高級生物化學-氨基酸1課件

第2章氨基酸(aminoacids)蛋白質(Protein，pr)：是一切生物體中普遍存在的，由天然氨基酸按照一定的順序，通過肽鍵連接而成的一條或多條肽鏈構成的生物大分子；其種類繁多，各具有一定的相對分子質量，復雜的分子結構和特定的生物功能；是表達生物遺傳性狀的一類主要物質。一、蛋白質的化學組成和分類一般蛋白質含氮量平均為16%,即1份氮素相當于6.25份蛋白質,此即蛋白質系數(shù)。蛋白質的分類二、蛋白質的水解堿水解會降低蛋白質的營養(yǎng)價值酶解法（內切酶）酶解法（內切酶）酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶等。1、不同氨基酸的R基不同，R基決定了氨基酸的性質2、兼性離子→晶體溶點高→離子晶格，不是分子晶格。3、溶解性：一般都溶于水，不溶或微溶于醇4、介電常數(shù)高→水溶液中的氨基酸是極性分子。三、氨基酸的結構通式

基本氨基酸的分類-方式1按R基結構分類AliphaticAminoAcidsAromaticAminoAcids一氨基一羧基的氨基酸

Gly,Ala,Val,Leu,Ile,Ser.Thr,Cys,Met一氨基二羧基的氨基酸（酸性氨基酸）及酰胺:Asp,Glu.Asn,Gln二氨基一羧基的氨基酸（堿性氨基酸）:Arg,Lys(1)脂肪族氨基酸(2)芳香族氨基酸:Phe,Tyr,Trp(3)雜環(huán)族氨基酸：His,Pro（2）.側鏈含有羥基的氨基酸（2種）絲氨酸蘇氨酸Ser的-CH2OH基（pKa=15）在生理條件下不解離，但在大多數(shù)酶的活性中心都發(fā)現(xiàn)有Ser殘基存在。

Ser和Thr的-OH往往與糖鏈相連，形成糖蛋白。兩個半胱氨酸氧化可以形成胱氨酸（4）側鏈含有羧基或酰胺基的氨基酸（4種）

天冬氨酸側鏈為-羧基谷氨酸側鏈為-羧基天冬酰胺谷氨酰胺Asp和Glu它們是唯一在生理條件下帶有負電荷的的兩個

氨基酸（5）.側鏈含有堿性基團的氨基酸（3種）組氨酸賴氨酸精氨酸側鏈有咪唑環(huán)側鏈有-氨基側鏈有胍基它們是唯一在生理條件下帶有正電荷的的三個

氨基酸堿性氨基酸

Lys側鏈氨基的pKa為10.53，生理條件下，Lys側鏈帶有一個正電荷（—NH3+），側鏈的氨基反應活性增大。膠原蛋白中的Lys側鏈氧化時能形成很強的分子間(內)交聯(lián)。

Arg是堿性最強的氨基酸，側鏈上的胍基是已知堿性最強的有機堿，pKa值為12.48，生理條件下完全質子化。與NaOH相當

His是pKa值最接近生理pH值的一種（游離氨基酸中為6.00，在多肽鏈中為7.35），是在生理pH條件下唯一具有緩沖能力的氨基酸。His在酶的酸堿催化機制中起重要作用。它往往存在于許多酶的活性中心。

BasicAminoAcids組蛋白中較多乙酰-CoA羧化酶的組成上面的生物素輔基象一個擺臂丙酮酸脫氫酶復合體

R為芳香族基團的氨基酸三種芳香族氨基酸在紫外光區(qū)都吸收紫外光，在中性pH條件下，色氨酸和酪氨酸的紫外吸收峰在280nm，而苯丙氨酸的在260nm，大多數(shù)蛋白質中都含有色氨酸和酪氨酸或其中的一種，所以溶液中280nm吸收的測量常用來估算蛋白質的濃度。(7)雜環(huán)氨基酸：脯氨酸一種亞氨酸，具有固定的構型ProPro的α-亞氨基是環(huán)的一部分，因此具有特殊的剛性結構。一般出現(xiàn)在兩段α-螺旋之間的轉角處，Pro殘基所在的位置必然發(fā)生骨架方向的變化，按側鏈R基極性分類基本氨基酸的分類-方式2（1）不帶電荷的極性R基的aa：絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺（2）帶正電荷的極性R基aa（堿性aa）：賴氨酸，精氨酸，組氨酸（3）帶負電荷的極性R基aa（酸性aa）：天冬氨酸，谷氨酸1.非極性R基氨基酸，側鏈無極性甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，色氨酸、脯氨酸，2.極性R基氨基酸NonpolarAminoAcidsAnaminoacidisnonpolarwhentheRgroupisH,

alkyl(烷基),oraromatic(芳香族).AcidicandBasicAminoAcidsPositivelychargedatphysiologicalpHNegativelychargedatphysiologicalpHAnaminoacidisacidicwhentheRgroupisacarboxylic(羧基的)acid.basicwhentheRgroupisanamine.PolarChargedSideChains氨基酸的極性分類R-Groups氨基酸的親疏水性指數(shù)氨基酸的疏水性和蛋白質三維結構

