細(xì)胞培養(yǎng)基培訓(xùn)資料比較全面,可以有個(gè)初步了解

企業(yè)優(yōu)勢標(biāo)準(zhǔn)化的生產(chǎn)管理我們對每批產(chǎn)品都進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，做到每批產(chǎn)品都有可追溯性.采用先進(jìn)的生產(chǎn)設(shè)備和標(biāo)準(zhǔn)化的操作程序，保證產(chǎn)品的質(zhì)量的穩(wěn)定性，降低產(chǎn)品的批間差.定期超純水及細(xì)胞培養(yǎng)注射用水水質(zhì)的監(jiān)測嚴(yán)格的在線管道清洗（CIP)及消毒程序(SIP)標(biāo)準(zhǔn)化的配液，過濾，分裝體系第一頁，共一百零一頁。細(xì)胞學(xué)簡介什么是細(xì)胞？能進(jìn)行獨(dú)立繁殖的有膜包圍的生物體的基本結(jié)構(gòu)和功能單位。一般由質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)和核（或擬核）構(gòu)成，是生命活動(dòng)的基本單位。第二頁，共一百零一頁。維持細(xì)胞體外生存的必要條件嚴(yán)格的無菌無毒環(huán)境體外培養(yǎng)的細(xì)胞缺乏對微生物和有毒物質(zhì)的防御能力適合的營養(yǎng)條件高質(zhì)量的細(xì)胞培養(yǎng)基和血清是細(xì)胞培養(yǎng)成功的基本條件適宜的生存環(huán)境恒定適宜的溫度、pH值、氣相環(huán)境（二氧化碳的濃度）第三頁，共一百零一頁。細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)設(shè)備CO2培養(yǎng)箱細(xì)菌霉菌培養(yǎng)箱過濾設(shè)備烘箱高壓滅菌設(shè)備水浴鍋磁力攪拌器離心機(jī)

酸缸液氮罐

精密天平倒置顯微鏡

pH計(jì)酶標(biāo)儀

電導(dǎo)率儀滲透壓儀

細(xì)胞計(jì)數(shù)板超凈臺(tái)培養(yǎng)皿等相關(guān)耗材生物安全柜第四頁，共一百零一頁。細(xì)胞培養(yǎng)流程貼壁細(xì)胞培養(yǎng)流程第五頁，共一百零一頁。細(xì)胞培養(yǎng)流程

懸浮細(xì)胞培養(yǎng)流程第六頁，共一百零一頁。細(xì)胞培養(yǎng)基組要成分①基本培養(yǎng)基②血清③細(xì)胞培養(yǎng)試劑（抗生素細(xì)胞解離，生長因子等）④平衡鹽溶液第七頁，共一百零一頁。培養(yǎng)基必須的基礎(chǔ)營養(yǎng)物質(zhì)水超純水、細(xì)胞培養(yǎng)注射用水（本公司所采用的為細(xì)胞培養(yǎng)注射

用水）氨基酸必需氨基酸：組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸。

條件性必需氨基酸：谷氨酰胺、精氨酸、半胱氨酸、酪氨酸非必需氨基酸：丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、甘氨酸、脯氨

酸、絲氨酸。維生素生物合成的輔助因子，機(jī)體自身不能合成：如生物素、葉酸、核黃素、

維生素B12。血清

提供額外的營養(yǎng)以及提供生長、附著因子pH指示劑

可使細(xì)胞產(chǎn)生類似于苛爾蒙的反應(yīng)，在做苛爾蒙的研究或者生產(chǎn)中應(yīng)去

掉酚紅指示劑，避免產(chǎn)生干擾。第八頁，共一百零一頁。經(jīng)典培養(yǎng)基的應(yīng)用BME(BasalMediumEagle):

是由Eagle發(fā)明的，是最簡單的培養(yǎng)基，只有11種氨基酸和鹽及一些維生素。最先用于培養(yǎng)小鼠的L細(xì)胞和人類HeLa細(xì)胞，現(xiàn)在廣泛用于各種細(xì)胞的培養(yǎng)EMEMorMEM(Eagle’sMinimumEssentialMedium):

是BME的升級版，氨基酸濃度是BME的兩倍，適用于更多的細(xì)胞第九頁，共一百零一頁。經(jīng)典培養(yǎng)基應(yīng)用DMEM(Dulbecco’sModificationofEagle’sMedium)

是Dulbecco改進(jìn)的MEM.氨基酸和維生素濃度是BME的4倍.最先葡萄糖的濃度是1g/L，稱為低糖DMEM,后來增加到4.5g/L，稱為高糖DMEM，廣泛用于各種細(xì)胞培養(yǎng)。第十頁，共一百零一頁。經(jīng)典培養(yǎng)基應(yīng)用M199(Medium199):

是一種比較古老的，配方復(fù)雜的，含有核苷酸，核酸等成分的培養(yǎng)基。最初用于雞胚肌細(xì)胞的培養(yǎng)，還用于各種細(xì)胞的維持和病毒生產(chǎn)第十一頁，共一百零一頁。經(jīng)典培養(yǎng)基應(yīng)用RPMI1640(RoswellParkMemorialInstitute#1640):

是McCoy’s5A的改進(jìn)版，含有高濃度的肌醇。廣泛用于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)。如人類白細(xì)胞，骨髓瘤細(xì)胞，雜交瘤細(xì)胞等血液來源的細(xì)胞第十二頁，共一百零一頁。經(jīng)典細(xì)胞培養(yǎng)基應(yīng)用Ham’sF10(Ham’sNutrientMixtureF10):

