微生物菌種保藏課件

微生物菌種保藏技術(shù)2011級微生物學劉艷敏菌種是進行微生物學研究和應(yīng)用的基本材料，是發(fā)展生物工程的重要基礎(chǔ)條件之一，是國家的重要生物資源。微生物個體微小，代謝活躍，生長繁殖快，如果保存不妥容易發(fā)生變異，或被其他微生物污染，甚至導致微生物死亡，這種現(xiàn)象屢見不鮮。菌種的長期保藏對任何微生物學工作者都是很重要的，而且也是非常必要的。菌種保藏要求各保藏管理中心所保藏的菌種，必須具有該菌種的詳細歷史及有關(guān)實驗資料。并對其所負責保藏的菌種均應(yīng)采取妥善、可靠的方法保藏，避免菌種的污染或死亡。常用保藏方法定期移植法液體石蠟法真空冷凍干燥法-80℃低溫凍結(jié)法液氮超低溫凍結(jié)法（一）定期移植法亦稱傳代培養(yǎng)保藏法，指將菌種接種于適宜的斜面培養(yǎng)基上，最適條件下培養(yǎng)，待得到健壯的菌體后，于4～6℃進行保存并間隔一定時間（3-6個月）進行移植培養(yǎng)的一種短期菌種保藏方法。操作步驟：

斜面制備接種培養(yǎng)保藏斜面制備培養(yǎng)基配制分裝滅菌擺放斜面接種方法總結(jié)操作簡單，使用方便；對設(shè)備和人員要求不高；可隨時使用，便于觀察菌種；工作勞動強度大，屬短期保藏，保藏成本高；菌種傳代頻繁，易退化、污染。操作步驟：液體石蠟預處理斜面培養(yǎng)物制備灌注石蠟保藏優(yōu)質(zhì)化學純液體石蠟滅菌：121℃濕熱滅菌30min，蒸發(fā)水分；160℃干熱滅菌2h；冷卻至室溫。液面高出斜面頂部1cm4～6℃，干燥處；直立放置；保藏時間1～2年。(三)真空冷凍干燥法指將保藏的菌種細胞或孢子懸浮于保護劑中，經(jīng)預凍后在真空條件下使水分升華，再經(jīng)真空封存后保存的一種長期菌種保存方法。安瓿管，又叫安瓿瓶，簡稱安瓿，指裝注射劑用的密封的小玻璃瓶，用藥時將瓶頸的上端弄破。1、安瓿管的準備清洗

選用中性玻璃材質(zhì)的安瓿管；2%鹽酸浸泡8～10h，自來水沖洗至中性，蒸餾水沖洗2～3次；

置于烘箱中烘干。棉塞打棉塞，160℃定型2h；標簽

激光打印標簽，標明菌株編號和保藏日期，大小約10×20mm。

噴碼于安瓿管外，160℃固定20min。滅菌同一菌種安瓿管包在一起，121℃濕熱滅菌30min.2、保護劑的準備保護劑：12%脫脂牛奶蒸餾水溶液，2～5ml/管；滅菌鍋加熱至沸騰，將牛奶管放入鍋中，113℃滅菌20min；打開放氣閥緩慢排出蒸汽，取出滅菌后脫脂牛奶試管，迅速放入涼水中冷卻；30℃培養(yǎng)2天，無菌檢查合格后備用。3、凍干樣品制備制備斜面培養(yǎng)物；將保護劑用無菌吸管注入到斜面培養(yǎng)物上，用吸管刮取斜面上的菌體，使菌體均勻地懸浮在保護劑內(nèi)。用長毛細滴管將菌懸液分裝到安瓿管內(nèi)，0.1～0.2ml/管，操作時要把帶有菌懸液的長毛細滴管直接插入安瓿管的底部，勿使菌液沾在管壁上。4、預凍制備菌懸液、經(jīng)分裝到進行預凍之間的時間不宜超過1h；分裝完成后將安瓿管立刻放入－35～－40℃冰箱預凍1h，使菌液完全凍結(jié)；可采用分段式預凍，先將分裝好的安瓿管置－20℃凍30分鐘，再放入－80℃冰箱凍30min；采用離心式凍干裝置時勿需預凍。5、真空干燥在開動真空泵后應(yīng)使真空度在15min內(nèi)達到66.5Pa，隨后逐漸達到26.6～13.3Pa，在此條件下，樣品將保持凍結(jié)狀態(tài)，其中水分則不斷升華，干燥才能順利地進行。終止干燥時間應(yīng)根據(jù)下列情況判斷：安瓿管內(nèi)凍干物呈酥塊狀或松散片狀真空度接近空載時的最高值樣品溫度與管外溫度接近選用1～2支對照管，其水份與菌懸液同量，當其水分完全蒸發(fā)時視為干燥完結(jié)7、真空度檢測