思考：假設該序列只是大的球蛋白的一部分，下面氨基酸殘基中哪些可能分布在蛋白的外表面，哪些分布在內部？

天冬氨酸；異亮氨酸；蘇氨酸；纈氨酸；谷氨酰胺；賴氨酸

分析：分布在外表面的為極性和帶電荷的殘基：Asp、Gln和Lys；分布在內部的是非極性的氨基酸殘基：Try、Leu和Val；Thr盡管有極性，但疏水性也很強，因此，它出現(xiàn)在外表面和內部的可能性都有。氨基酸的疏水性和蛋白質三維結構思考：有一個蛋白質分子在pH7的水溶液中可以折疊成球狀，通常是帶極性側鏈的氨基酸位于分子外部，帶非極性側鏈的氨基酸位于分子內部。請回答：

（1）在Val、Pro、Phe、Asp、Lys、Ile和His中，哪些位于分子內部，哪些位于分子外部？

（2）為什么在球蛋白內部和外部都能發(fā)現(xiàn)Gly和Ala？

（3）Ser、Thr、Asn和Gln都是極性氨基酸，為什么會在分子內部發(fā)現(xiàn)？

（4）在球蛋白的分子內部和外部都能找到Gys，為什么？氨基酸的疏水性和蛋白質三維結構分析：（1）Val、Pro、Phe、Ile是帶有非極性測鏈的氨基酸，這些氨基酸殘基位于分子內部；Asp、Lys、His是帶有極性側鍵的氨基酸，這些氨基酸殘基位于分子的外部。

（2）因為Ala和Gly兩者的側鏈都比較小，疏水性和極性都??；Gly只有一個H＋與α–碳原子相連，Ala只有—CH3與α–碳原子相連，故它們既可以出現(xiàn)在分子內部，也可以出現(xiàn)在分子外部。

（3）Ser、Thr、Asn、Gln在

pH7.0時含有不帶電荷的極性側鏈，參與分子內部的氫鍵形成，從而減少了它們的極性，故會在分子內部發(fā)現(xiàn)。

（4）因為Cys屬于不帶電荷的極性氨基酸，可位于分子外部，但又由于Cys常常參與鏈內和鏈間的二硫鍵形成，使其極性減弱（少），F(xiàn)oldingproceedsviaintermediatesteps,formingmoltenglobule–whichisrefinedtominimumenergy(native)stateFreeenergydifferencebetweenfoldedandunfoldedstructureis~42kJ/mole(aboutthesameas1.5ATP)Becausefoldingiscooperative,onceaproteinbeginstofoldorunfold,theentireprocessiscompletedquickly.維持蛋白質三維結構或DNA雙螺旋最穩(wěn)定的因素是（？）疏水作用與蛋白質折疊基本氨基酸的分類-方式3Essential/Non-EssentialAminoAcids按氨基酸是否能在人體內合成分：（1）必需氨基酸：指人體內不能合成的氨基酸，必須從食物中攝取，有八種：Lys,賴氨酸、Trp,色氨酸、Met甲硫氨酸、Met苯丙氨酸、Val纈氨酸、Leu亮氨酸、Ile異亮氨酸、Thr蘇氨酸。（2）非必需氨基酸：指人體內可以合成的氨基酸。有十種。（3）半必需氨基酸：指人體內可以合成但合成量不能滿足人體需要（特別是嬰幼兒時期）的氨基酸，有兩種：組氨酸(His)、精氨酸(Arg)。OtheraminoacidderivativeI21st&22ndAAs含硒半胱氨酸只存在于含硒蛋白之中，而吡咯賴氨酸僅存在于一些真細菌和古細菌體內，作為與產(chǎn)甲烷代謝有關的某些酶的組分。2、不常見蛋白質氨基酸也稱修飾氨基酸，是在蛋白質合成后，由基本氨基酸修飾而來①胱氨酸（Cystine)廣泛地存在于蛋白質中。它由兩個半胱氨酸的巰基氧化之后形成的，形成二硫鍵。不常見蛋白質氨基酸及非蛋白質氨基酸：存在于生物體內，但不組成蛋白質的呈游離或結合態(tài)的氨基酸，約150種，具有多種生理功能。（1）L-α-氨基酸的衍生物L-瓜氨酸和L-鳥氨酸是合成精氨酸的中間產(chǎn)物。（2）D-α-氨基酸D-Ala存在于肽聚糖中，D-Phe是短桿菌肽S的組分（3）β、γ、δ-氨基酸β-Ala是泛酸的前體，γ-氨基丁酸是傳遞神經(jīng)沖動的化學介質。

3、非蛋白質氨基酸真核生物中的D型氨基酸

1990年以后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)哺乳動物體內大量存在D-Ser,D-Asn。D-Ser在大腦前葉中與谷氨酸受體(NMDA受體)的分布一致，能激活NMDA受體，與學習記憶有關。而D-Asn則在大鼠的所有組織中都有分布，可能與成熟有關。五、氨基酸的酸堿性質（一）、氨基酸的解離

