yǎng)基中生長時，可以通過薄層震蕩培養(yǎng)或向培養(yǎng)基中通氣用以改善培養(yǎng)基中氧氣的供應。植物細胞的懸浮培養(yǎng)是指將植物細胞或較小的細胞團懸浮在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中能夠保持良好的分散狀態(tài)。這些小的細胞聚合體通常來自植物的愈傷組織。3.實驗器材主要實驗用具和儀器：

冰箱、普通天平、三角瓶、移液管、量筒、燒杯、容量瓶、玻璃棒、醫(yī)用口杯、精密pH試紙（pH5.4~7.0）、藥勺、稱量紙、標簽紙、封口膜、橡皮筋、電爐、高壓蒸汽滅菌鍋等。

藥品和試劑：

MS培養(yǎng)基母液、瓊脂、蔗糖、生長調節(jié)物質、蒸餾水、1mol·L-1HCl、1mol·L-1NaOH實驗材料：胡蘿卜的愈傷組織。4.實驗步驟4.1配制懸浮培養(yǎng)基

MS+3%蔗糖+200mg/L水解酪蛋白+0.5mg/L2,4-D+1.0mg/L6-BA。

維生素C20mg/L

4.2接種在無菌條件下，用鑷子夾取胡蘿卜根的愈傷組織，置于一個無菌培養(yǎng)皿中，將愈傷組織切成適當大小，同樣也可以將愈傷組織捏碎，用解剖刀挑取愈傷組織接種于10ml細胞懸浮培養(yǎng)基中，