由Ham發(fā)明，用于人類2倍體細(xì)胞和倉鼠細(xì)胞的培養(yǎng)。Ham’sF12(Ham’sNutrientMixtureF12):F10的升級版，含有更多的維生素，肌醇，氨基酸。用于培養(yǎng)大鼠，兔子和雞胚細(xì)胞，還用于中國倉鼠卵巢細(xì)胞以及肺細(xì)胞的培養(yǎng)第十三頁，共一百零一頁。經(jīng)典細(xì)胞培養(yǎng)基的應(yīng)用IMDM

是由Iscove改良的Dulbecco培養(yǎng)基，較DMEM增加了幾種非必需氨基酸和一些維生素，IMDM為高葡萄型培養(yǎng)基，可用于雜交瘤細(xì)胞的篩選培養(yǎng)，也可作為無血清培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基第十四頁，共一百零一頁。經(jīng)典細(xì)胞培養(yǎng)基應(yīng)用DMEM/F12

是DMEM和F12按1:1比例配制而成，是神經(jīng)生物學(xué)最常用的基本培養(yǎng)基，也是無血清培養(yǎng)基的基礎(chǔ)液，IMDM非常適合于迅速增殖，高密度細(xì)胞的培養(yǎng)，包括Jurkat細(xì)胞，COS-7，和巨噬細(xì)胞。IMDM支持小鼠B淋巴細(xì)胞，來自骨髓的造血組織，脂多糖刺激的B細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞，和各種雜交細(xì)胞的生長。與血清一起使用時(shí)，它支持多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括骨髓，雜交瘤細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的生長.第十五頁，共一百零一頁。經(jīng)典細(xì)胞培養(yǎng)基應(yīng)用McCoy5A

是McCoy等人在1959年研制，是一種專門為培養(yǎng)肉瘤細(xì)胞研制的培養(yǎng)基，除適用于原代細(xì)胞、組織活檢細(xì)胞和淋巴細(xì)胞培養(yǎng)外，還適用于較難培養(yǎng)的細(xì)胞，如皮膚，牙齦，睪丸，小鼠腎臟，大網(wǎng)膜，腎上腺，肺，脾，大鼠胚胎和其他組織的原代生長，以及活體組織的體外移植。第十六頁，共一百零一頁。經(jīng)典培養(yǎng)基用途匯總MEM:僅含12種必須氨基酸，谷氨酰胺和8種維生素廣泛應(yīng)用于細(xì)胞系的培養(yǎng)，是DMEM的前身。BME：刪除了一些必須氨基酸，增添了一些非必須氨基酸。DMEM:2xMEM的成分，有高糖、低糖之分，廣泛用于哺乳細(xì)胞的培養(yǎng)。RPMI1640:最初針對淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)而設(shè)計(jì)M199:廣泛用于病毒學(xué)，疫苗生產(chǎn)和組織移植培養(yǎng)。Ham'sFmixs：可在血清含量較少的情況下培養(yǎng)細(xì)胞。第十七頁，共一百零一頁。細(xì)胞培養(yǎng)基形式（按外觀）即用型(1X)液體培養(yǎng)基:直接用培養(yǎng)基濃縮液(10Xor50X):用前需要稀釋成1×

干粉培養(yǎng)基DPM(DryPowderMedia):

需要在水中溶解,加入碳酸氫鈉,調(diào)pH值,然后過濾才可以使用.

高級顆粒技術(shù)培養(yǎng)基AGT(AdvancedGranulationTechnologyTM):

比DPM形式的培養(yǎng)基更容易溶解的顆粒狀的培養(yǎng)基.

AGT是完全為工業(yè)產(chǎn)量的用戶開發(fā)的,pH提前調(diào)好，所有的成分都提前混合好,只需要加水溶解和過濾。第十八頁，共一百零一頁。干粉培養(yǎng)基與液體即用型培養(yǎng)基對比第十九頁，共一百零一頁。細(xì)胞培養(yǎng)基類型（按成分）傳統(tǒng)培養(yǎng)基要添加血清(5-10%)的培養(yǎng)基高級培養(yǎng)基（Advancedmedium）濃縮了營養(yǎng)物質(zhì)和其他成分的培養(yǎng)基,只需要<2%的血清(減少50-90%)無血清培養(yǎng)基(無血清培養(yǎng)基/無蛋白培養(yǎng)基/化學(xué)定義的培養(yǎng)基)使用時(shí)無須再添加血清,主要用于生物產(chǎn)品生產(chǎn),干細(xì)胞研究等第二十頁，共一百零一頁。專用培養(yǎng)基針對角質(zhì)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、造血細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、CHO細(xì)胞、293細(xì)胞、各類昆蟲細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、羊水細(xì)胞等的無血清培養(yǎng)基第二十一頁，共一百零一頁。（SFM,PFM和CDM培養(yǎng)基）的區(qū)別Serum-FreeMedium（SFM）成分更加清晰消除因血清批次不同而帶來的不確定性–保持實(shí)驗(yàn)的連續(xù)性易于純化和下游處理優(yōu)化特殊細(xì)胞及其功能的培養(yǎng)條件越來越多的無血清培養(yǎng)基用非動(dòng)物/人來源的原料制造有利于精確闡述細(xì)胞功能提高生產(chǎn)力更好控制生理反應(yīng)專門針對角質(zhì)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、造血細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、CHO細(xì)胞、293細(xì)胞、各類昆蟲細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、羊水細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基無需加入血清可能包含降解的蛋白或者蛋白塊蛋白含量保持在易于純化的最小狀態(tài)優(yōu)化特殊細(xì)胞培養(yǎng)條件第二十二頁，共一百零一頁。Protein-FreeMedia(PFM)