兼性(兩性)離子：指在同一分子上帶有能釋放質子的正離子基團和能接受質子的負離子基團。兼性離子本身既是酸又是堿。因此它既可以和酸反應，也可以和堿反應。①晶體溶點高→離子晶格，不是分子晶格。②不溶于非極性溶劑→極性分子。③介電常數(shù)高→水溶液中的氨基酸是極性分子氨基酸的解離零電荷氨基后解離羧基先解離酸性環(huán)境

中性環(huán)境

堿性環(huán)境完全質子化的氨基酸甘氨酸的解離曲線正電荷越？負電荷越？pKa值pKa值pKa值甘氨酸的解離曲線pKa值pKa值正電荷越？負電荷越？甘氨酸的解離曲線得出信息

在pH2.34和pH9.60處，Gly具有緩沖能力。

起點：100%Gly+

凈電荷：+1第一拐點：50%Gly+

，50%Gly±平均凈電荷：+0.5

pH=pK+lg[Gly±]/[Gly+]=pK1=2.34第二拐點：100%Gly±

凈電荷：0等電點pI第三拐點：50%Gly±，50%Gly-

平均凈電荷：-0.5

pH=pK2+lg[Gly-]/[Gly±]=pK2=9.6終點：100%Gly-凈電荷：-1pKa值pKa值氨基酸的解離--pKa值(1)、α-COOH(羧基)

pK值在2.0左右，當pH>3.5，

α-COOH以α-COO-形式存在。

(2)α-ΝΗ2（氨基）pK值在9.4左右，當pH<8.0時，

α-ΝΗ2以α-ΝΗ3+

形式存在。pKa值就是指某種解離基團有一半解離時的pH值,pK值的大小可以表示解離基團酸性的強弱,pK值小則酸性強。在pKa時緩沖能力最強氨基酸解離的PKaHis是唯一具有近中性pKa基團(imidazole)的氨基酸氨基酸氨基和羧基的解離和PKa值當溶液的pH值在3.5-8.0范圍內時，氨基酸是兩性離子（偶極離子）存在,為什么?熔點：氨基酸的熔點一般都比較高，一般都大于200℃，超過熔點以上氨基酸分解產(chǎn)生胺和二氧化碳。Henderson-Hasselbalch方程式氨基酸和相應脂肪酸（胺）解離比較氨基酸pKa比脂肪酸的-COOH的pKa（一般為4—5）,小氨基酸pKa脂肪胺中的--NH3+的pKa（一般為10—11）.小自由氨基酸的pK要比肽中C端的羧基的pK小.自由氨基酸的pK要比肽中N端的氨基的pK大，-e++

氨基酸解離程度取決于所處溶液的酸堿度。1、氨基酸的等電點(isoelectricpoint,pI)：指氨基酸的正離子濃度和負離子濃度相等時的溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點,用符號pI表示

(或使氨基酸凈電荷為零時溶液的pH值)。氨基酸的等電點和計算K1=[Gly±][H+][Gly+]K2=[Gly-][H+][Gly±]pI時，[Gly+]=[Gly-][Gly±][H+]K1=[Gly±]K2[H+][H+]2=K1K2pH=（pK1+pK2）/2pI=（pK1+pK2）/2pI=（2.34+9.60）/2=5.97Gly等電點的計算：中性氨基酸：以Gly為例由此可知:

等電點相當于該aa兩性離子狀態(tài)兩側

基團pK值之和的一半。即：等電點pH值與離子濃度無關，只取決于兼性離子兩側基團的pK值。氨基酸的等電點酸性氨基酸，以Asp為例：pK1-COOH=2.2pK2–NH3+=9.0pK3-Rgroup=10.5pI=(pK2+pK3)/2pI=(9+10.5)/2pI=9.75堿性氨基酸，以Lys為例：酸性氨基酸，以Glu為例：谷氨基的兩性離子兩邊的pK值的平均值：pI=(2.19+4.25)/2=3.22總結1.酸性氨基酸的等電點在3左右2.中性氨基酸的等電點在6.5左右3.堿性氨基酸的等電點在10左右1.在PH值=3時上述三種氨基酸各帶什么電荷？當PH值分別等于6或7呢？2.PH小于（或大于）等電點，等電點越大可能帶的正電荷越―？等電點越小帶的正電荷越―？3.等電點不同，在同一PH值時所帶電荷不同氨基酸等電點計算問題1：把一個氨基酸結晶加入pH7.0的純水中，得到pH6.0的溶液，此氨基酸的pI值是大于6.0？小于6.0?還是等于6.0？（小于6.0）

問題2：

血液pH=7.35—7.45,哪一種氨基酸在血液保持pH穩(wěn)定方面起重要的緩沖作用？為什么？pH6.0氨基酸等電點思考晶體PH=7PH小于7加酸H+H+PH大于7H+加堿問題1：把一個氨基酸結晶加入pH7.0的純水中，得到pH6.0的溶液，此氨基酸的pI值是大于6.0？小于6.0?還是等于6.0？（小于6.0）H+H+PHPHLyslysCOOHNH２LyslysCOO－LyslysCOO－LyslysNH２COO－+3+2+10氨基酸等電點思考Lys--lys--lysCOOHLys--lys--lysCOO－Lys--lys--lysNH２Lys--lys--lysNH２COO－COO－思考題保留三分之一+