用高頻電火花檢查各安瓿管的真空情況，如管內(nèi)呈現(xiàn)灰藍色光，說明真空度符合要求。檢查時高頻電火花應(yīng)射向安瓿管的上半部，切勿直接射向樣品，以免影響其中的菌種。8、保藏4～6℃下避光保藏，一般可保藏8～10年。(四）－80℃冰箱凍結(jié)法將菌種懸浮于保護劑中，在－80℃冰箱中凍結(jié)保存的一種長期菌種保藏方法。準備冷凍

管準備保護劑（10%-15%甘油)準備菌懸液（細胞、孢子或芽孢懸液）制備冷凍管（取菌懸液和保護劑至冷凍管）保藏（-80℃，2～5年）（五）液氮超低溫凍結(jié)法指懸浮于保護劑中的菌種經(jīng)程控降溫后，移置于－196℃的液氮或－150℃左右的液氮氣相中保存的一種長期菌種保藏方法。操作步驟冷凍管準備保護劑制備同“－80℃冰箱凍結(jié)法”保藏培養(yǎng)物準備預凍---將程序降溫系統(tǒng)預冷到4℃，將制備好的冷凍管放入其中，以1℃/min降溫速率降至-35℃；

---使用程序降溫盒。保藏將預凍后的冷凍管轉(zhuǎn)移至液氮氣相(-150℃)或液相(-196℃)。方法總結(jié)保藏時間長；保藏效果好，菌種不易退化；對設(shè)備要求高(程控降溫儀、液氮罐)，對人員操作水平要求高；保藏成本高。不同保藏方法的比較保藏方法保藏原理保藏時間保藏設(shè)備菌種活性保藏成本操作性定期移植法低溫（4℃）3～6月冰箱易退化高簡單液體石蠟法低溫（4℃）阻斷氧氣1～2年冰箱退化較高比較簡單真空冷凍干燥法干燥、低溫、無氧、保護劑8～10年－80℃冰箱、真空冷凍干燥機、封管設(shè)備退化低復雜-80℃冰箱凍結(jié)法低溫（-80℃）、保護劑2～5年－80℃冰箱退化較低復雜液氮超低溫凍結(jié)法超低溫(-150℃或-196℃）、保護劑無期限程控降溫儀、液氮運輸罐及液氮罐不易退化高復雜玻璃化技術(shù)就是用極快的冷卻速率，使細胞及其所處的溶液來不及形成冰晶，一下子以“非晶體”的方式固化下來，可以阻止冰晶體對細胞的破壞作用。對于1微米直徑的純凈水滴，只有當冷卻速率高達107℃/秒時才能實現(xiàn)“玻璃化”。國內(nèi)認可的菌種收藏機構(gòu)1979年7月，全國第一屆菌種保藏管理會議正式成立中國菌種保藏管理委員會（CCCCM），委員會下設(shè)7個全國性菌種保藏管理中心及機構(gòu)所在地：普通微生物菌種保藏管理中心（CCGMC）,中國科學院微生物研究所農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ACCC）,中國農(nóng)科院區(qū)劃所工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC），中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心（CMCC），中國藥品生物制品鑒定所抗菌素菌種保藏管理中心（CACC），中國醫(yī)科院醫(yī)用生物技術(shù)研究所獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心（CVCC），農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)藥品監(jiān)察所林業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CFCC），中