無蛋白(不同的廠商有不同的說明)包含起源于動(dòng)物或者植物的不明確的提取物Chemically-DefinedMedia(CDM)

無蛋白和不明確的成分所有的成分都有一個(gè)明確的結(jié)構(gòu)，可以提供性能一致的產(chǎn)品,減少批次間的差別第二十三頁，共一百零一頁。培養(yǎng)基的保存與運(yùn)輸干粉：24個(gè)月，2～8℃避光保存，可在室溫情況下運(yùn)輸.液體：12個(gè)月，所有的培養(yǎng)基都必須在2～8℃，避光保存，不能冷凍.第二十四頁，共一百零一頁。血清產(chǎn)品簡介

血清－血清的作用提供對維持細(xì)胞指數(shù)生長的激素，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中沒有或量很少的營養(yǎng)物，以及主要的低分子營養(yǎng)物。（如氨基酸、維生素、無機(jī)物、脂類物質(zhì)、核算衍生物、胰島素、腎上腺皮質(zhì)激素、類固醇激素、纖維細(xì)胞生長因子、表皮細(xì)胞生長因子、血小板生長因子等）提供結(jié)合蛋白，能識(shí)別維生素、脂類、金屬和其他激素等，能結(jié)合或調(diào)變它們所結(jié)合的物質(zhì)活力。有些情況下結(jié)合蛋白質(zhì)能與有毒金屬和熱原質(zhì)結(jié)合，起到解毒作用。是細(xì)胞貼壁、鋪展在塑料培養(yǎng)基質(zhì)上所需因子來源。起酸堿度緩沖液作用。提供蛋白酶抑制劑，使在細(xì)胞傳代時(shí)使剩余胰蛋白酶失活，保護(hù)細(xì)胞不受傷害。第二十五頁，共一百零一頁。動(dòng)物血清的種類.胎牛血清(FBS):fetalbovineserum直接胚胎心臟取血，胎牛還未接觸外界，血清中所含的抗體、補(bǔ)體等對細(xì)胞有害的成分最少。.新生牛血清(NBS):newborncalfserumornewbovineserum

出生小于于十四天.小牛血清（CS)：calfserum

出生小于一年.捐獻(xiàn)血清:特殊飼養(yǎng)的，專門用來進(jìn)行血清提取的牛.其他血清:

horse,chicken,goat,lamb（羊）,porcine（豬）,rabbit第二十六頁，共一百零一頁。血清的缺點(diǎn)

1、對大多數(shù)細(xì)胞，在體內(nèi)狀態(tài)，血清不是它們接觸的生理學(xué)液體，只是在損傷愈合以及血液凝固過程中才接觸血清，因此使用血清有可能改變某種細(xì)胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)，血清可能促進(jìn)某些細(xì)胞的生長（成纖維細(xì)胞）同時(shí)抑制另一類細(xì)胞生長（表皮細(xì)胞）。

2、血清含有對細(xì)胞產(chǎn)生毒性的物質(zhì)，如多胺氧化酶，能與來自高度繁殖細(xì)胞的多胺反應(yīng)（如精胺、亞精胺）形成有細(xì)胞毒性作用的聚精胺。補(bǔ)體、抗體、細(xì)菌毒素等都會(huì)影響細(xì)胞生長，甚至造成細(xì)胞死亡。

3、動(dòng)物個(gè)體不同，血清產(chǎn)地、批號(hào)不同，每批質(zhì)量差異甚大，其成分不能保持一致。

4、取材中可能帶入支原體、病毒，對細(xì)胞產(chǎn)生潛在影響，可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗或?qū)嶒?yàn)結(jié)果不可靠性。

5、血清的使用使得實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化困難，其中的蛋白質(zhì)使得某些轉(zhuǎn)基因蛋白生物藥品生產(chǎn)中分離純化工作很難完成。大規(guī)模生產(chǎn)中，血清來源越來越困難，價(jià)格昂貴，是構(gòu)成動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)對生產(chǎn)成本的主要部分之一。

第二十七頁，共一百零一頁。細(xì)胞培養(yǎng)基相關(guān)試劑平衡鹽及緩沖液細(xì)胞消化試劑pH調(diào)節(jié)試劑營養(yǎng)添加劑抗生素細(xì)胞凍存液第二十八頁，共一百零一頁。平衡鹽及緩沖溶液PBSPBS是生物學(xué)研究和組織培養(yǎng)中常用的一種緩沖溶液。例如，細(xì)胞或組織的運(yùn)輸，細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)的稀釋，溶液的配制，容器，包括細(xì)胞的清洗等，但不能用于細(xì)胞及組織塊的消化。DPBS配方中無鈣鎂離子，不會(huì)中和胰酶及EDTA活性，用于貼壁和團(tuán)塊細(xì)胞的消化解離，細(xì)胞解離前的清洗。第二十九頁，共一百零一頁。HBSSHBSS可用于多種細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用，如細(xì)胞解離前的清洗，細(xì)胞或組織的運(yùn)輸，細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)的稀釋，溶液的配制等。含鈣和鎂的HBSS配方一般用作運(yùn)輸培養(yǎng)基或試劑配制，無鈣鎂的HBSS用于細(xì)胞解離前的清洗，不會(huì)降低胰酶的活性第三十頁，共一百零一頁。細(xì)胞消化試劑0.05%胰蛋白酶+0.02%EDTA0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA

胰蛋白酶是一種胰腺絲氨酸蛋白酶，具有底物特異性，解離消化作用強(qiáng)，被用于組織培養(yǎng)中貼壁細(xì)胞的傳代。但細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中存在的二價(jià)陽離子，如鈣和鎂等可以抑制解離。EDTA可螯合二價(jià)離子，從而增強(qiáng)胰蛋白酶的作用。第三十一頁，共一百零一頁。影響胰酶消化細(xì)胞的因素胰蛋白酶溶液的消化能力是和溶液的pH、溫度、胰酶濃度及溶液中是否含有Ca2+、Mg2+離子和血清等因素有關(guān)。通常情況下，pH8.0,溫度37℃其作用能力最強(qiáng)。另外，鈣、鎂離子及血清均能大大降低其消化能力。我們每次進(jìn)行傳代消化前，一定要用D-Hanks液或PBS液反復(fù)沖洗細(xì)胞培養(yǎng)瓶，以便于將含血清的培養(yǎng)基沖洗干凈，這樣就能大大提高消化液的消化能力。第三十二頁，共一百零一頁。臺(tái)盼藍(lán)試劑臺(tái)盼藍(lán)染色是一種廣為接受的用于死細(xì)胞染色法。臺(tái)盼藍(lán)被正常的活細(xì)胞排斥而能被喪失活性的細(xì)胞吸收，并呈現(xiàn)藍(lán)色。

第三十三頁，共一百零一頁。pH調(diào)節(jié)試劑NaHCO3（7.5%）碳酸氫鈉是常用的緩沖體系的一部分，用來維持培養(yǎng)環(huán)境中生理pH值之間,大多數(shù)細(xì)胞適宜在條件下生長，為了維持培養(yǎng)環(huán)境的Ph，多采用在培養(yǎng)基中加入碳酸鹽等緩沖劑的方法，細(xì)胞生長過程中，隨細(xì)胞數(shù)量的增多和代謝活動(dòng)的加強(qiáng)，不斷產(chǎn)生CO2，溶解的CO2與HCO3-達(dá)到平衡，從而使培養(yǎng)基的pH降低，在溶液中存在如下反應(yīng)：H2O+CO2←→H2CO3←→H++HCO3-抵消二氧化碳產(chǎn)生的作用可通過增加碳酸鹽的濃度來解決：NaHCO3←→Na++HCO3-HCO3-的增加可使H2O+CO2←→H2CO3←→H++HCO3-的反應(yīng)向左邊進(jìn)行直至pH在7.4左右達(dá)到平衡。第三十四頁，共一百零一頁。Hepes（1M)

HepesBuffer是用于細(xì)胞培養(yǎng)基中的一種生物緩沖劑，在開放式培養(yǎng)或細(xì)胞觀察時(shí)能維持較恒定的pH值，Hepes(25mM)可以作為碳酸氫鹽緩沖液的替代品，或者作為碳酸氫鹽緩沖液的添加物（10-15mM），以解除需要高濃度CO2培養(yǎng)環(huán)境的限制.第三十五頁，共一百零一頁。幾種平衡鹽系統(tǒng)中NaHCO3、Hepes、CO2的用量

第三十六頁，共一百零一頁。細(xì)胞培養(yǎng)基營養(yǎng)添加劑BSA（V）（7.5%）牛血清白蛋白（BovineSerumAlbumin,BSA）是牛血清中的一種球蛋白，又稱第五組分（需要注意的是，第五組分并不是BSA的一種組份，而是EdwinJ.Cohn教授早期從血液中通過特定的分離技術(shù)得到5種組份，其中第五種就是白蛋白），CAS號(hào)為9048-46-8，包含583個(gè)氨基酸殘基，分子量為66.430kDa，等電點(diǎn)為4.7。牛血清白蛋白在生化實(shí)驗(yàn)中有廣泛的應(yīng)用，例如在westernblot中作為封閉試劑。血液中的白蛋白主要起維持滲透壓作用、PH緩沖作用、載體作用和營養(yǎng)作用。在動(dòng)物細(xì)胞無血清培養(yǎng)中，添加白蛋白可起到生理和機(jī)械保護(hù)作用和載體作用。第三十七頁，共一百零一頁。牛血清白蛋白提取工藝第三十八頁，共一百零一頁。牛血清白蛋白在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用以流感病毒為例作為流感病毒分離培養(yǎng)液的營養(yǎng)添加劑替代牛血清添加牛血清白蛋白生長添加劑不會(huì)影響TPCK-胰酶促轉(zhuǎn)染的效率，保持了TPCK-胰酶的活性，促進(jìn)病毒的復(fù)制，同時(shí)對后期的血凝及血凝試驗(yàn)不會(huì)產(chǎn)生干擾，人和動(dòng)物血清中存在非特異性血凝抑制素，它們是游離在血清中類似病毒受體的唾液酸殘基，能與病毒血凝素分子上的受體結(jié)合，會(huì)競爭抑制病毒與紅血球的結(jié)合，因而造成假陽性，因此HI試驗(yàn)必須用受體破壞酶處理血清。