2、氨基酸在等電點的特點：（b）等電點時緩沖能力最?。╟）蛋白質等電點時溶解度最小。蛋白質等電點沉淀

思考：蛋白質的等電點和等離子點（a）甲醛滴定法在一般情況下，α?NH3

+在pH12-13時才能出現(xiàn)解離，一般的指示劑則難以指示。加入過量甲醛，滴定過程中降低了氨基的堿性。使滴定曲線向低pH=9轉移。甲醛滴定法應用：氨基酸定量分析—甲醛滴定法（間接滴定）

A.與甲醛反應，滴定終點在9左右，可用酚酞作指示劑。

B.

釋放一個氫離子，相當于一個氨基（摩爾比1：1）

試題：將400ml的丙氨酸溶液調到pH8.0，然后向該溶液中加入過量的甲醛，所得的溶液用NaOH反滴定到pH8.0，消耗0.2mol/L的NaOH溶液250ml。問，在起始的溶液中丙氨酸為多少克？（丙氨酸的分子量按89計）（６分）

2003年廈門大學

蛋白質分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側鏈中某些基團，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負電荷或正電荷的基團。在蛋白質分子中，游離的α-NH2和α—COOH相距較遠，靜電引力減弱，故：

a末端的α—NH2的pK′值減少

b末端的α—COOH的pK′值增大蛋白質的兩性電離蛋白質的等電點(isoelectricpoint,pI)

當?shù)鞍踪|溶液處于某一pH時，蛋白質解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質的等電點。在等電點時蛋白質的溶解度最小，在電場中不移動。蛋白質的等電點(isoelectricpoint,pI)

pH=pI時，蛋白質凈電荷為零，蛋白質分子在電場中不移動pH＞pI時，蛋白質凈電荷為負，蛋白質分子在電場中向陽極移動pH＜pI

時，蛋白質凈電荷為正，蛋白質分子在電場中向陰極移動在pI時，蛋白質失去了膠體的穩(wěn)定條件，即沒有相同電荷相互排斥的作用。所以不穩(wěn)定，溶解度最小，易沉淀。蛋白質的等電點在有中性鹽存在下可以發(fā)生明顯的變化，原因是蛋白質分子中某些解離基團與中性鹽中的離子相結合。蛋白質的等電點在一定程度上決定于介質中離子的組成。

等離子點（isoionicpoint）：沒有其它鹽類干擾時，蛋白質質子供體基團解離出來的質子數(shù)與質子受體基團結合的質子數(shù)相等時的pH稱為等離子點(蛋白質的等離子點：指在純水中（即沒有其它鹽類存在）蛋白質的正離子數(shù)等于負離子數(shù)的pH值。)蛋白質的等離子點（特征常數(shù)）

核酸的酸堿性質

核酸的磷酸基具有酸性，堿基具有堿性，因此，核酸具有兩性電離的性質。但核酸中磷酸基的酸性大于堿基的堿性，其等電點偏酸性。

DNA的pI約為4～5，

RNA的pI約為2.0～2.5，在pH7～8電泳時泳向正極。電泳點樣在負極胞嘧啶核苷酸的解離123六、氨基酸的化學性質1).α-NH2參與的反應

(1).茚三酮的顏色反應(2).成肽反應2).α-COOH參與的反應

(1).與亞硝酸反應(2).與甲醛反應(3).酰化反應

(4).烷化反應(5).希夫反應3).由α-氨基與羧基共同參與的反應

(1).成鹽反應(2).成酯反應(3).酰鹵化反應

(4).脫羧反應(5).疊氮反應4).氨基酸的側鏈基團的反應（一）

α-羧基參與的反應成鹽、成酯后羧基的化學反應性能被保護，而氨基的化學反應性能得到加強或說氨基被活化，易與?；驘N基結合。為什么氨基酸的?；蜔N基化在堿性溶液中進行？1、成酯和成鹽反應：

Hcl

α-羧基參與的反應用途：這是使氨基酸羧基活化2、形成酰鹵的反應3、成酰胺反應氨基酸的氨基與酰氯或酸酐在弱堿溶液中發(fā)生作用時，氨基即被?；?。例如與芐氧（苯甲氧）甲酰氯反應。1、與?；噭┓磻ǘ產(chǎn)-氨基參與的反應?；噭┳饔糜猛荆菏氰b定多肽N-端aa和aa順序的重要方法。2.烴基化反應-Edman試劑反應3、形成西佛堿（Schiff）反應氨基酸的α-氨基能與醛類反應生成弱堿，這個弱堿叫西佛堿（Schiff’sbase).西佛堿是某些酶促反應的中間產(chǎn)物（如轉氨基反應的中間產(chǎn)物）。

思考：有兩種重要的具維生素組分的輔酶。它們在酶促反應中都具穩(wěn)定碳陰離子中間物的作用。請講出這兩種輔酶和對應的維生素的名稱，及它們參與催化的主要反應（TPP和PLP）