第三十九頁，共一百零一頁。牛血清白蛋白使用注意事項(xiàng)牛血清白蛋白（7.5%）保存于2-8℃，避免與強(qiáng)氧化劑及強(qiáng)酸接觸。在流感病毒分離培養(yǎng)時(shí),牛血清白蛋白（7.5%）用量為每500ml細(xì)胞培養(yǎng)基添加

12.5ml，終濃度0.2%。第四十頁，共一百零一頁?？股禺a(chǎn)品青鏈霉素慶大霉素兩性霉素B慶大霉素、兩性霉素B青鏈霉素、兩性霉素B第四十一頁，共一百零一頁。青鏈霉素青霉素（10000U/ml）鏈霉素（10000ug/ml）青鏈霉素是廣譜抑菌劑，對革蘭氏陰性和陽性微生物有抗菌性，青霉素影響細(xì)菌細(xì)胞壁合成的終止步驟，在轉(zhuǎn)肽反應(yīng)步驟抑制多肽鏈的延伸，青鏈霉素的有效濃度為100u/ml；鏈霉素為100ug/ml1ml青鏈霉素試劑可添加100ml細(xì)胞培養(yǎng)基中使用保存條件：-20℃冷凍保存，避免反復(fù)凍融第四十二頁，共一百零一頁。慶大霉素慶大霉素（0.5mg/ml）or（50mg/ml）慶大霉素是一種廣譜細(xì)菌培養(yǎng)抗生素，在抗菌濃度下，它對病毒和哺乳細(xì)胞沒有毒性，對革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌以及支原體有抗菌活性，被用于長期病毒和組織培養(yǎng)研究。主要是通過與50S核糖體亞基的L6蛋白結(jié)合，干擾細(xì)菌蛋白質(zhì)合成，它的有效濃度是5ug/ml，在大于300ug/ml時(shí)具備細(xì)胞毒性。每ml慶大霉素試劑添加100ml細(xì)胞培養(yǎng)基中使用保存條件：15-30℃第四十三頁，共一百零一頁。兩性霉素B兩性霉素B(250ug/ml）兩性霉素B溶液是一種對真菌有抗菌活性的抗生素。將其作為一種抗真菌、抗酵母菌以及抗霉菌制劑使用，它通過與固醇結(jié)合、干擾敏感真菌的細(xì)胞膜滲透性。通常的有效濃度是2.5ug/ml。每ml兩性霉素B試劑可添加100ml細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品。保存條件：-20℃，避光保存，避免反復(fù)凍融

第四十四頁，共一百零一頁。慶大霉素、兩性霉素B慶大霉素（0.5mg/ml）、兩性霉素B（250ug/ml）慶大霉素/兩性霉素B溶液針對革蘭氏陰性和陽性菌以及真菌和酵母菌具備廣譜抗菌活性，它常被作為抗真菌、抗酵母菌、抗霉菌或抗細(xì)菌制劑。每ml慶大霉素、兩性霉素B試劑可添加100ml細(xì)胞培養(yǎng)基中使用保存條件：-20℃避免反復(fù)凍融，避光保存第四十五頁，共一百零一頁。青鏈霉素、兩性霉素B青霉素（10000u/ml）鏈霉素（10000ug/ml）兩性霉素B(25ug/ml）青霉素/鏈霉素/兩性霉素B針對革蘭氏陰性和陽性菌以及真菌和酵母菌具備廣譜抗菌活性，它常被作為抗真菌、抗酵母菌、抗霉菌或抗細(xì)菌制劑。每ml青鏈霉素、兩性霉素B可添加于100ml細(xì)胞培養(yǎng)基中使用保存條件：-20℃，避光保存，避免反復(fù)凍融第四十六頁，共一百零一頁。關(guān)于抗生素使用的建議由于細(xì)菌和酵母等的污染很容易觀察到，污染細(xì)胞的及時(shí)清理就大大減少了支原體、病毒的污染機(jī)會(huì)。潛在的支原體、病毒的污染會(huì)帶來很大的危害。這些微生物的存在會(huì)影響細(xì)胞的理化性質(zhì)，從而使研究者得到錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在嚴(yán)重的情況下，甚至使一個(gè)實(shí)驗(yàn)室數(shù)年的研究白白浪費(fèi)。由于過濾技術(shù)的提高和超凈臺(tái)質(zhì)量的改進(jìn)，在規(guī)范的細(xì)胞培養(yǎng)操作過程中引進(jìn)污染的機(jī)會(huì)已經(jīng)被大大降低了。所以比較合理的建議是，在常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)中不要使用抗生素。只有在培養(yǎng)污染源很多（比如組織培養(yǎng)），或者培養(yǎng)非常珍貴的細(xì)胞株時(shí)才使用抗生素。第四十七頁，共一百零一頁。細(xì)胞凍存液細(xì)胞凍存液由相應(yīng)培養(yǎng)基、特級胎牛血清和細(xì)胞培養(yǎng)級DMSO（二甲基亞砜）組成，經(jīng)過改良和優(yōu)化，產(chǎn)品含符合細(xì)胞凍存的獨(dú)特配方，保護(hù)細(xì)胞免收冰晶河溶質(zhì)損傷，能有效地提高復(fù)蘇細(xì)胞存活率和活力，助科研工作者擺脫程式繁瑣、操作復(fù)雜、微生物污染可能性高的凍存調(diào)配工作，專注于下游的研究。保存條件：-20℃，避免反復(fù)凍融第四十八頁，共一百零一頁。細(xì)胞凍存程序選擇指數(shù)生長期的細(xì)胞1000r/min5分鐘離心去上清，（貼壁細(xì)胞消化后離心，懸浮細(xì)胞直接離心）棄上清，用細(xì)胞凍存液混懸沉淀細(xì)胞，將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整到106-107個(gè)/ml分裝于凍存管中進(jìn)行程序降溫：4℃30min，-20℃30-60min，-80℃超低溫冰箱過夜后轉(zhuǎn)移到液氮罐內(nèi)，長期凍存。第四十九頁，共一百零一頁。細(xì)胞凍存的注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)凍存前確認(rèn)細(xì)胞未被污染，分析細(xì)胞系的可靠性。選擇合適的冷凍速度和冷凍溫度，以免在凍存過程中損傷細(xì)胞常溫條件下DMSO對細(xì)胞有毒副作用，故應(yīng)將凍存液在4℃條件下放置40-60min后使用。凍存管放入液氮罐時(shí)，小心液氮濺出。

第五十頁，共一百零一頁。細(xì)胞復(fù)蘇程序第五十一頁，共一百零一頁。

如何選擇培養(yǎng)基第五十二頁，共一百零一頁。

YOCON細(xì)胞培養(yǎng)基第五十三頁，共一百零一頁。第五十四頁，共一百零一頁。第五十五頁，共一百零一頁。第五十六頁，共一百零一頁。第五十七頁，共一百零一頁。第五十八頁，共一百零一頁。細(xì)胞或細(xì)胞系常用的培養(yǎng)基第五十九頁，共一百零一頁。細(xì)胞或細(xì)胞系常用培養(yǎng)基第六十頁，共一百零一頁。

YOCON細(xì)胞培養(yǎng)基生產(chǎn)工藝第六十一頁，共一百零一頁。細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品在流感病毒分離上的應(yīng)用流感病毒分離所需培養(yǎng)基及試劑DMEM(高糖，含L-谷氨酰胺，不含丙酮酸鈉）胎牛血清0.05%胰酶+0.02%EDTA青鏈霉素（10000u/ml，10000ug/ml）慶大霉素（50mg/ml）Hepes（1M）BSA(v)7.5%TPCK-胰酶（2mg/ml）HBSS

第六十二頁，共一百零一頁。相關(guān)試劑用量第六十三頁，共一百零一頁。病毒CPE反應(yīng)第六十四頁，共一百零一頁。病毒液的收獲當(dāng)75%～100%細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)進(jìn)行收獲，收獲之前可以將細(xì)胞放于-70℃冰箱，凍融1～2次，以提高收獲標(biāo)本的病毒滴度。即使無細(xì)胞病變也應(yīng)該于接種后第7天收獲。收獲病毒液時(shí)，先溫和搖動(dòng)細(xì)胞瓶數(shù)次，然后用10mL的無菌移液管吸取病毒液置于15mL無菌離心管中，混勻病毒。收獲的病毒液可以進(jìn)行紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)，如沒有紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，應(yīng)將收獲病毒培養(yǎng)液再M(fèi)DCK細(xì)胞傳代2-3次。如果有必要，可再通過血凝抑制實(shí)驗(yàn)鑒定分離物，并將分離物保存在-70℃或-70℃以下。第六十五頁，共一百零一頁。質(zhì)控及檢測能力先進(jìn)的檢測儀器標(biāo)準(zhǔn)的檢測操作流程每個(gè)批產(chǎn)品的監(jiān)測和留樣符合GMP標(biāo)準(zhǔn)的檢測環(huán)境第六十六頁，共一百零一頁。產(chǎn)品相關(guān)質(zhì)控方法出處pH依據(jù)中華人民共和國藥典2010年版二部附錄VIHpH測定法.無菌依據(jù)中華人民共和國藥典2010年版二部附錄XIH無菌檢查（2）直接接種法，進(jìn)行細(xì)菌真菌的檢測。內(nèi)毒素依據(jù)中華人民共和國藥典2010年版二部附錄XIE細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中凝膠半定量法，利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素。支原體檢測依據(jù)中華人民共和國藥典2010年版二部附錄ⅫB支原體檢查法中培養(yǎng)法第六十七頁，共一百零一頁。SP2/0毒性檢測依據(jù)《中國生物制品主要原輔料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)》中SP2/0生長曲線，倍增時(shí)間的測定滲透壓依據(jù)中華人民共和國藥典2010年版二部附錄IXG滲透壓摩爾濃度測定法中（1）測量溶液的冰點(diǎn)下降來間接測定其滲透壓摩爾濃度。凝膠電泳圖譜依據(jù)中華人民共和國藥典2010年版三部附錄F電泳法第四法聚丙烯酰胺凝膠電泳法。蛋白總量依據(jù)中華人民共和國藥典2010年版二部附錄ⅦM蛋白質(zhì)含量測定法第五法（考馬斯亮藍(lán)法Bradford）第六十八頁，共一百零一頁。為達(dá)到質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)采取的措施第六十九頁，共一百零一頁。細(xì)胞培養(yǎng)基類產(chǎn)品質(zhì)控項(xiàng)目第七十頁，共一百零一頁。培養(yǎng)基質(zhì)控項(xiàng)目第七十一頁，共一百零一頁。培養(yǎng)基質(zhì)控項(xiàng)目第七十二頁，共一百零一頁?？股禺a(chǎn)品質(zhì)控項(xiàng)目第七十三頁，共一百零一頁。緩沖液類產(chǎn)品第七十四頁，共一百零一頁。其他試劑質(zhì)控項(xiàng)目第七十五頁，共一百零一頁。其他試劑質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)第七十六頁，共一百零一頁。細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品使用常見問題匯總Hank's平衡鹽溶液(HBSS)要在空氣中使用，不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么？Hank's平衡鹽溶液(HBSS)和Earle's平衡鹽溶液(EBSS)有什么本質(zhì)的功能差別？