Effectiveelectronsinks.Pyridoxalphosphate(PLP)stabilizescarbanionic碳負離子

intermediatesbyservingasanelectronsink.Whichotherprostheticgroupcatalyzesreactionsinthisway?（Thiaminepyrophosphate.TPP）electronsinks上海交通大學電子穴（電子陷阱）電子穴（電子陷阱）PLP做電子受體脫氨基脫羧基碳負離子醌型electronsinks（三）．α-氨基和羧基共同參與的反應茚三酮反應

所有氨基酸及具有游離α-氨基的肽與茚三酮反應都產(chǎn)生藍紫色物質，只有脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應產(chǎn)生黃色物質。應用：氨基酸定性和定量分析

茚三酮反應應用：氨基酸定性和定量分析（光吸收法和測壓法）

注意：所有α—氨基酸及一切蛋白質都能和茚三酮反應生成藍紫色物質。β-丙氨酸、氨和許多一級胺都呈陽性反應雖然蛋白質和氨基酸均有茚三酮反應，但能與茚三酮呈陽性反應的不一定就是蛋白質或氨基酸茚三酮反應的修改李紹軍,郭藹光,梁宗鎖,生化教材中關于脯氨酸與茚三酮反應描述的修改建議，生命的化學，2005(6):509-510⑴脯氨酸是亞氨基酸，沒有具α-氨基的氨基酸酸性茚三酮反應。⑵脯氨酸可以與茚三酮反應，在酸性條件下生成的直接產(chǎn)物是紅色的，最大吸收峰值是520nm。⑶脯氨酸與酸性茚三酮在有氰化物存在時反應產(chǎn)物是黃色或橙黃色，最大吸收值是440nm；⑷脯氨酸與茚三酮在堿性條件下生成不穩(wěn)定的黃色產(chǎn)物。2、成肽反應體內的成肽反應如何？(四)氨基酸的側鏈基團的反應氨基酸的側鏈基團的反應氨基酸的側鏈基團的反應(續(xù))氨基酸的側鏈基團的反應pauly反應His+重氮苯磺酸紅色（棕紅色）Tyr+重氮苯磺酸橘黃色

Folin一酚反應+磷鉬酸Tyr磷鎢酸orTrp藍色（鉬藍與鎢藍混合物）氨基酸的側鏈基團的反應斷開二硫鍵氧化法還原法烷基化試劑保護巰基乙醇二硫蘇糖醇過甲酸五、氨基酸的光學性質和光譜性質（一）、氨基酸的旋光性和立體化學氨基酸的構型也是與甘油醛構型比較而確定的氨基酸的旋光性和立體化學1、除R=H的甘氨酸外，其他19種基本氨基酸a－碳原子均有不對稱碳原子，有D-型和L－型兩種異構體，因而是光學活性物質，構成蛋白質的氨基酸除Gly外均為L-型異構體。2.Thr和Ile有四種光學異構體。3、氨基酸的旋光性（符號和大?。┤Q于它的R基的性質，并與溶液的PH值有關。比旋光度是氨基酸的重要物理常數(shù)之一，是鑒別各種氨基酸的重要依據(jù)。

氨基酸的旋光性氨基酸的旋光性（符號和大?。┤Q于它的R基的性質，并與溶液的PH值有關。比旋光度是氨基酸的重要物理常數(shù)之一，是鑒別各種氨基酸的重要依據(jù)。外消旋物：D-型和L-型的等摩爾混合物。內消旋物：分子內消旋物質的構型1.手性碳的D型和L型：如單糖、氨基酸和磷脂2.

雙鍵的順式與反式：肽鍵和脂肪酸中的雙鍵3.單糖醛基環(huán)化后的α和β型，后者又聯(lián)系嘧啶或嘌呤堿糖苷鍵的β型多是順式糖的旋光性和構型α和β嘧啶或嘌呤堿糖苷鍵的β型糖的D型和L型旋光性和構型1.肽鏈中的肽鍵一般是反式構型，2.天然存在的已醛糖都是D型的3.天然氨基酸為多L型4.戊糖與嘧啶或嘌呤堿以C-N糖苷鍵連接就稱為核苷，β型糖苷鍵,堿基與糖環(huán)平面互相垂直，反式存在。Originofaminoacidhomochirality

TamuraK.Molecularhandednessoflife:significanceofRNAaminoacylation.JBiosci.2009,34(6):991-4.（二）氨基酸光譜性質氨基酸紫外吸收性質蛋白質中的熒光主要來自：酪氨酸和色氨酸

氨基酸的一個重要光學性質是對光有吸收作用，20種蛋白質氨基酸在可見光區(qū)域均無光吸收,在遠紫外區(qū)(220nm)均有光吸收,在紫外區(qū)(近紫外區(qū))(220nm—300nm)只有三種氨基酸有光吸收能力六、氨基酸的分離分析(一).

層析法(chromatography)

–分配柱層析–紙層析–薄層層析–離子交換層析法(二).

電泳法(Electophy)(三).

氣相色譜法(四).