HBSS和EBSS的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,Eagles(2.2g/L)中比在Hanks(0.35g/L)中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2中，溶液會(huì)變堿，Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會(huì)變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Eagles液，。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲(chǔ)存的組織，用Hanks液就可以了。第七十七頁，共一百零一頁。為何培養(yǎng)基保存于4°C冰箱中，顏色會(huì)偏暗紅色，且pH值會(huì)越來越偏堿性？培養(yǎng)基保存于4°C冰箱中，培養(yǎng)基內(nèi)之CO2會(huì)逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenolred)的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果，將造成細(xì)胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時(shí)，可以通入無菌過濾之CO2，以調(diào)整pH值。

第七十八頁，共一百零一頁。L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？

L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時(shí)間后會(huì)降解，但是確切的降解率一直沒有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對于一些細(xì)胞具有毒性。第七十九頁，共一百零一頁。什么情況下要求培養(yǎng)基中不能含有酚紅？酚紅在培養(yǎng)基中用作批H值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測時(shí)，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。第八十頁，共一百零一頁。如何用臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞？

用無血清培養(yǎng)基把細(xì)胞懸液稀釋到200～2000個(gè)/毫升，在0.1毫升細(xì)胞懸液中加0.1

毫升0.4％的臺(tái)盼蘭溶液。輕輕混勻，數(shù)分鐘后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞?；罴?xì)胞排斥臺(tái)盼蘭，因而染成藍(lán)色細(xì)胞是死細(xì)胞。第八十一頁，共一百零一頁。鈣鎂離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時(shí)加入EDTA的目的是什么？鈣鎂離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前，用EDTA清洗細(xì)胞，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價(jià)離子.

第八十二頁，共一百零一頁。購買的細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因？

研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過程錯(cuò)誤。冷凍細(xì)胞解凍后，加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤。細(xì)胞置于–80°C太久。

第八十三頁，共一百零一頁。為什么大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)基中要含有丙酮酸鈉？丙酮酸鈉作為細(xì)胞培養(yǎng)的一種能源物質(zhì)。它往往被加到低葡萄糖組分的培養(yǎng)基中（1.0g/L葡萄糖），也有時(shí)添加到較高的葡萄糖配方中（4.5g/L)。提供細(xì)胞生長所需要的碳源，在沒有葡萄糖時(shí)，細(xì)胞可代謝丙酮酸鈉產(chǎn)生丙酮酸進(jìn)行能量合成。第八十四頁，共一百零一頁。培養(yǎng)細(xì)胞生長減慢的原因有哪些？其解決辦法有哪些？

答：可能得原因有：更換了不同的培養(yǎng)液或血清；培養(yǎng)液中一些細(xì)胞生長必需成分如谷氨酰胺或生長因子等耗盡或缺乏或已被破壞；培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染；試劑保存不當(dāng)；比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)找出可能的原因。解決辦法：增加起始培養(yǎng)細(xì)胞濃度；讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液；換入新鮮配制培養(yǎng)液；補(bǔ)加谷氨酰胺或生長因子等；用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄培養(yǎng)物，或用抗生素除菌；血清需保存在-5℃到-20℃；培養(yǎng)液需在2－8℃避光保存；含血清完全培養(yǎng)液在2-8℃保存，并在2周內(nèi)用完；分離培養(yǎng)物，檢測支原體。第八十五頁，共一百零一頁。細(xì)胞培養(yǎng)基偶然被凍，可否繼續(xù)使用？答：如果細(xì)胞培養(yǎng)基偶然被凍，您應(yīng)該自然溶解培養(yǎng)基并觀察是否有沉淀產(chǎn)生。如果沒有沉淀產(chǎn)生，培養(yǎng)基可以正常使用，如果出現(xiàn)沉淀，只能丟棄這些培養(yǎng)基。嚴(yán)格意義上要避免細(xì)胞培養(yǎng)基冷凍，會(huì)影響細(xì)胞培養(yǎng)。第八十六頁，共一百零一頁。HEPES在細(xì)胞培養(yǎng)過程中起什么作用？HEPES溶液：是一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，主要作用是防止培養(yǎng)基pH迅速變化。在開放式培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時(shí)可以維持pH7.0左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時(shí)要添加HEPES。第八十七頁，共一百零一頁。血清使用時(shí)一定需要滅活么？實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)過正確處理的熱滅活血清對大多數(shù)的細(xì)胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過的血清對細(xì)胞的生長只有微小的促進(jìn)，或完全沒有作用，甚至因?yàn)楦邷靥幚碛绊懥搜宓馁|(zhì)量，而造成細(xì)胞生長速率的降低。而經(jīng)過熱處理的血清，沉淀物的形成會(huì)顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是“小黑點(diǎn)”，常常會(huì)讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37℃環(huán)境中，又會(huì)使此沉淀物更增多，使研究者誤認(rèn)為是微生物的分裂擴(kuò)增。若非必須，可以不需要做熱處理這一步。不但節(jié)省時(shí)間，更確保血清的質(zhì)量。第八十八頁，共一百零一頁。培養(yǎng)液pH下降很快可能原因有哪些？其解決辦法是什么？通常細(xì)胞生長得非?？鞎r(shí)，pH值通常下降得很快。此時(shí)可以及時(shí)傳代、提高傳代比例或降低血清量等方法進(jìn)行解決。此外，培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊、NaHCO3

緩沖系統(tǒng)緩沖能力不夠、培養(yǎng)液中鹽濃度不正確、細(xì)菌、酵母或真菌污染等也能導(dǎo)致pH值通常下降得很快。（1）按培養(yǎng)液中NaHCO3濃度增加或減少培養(yǎng)箱內(nèi)CO2濃度，2.0g/L到3.7g/L濃度NaHCO3對應(yīng)CO2濃度為5％到10％。（2）改用不依賴CO2培養(yǎng)液。（3）松開瓶蓋1/4圈。加HEPES緩沖液至10到25mM終濃度。（4）在CO2培養(yǎng)環(huán)境中改用基于Earle′s鹽配制的培養(yǎng)液，在大氣培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)改用Hanks鹽配制的培養(yǎng)液。（5）如果是污染造成的則丟棄培養(yǎng)物或用抗生素除菌。第八十九頁，共一百零一頁。無血清培養(yǎng)基消化貼壁細(xì)胞時(shí)，用什么終止消化試劑反應(yīng)？

通常用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行貼壁細(xì)胞傳代時(shí)，可添加商品化的蛋白酶抑制劑或含有鈣鎂離子的商品化試劑進(jìn)行終止反應(yīng)。第九十頁，共一百零一頁。怎樣對病毒分離用的鼻咽拭子樣本進(jìn)行處理？

WHO規(guī)定用力將含有鼻咽拭子的采樣管置于漩渦振蕩器中進(jìn)行混合振蕩，振蕩后將鼻咽拭子貼緊采樣管內(nèi)壁進(jìn)行擠壓，將拭子含有的病毒采樣液全部擠壓到采樣管中，取出拭子，每ml采樣液中添加慶大霉素試劑（50mg/ml）0.2ml，室溫下放置15min，1000rpm，離心5min，取上清液200ul進(jìn)行接種，其余上清液-80℃凍存。第九十一頁，共一百零一頁。流感病毒陽性分離率低的原因？

采樣方法及部位（咽部后壁,用力采集）采集拭子（高采集率及高釋放率）采樣液（恒定的pH值，滲透壓，穩(wěn)定劑）運(yùn)送溫度（4℃）樣本處理（污染物，保存溫度）轉(zhuǎn)染率（轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞的數(shù)量）轉(zhuǎn)染的細(xì)胞狀態(tài)（MDCK細(xì)胞狀態(tài)差）病毒生長液（病毒生長液配制問題）第九十二頁，共一百零一頁。為什么分離普通流感病毒在細(xì)胞培養(yǎng)法中需添加TPCK-胰酶，而雞胚法不需要添加？維持液中加適量胰酶的目的是為了提高流感病毒在細(xì)胞中的復(fù)制能力。絕大多數(shù)流感病毒只有血凝素（H）是裂解型的才具有感染性。細(xì)胞培養(yǎng)不像雞胚，它的維持液中不含有蛋白水解酶，無法將病毒粒非裂解型的HA0變成裂解型的HA1+HA2。故必須在維持液中加入適量的胰酶。第九十三頁，共一百零一頁。細(xì)胞相關(guān)產(chǎn)品的英文名稱DMEM(Dulbecco'sModifiedEagleMedium)MEM(MinimumEssentialMedia)RPMI1640(RoswellParkMemorialInstitute1640)DMEM/F12(Dulbecco'sModifiedEagleMedium?Ham’sF12)第九十四頁，共一百零一頁。F10(Ham’sF10NutrientMixture)F12(Ham’sF12NutrientMixture)IMDM(Iscove’sModifiedDulbecco’sMedium)McCoy's5A(McCoy's5A)M199(Medium199)HBSS(Hanks'BalancedSaltSolution)第九十五頁，共一百零一頁。EBSS(Earle'sBalancedSaltSolution)PBS(PhosphateBufferedSaline)DPBS(Dulbecco'sPhosphateBufferedSaline)TrpsinwithEDTA(胰酶+EDTA)Trypanbluesolution(臺(tái)盼蘭溶液）Hepesbuffer（Hepes緩沖液）第九十六頁，共一百零一頁。SodiumBicarbonateSolution（碳酸氫鈉）CellCultureFreezingMedium（細(xì)胞凍存液）BSA(V)(BovineSerumAlbuminfractionV)Penicillin-Streptomycin(青鏈霉素）第九十七頁，共一百零一頁。AmphotericinB（兩性霉素B)Penicillin-Streptomycin-AmphotericinB(青鏈霉素、兩性霉素B)Gentamicin-AmphotericinB(慶大霉素、兩性霉素B）Gentamicin（慶大霉素）Waterforinjection(cellculture)（細(xì)胞培養(yǎng)級注射用水）第九十八頁，共一百零一頁。常見細(xì)胞系序號(hào)細(xì)胞系細(xì)胞類型種組織培養(yǎng)基1293成纖維細(xì)胞人胚胎腎MEM，10%滅活馬血清2IMR-90成纖維細(xì)胞人肺MEM，10%胎牛血清和NEAA3W1-38成纖維細(xì)胞人胚胎肺，3月妊娠MEM,10%胎牛血清4A549上皮細(xì)胞人肺癌F-12K，10%胎牛血清5A431上皮細(xì)胞人表皮細(xì)胞癌DMEM,10%胎牛血清6BHL-100