高效液相層析(一).層析法(chromatography)層析法分類1、原理：組成層析系統(tǒng)的固定相和流動相具有相反的極性。被分析的樣品（如aa混合物）中的各組分依據(jù)其自身極性的強弱，與此兩相的親和力不同。與固定相親和力大者，易留滯于原地，與流動相親和力大者，易隨流動相移動，因而達到分離的目的。（一）.分配層析分配定律：當一種溶質在兩種一定的互不相溶的溶劑中分配時，在一定的溫度下達到平衡后，溶質在兩相中的濃度比值為一常數(shù)。即分配系數(shù)（kd）。分離的先決條件：各種AA成分的分配系數(shù)有差異，差異越大，越容易分開。分配層析分配層析的原理：逆流分配固定相流動相48362720.5

分離的先決條件：各種AA成分的分配系數(shù)有差異，差異越大，越容易分開。固定相流動相646464646464166464646448分配系數(shù)：3:1分配層析的原理：逆流分配固定相流動相166464646448166464646448644646464123612分配層析的原理：逆流分配固定相流動相4126464641241264646412641646496183363627分配層析的原理：逆流分配分配層析的原理：逆流分配固定相流動相1696464316964643640.25646.756.752.256.750.75181820.25272720.25分配層析的原理：逆流分配固定相流動相0.252.256.756.75640.750.252.256.756.75640.75640.065.16.83.40.752.250.196.756.7510.120.2520.2520.220.2520.2515.2分配層析的原理：逆流分配固定相流動相646464646464326464646432分配系數(shù)：1:1分配層析的原理：逆流分配固定相流動相326464646432161664646416分配系數(shù)：1:13216分配層析的原理：逆流分配固定相流動相412124644412124644642281288212121212128442分配層析的原理：逆流分配固定相流動相64/64646464646432/166464646432/48A物質B物質分配層析的原理：逆流分配固定相流動相64/64121246444121246446422812882121212/10.112128

/20.2442分配層析的原理：逆流分配若是逆流分溶或逆流分配，當轉移n次后，某一物質在（n+1）個管中分布的分數(shù)含量是（p+q)n=1展開式的相應項的值。這里p和q分別為某一物質在靜相和動相中的分數(shù)含量，即p+q=1。例如物質Y的Kd=q(動相)/(靜相)p=1即:p+q=1/2+1/2=1轉移n次后,在第k號管中某一物質的含量可由下式計算:

n！·pn-k+1·qk-1Tn,k=———————————（n-k+1）！·（k-1）！2分配柱層析3、紙層析原理：紙層析法屬于分配層析。紙層析法是用濾紙作為惰性支持物的分配層析法。纖維素吸附的水為固定相，有機溶劑為流動相。當有機溶劑沿濾紙流動時，層析點中的物質就會在有機相和水相中進行分配，其中部分溶質隨有機相的不斷流動進入水相，或從水相進入有機相，如此進行反復的分配，由于不同物質的分配系數(shù)不同、移動速度不同因而得以分離。相對遷移率Rf

Rf主要與R基的極性有關，溶劑的pH可影響R基的極性，氨基酸與濾紙的吸附作用也影響Rf。在流動相中分配系數(shù)越大，移動越快。預測在以苯酚-甲酚-水為展層劑利用紙層析分離下列氨基酸時Rf值大小順序：

（1）Ala、Leu、Ser（2）Val、Gly、GluR基的疏水性雙向紙層析圖4、薄層層析4．離子交換層析

原理：分離氨基酸時，用離子交換樹脂作為支持物，利用離子交換樹脂上的活性基團與溶液中的離子進行交換反應，由于各種離子交換能力不同，與樹脂結合的牢固程度就不同，在洗脫過程中，各種離子以不同的速度移動，從而達到分離的目的。離子交換層析，利用氨基酸的兩性游離性質，在某一特定PH時，各氨基酸的電荷量及性質不同，故可以通過離子交換層析得以分離。

氨基酸與樹脂的親和力:取決于它們之間的（1）靜電吸引和（2）氨基酸側鏈與樹脂基質之間的疏水相互作用.洗脫順序主要與各種離子所帶電荷有關，在電荷相同時，與極性、非極性有關。

離子交換層析

陽離子交換樹脂-負電荷+++陰離子交換樹脂-正電荷---氨基酸離子交換層析陽離子交換樹脂-負電荷+++陰離子交換樹脂-正電荷---氨基酸+氨基酸PH=3PH=7PH=10氨基酸-PH？離子交換層析陽離子交換樹脂-負電荷陰離子交換樹脂-正電荷---1.氨基酸+1.PH=32.PH=73.PH=102.氨基酸+3.氨基酸+離子交換層析陽離子交換樹脂-負電荷陰離子交換樹脂-正電荷---1.氨基酸+1.PH=32.PH=73.PH=102.氨基酸+3.氨基酸+氨基酸（-）PH？離子交換樹脂離子交換樹脂可以分為陽離子交換樹脂（如羧甲基纖維素等）和陰離子交換樹脂（如二乙基氨基乙基纖維素等）。

(1)陽離子交換樹脂:供交換的是陽離子,樹脂帶負電荷

(2)陰離子交換樹脂:可供交換的是陰離子，樹脂帶正電荷陰離子交換樹脂洗脫順序+洗脫方法：（1）改變PH值（改變離子電荷）或（2）增加離子濃度（競爭作用）.陰離子樹脂：降低PH，則陽離子樹脂升高PH

陰離子樹脂（+）洗脫順序：容易帶正電荷早洗脫（堿性氨基酸），其次中性aa，最后酸性aa氨基酸的洗脫氨基酸與樹脂上解離基團之間的靜電引力氨基酸與樹脂基質聚苯乙烯之間的疏水作用習題舉例（1）在PI=6時，用陽離子交換柱層析分離Lys、His和Leu的氨基酸的洗脫順序（2）在PI=8時，用陰離子交換柱層析分離Glu、Arg和Val的氨基酸的洗脫順序陽離子交換樹脂洗脫順序（aa帶正電荷）酸性aa中性aa堿性aa陰離子交換樹脂洗脫順序（aa帶負電荷）先后先后堿性aa中性aa酸性aa（中國科技大學2002）習題舉例

有一種蛋白質水解物,在pH6時,用陽離子交換柱層析分離,第一個被洗脫的氨基酸是()

A.Val(pI5.96)B.Lys(pI9.74)C.Asp(pI2.77)D.Arg(pI10.76)E.Tyr(pI5.66)用強酸型陽離子交換樹脂分離下述每對氨基酸，當用pH7.0的緩沖液洗脫時，下述每對中先從柱上洗脫下來的是哪種氨基酸?

①天冬氨酸和賴氨酸；②精氨酸和甲硫氨酸；⑧谷氨酸和纈氨酸;④甘氨酸和亮氨酸；⑤絲氨酸和丙氨酸。習題舉例解答：用離子交換樹脂分離核苷酸主要是根據(jù)它們與樹脂上相反電荷的靜電結合力的

不同以及核苷酸疏水的堿基環(huán)與樹脂骨架之間非極性吸附力的差異。本來，用陽離子交換樹脂分離這四種核苷酸時，按照它們解離的差異，應該是AMP在CMP之前被洗脫下來。但是，由于嘌嶺環(huán)比嘧啶環(huán)同交換樹脂的非極性吸附力大三倍，抵消了它們之間的電荷差異，故出現(xiàn)上面的冼脫順序。思考：用陽離子交換樹脂分離核苷酸時，核苷酸被洗脫的先后順序是UMP→GMP→CMP→AMP而不是UMP→GMP→AMP→CMP。為什么?

氨基酸的疏水性質的應用pH3.5時各核苷酸所帶電荷

陰離子交換樹脂柱洗脫順序（+）-1-0.95-0.46-0.16UMPGMPAMPCMP實際洗脫順序CMP>AMP>UMP>GMP電荷之間作用力相似，嘌呤疏水引力大（難洗脫）UMPGMPAMPCMP電荷小大大小陰離子交換樹脂疏水作用（三）、電泳電泳（electrophoresis）：帶電粒子在電場的作用下，向它所帶的電荷相反方向泳動的現(xiàn)象稱為電泳。氨基酸在pH高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負極移動。電泳SeparationofAminoAcidsWithanelectriccurrent,amixtureoflysine,aspartate,andvalineareseparated.

pH<pI,樣品帶正電荷，樣品點向陰極移動

pH>pI,樣品帶負電荷，樣品點向陽極移動

pH=pI,樣品不帶電荷，樣品點不移動電泳SeparationofAminoAcids分離氨基酸混合物常用紙電泳。

有一種蛋白質水解物,在pH=6時,用電泳分離,怎樣控制PH值使氨基酸有效分離？點樣應該點在什么位置？（1）A.Lys(pI9.74)B.Asp(pI2.77)C.Tyr(pI5.66)（2）A.Val(pI5.96)B.Arg(pI10.76)C.Lys(pI9.74)氨基酸電泳分離時電荷一樣為什么移動距離不同？思考題1、有一個某種溶液中含有三種三肽：Tyr-Arg-Ser,

Glu-Met-Phe和Asp-Pro-Lys,α-COOH基團的

pKa為3.8;α-NH3基團的pKa為8.5。在哪種pH（2.0,

6.0或13.0）下，通過電泳分離這三種多肽的效果最好？

答：pH=6.02、有一混合蛋白質溶液，各種蛋白質的pl為4.6；5.0；5.3；6.7；7.3。電泳時欲使其中4種泳向正極，緩沖液的pH應該是：（D）

A．5.0B.4.0C.6.0D.7.0E.8.0

基本氨基酸其他分類方式1、必需氨基酸：借一兩本淡色書來2、參與尿素合成的氨基酸：精氨酸、天冬氨酸基本氨基酸其他分類方式4、產(chǎn)生一碳單位：

甘氨酸、絲氨酸、組氨酸、色氨酸，蛋氨酸3.轉變成糖或脂肪

生糖氨基酸生酮氨基酸：亮氨酸、賴氨酸生糖兼生酮氨基酸：

苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、異亮氨酸5、糖代謝產(chǎn)物直接轉氨基產(chǎn)生的氨基酸：丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸（也可還原產(chǎn)生）基本氨基酸其他分類方式6、血液中轉運氨的氨基酸:谷氨酰胺和丙氨酸7、不能直接轉氨基的氨基酸：Gly、Lys、Thr、Pro8、蛋白質中的熒光主要來自：酪氨酸和色氨酸9、參與核苷酸合成的氨基酸基本氨基酸其他分類方式10、蛋白質中參與結合金屬離子的氨基酸：

半胱氨酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸羧肽酶A一、蛋白質的概述蛋白質(Protein，pr)

：是一切生物體中普遍存在的，由天然氨基酸按照一定的順序，通過肽鍵連接而成的一條或多條肽鏈構成的生物大分子；其種類繁多，各具有一定的相對分子質量，復雜的分子結構和特定的生物功能；是表達生物遺傳性狀的一類主要物質。第4章蛋白質的共價結構

P43（一）、蛋白質的元素組成一般蛋白質含氮量平均為16%,即1份氮素相當于6.25份蛋白質,此即蛋白質系數(shù)。蛋白質含氮量分析（二）、蛋白質的分類球蛋白（globulins）：不溶于水而溶于稀鹽、稀酸和稀堿溶液，能被半飽和硫酸銨所沉淀。普遍存在于生物體內，如血清球蛋白、肌球蛋白和植物種子球蛋白等B根據(jù)蛋白質形狀的分類2.球狀蛋白質、球狀和球蛋白？1.根據(jù)分子形狀的不同，可將蛋白質分為球狀蛋白質和纖維狀蛋白質兩大類，要注意球狀蛋白質不等于球蛋白。球蛋白是按溶解度分類的一類蛋白質﹡單體蛋白質：僅含一條多肽鏈。牛核糖核酸酶：一條多肽鏈﹡多聚蛋白質：含兩條或多條多肽鏈。胰島素：兩條（兩種）多肽鏈血紅蛋白：四條（兩種）多肽鏈

C.按多肽鏈條數(shù)分類胰島素多聚蛋白質為什么可以多聚？血紅蛋白和肌紅蛋白誰的疏水氨基酸更多？體積大的球狀蛋白質疏水氨基酸比例在增加還是減少？（三）、蛋白質的結構層次蛋白質的結構層次1.一級結構：指蛋白質分子中的氨基酸的排列順序。2.二級結構：指蛋白質多肽鏈的主鏈骨架中的若干肽段的構象，排列。所有蛋白質的主鏈結構相同，長短不同。3.三級結構；指多肽鏈在二級結構的基礎上，各原子的空間排布，包括側鏈基團的取向，是二級結構的基礎上范圍更廣的盤旋和折疊。4.四級結構：是指多條肽鏈組成的一個蛋白質分子時，各亞單位在寡聚蛋白質中空間排布及亞單位間的相互作用（四）、蛋白質的生物學重要性蛋白質是生物體重要組成成分分布廣含量高2.蛋白質具有重要的生物學功能

1）催化生物化學反應（酶）

2）結構成分(結締組織的膠原蛋白、皮膚的彈性蛋白、膜蛋白)

3）貯藏（卵清蛋白、種子蛋白）

4）物質運輸（血紅蛋白、脂蛋白、電子傳遞體）

5）細胞運動（肌肉收縮的肌球蛋白、肌動蛋白）

6）激素功能（胰島素）

7）防御功能（抗體、血凝蛋白）

8）接受傳遞信息（受體蛋白、味覺蛋白）

9）調節(jié)細胞生長、分化和遺傳信息的表達（阻遏蛋白）3.氧化供能二、肽（peptide）和肽鍵(peptidebond)（一）、肽和肽鍵的結構和命名

肽是由一個氨基酸的-羧基與另一個氨基酸的-氨基脫水縮合而形成的無分支線形聚合物。其中的氨基酸單位稱氨基酸殘基。氨基酸間縮水形成的共價鍵稱肽鍵肽鏈中的氨基酸在參加肽鍵形成時失去了1分子水，已經(jīng)不是原來完整的分子，稱為氨基酸殘基。氨基酸殘基的平均分子量為：110或120。肽氨基酸借肽鍵連接的分子叫肽：

1）兩個氨基酸組成的肽叫二肽；

2）三個氨基酸組成的肽叫三肽；

3）多個氨基酸組成的肽叫多肽；

4）氨基酸借肽鍵連成長鏈，稱為肽鏈，肽鏈兩端有

自由-NH2和-COOH，自由-NH2端稱為N-末端（氨基

末端），自由-COOH端稱為C-末端（羧基末端）；

5）構成肽鏈的氨基酸已殘缺不全，稱為氨基酸殘基；

6）肽鏈中的氨基酸的排列順序，一般-NH2端開始，由N指

向C，即多肽鏈有方向性，N端為頭，C端為尾。二肽沒有雙縮尿反應肽的寫法肽鍵的結構特點：

C-N：

0.149nm

肽鍵：0.132nm

C=N：0.127nm（1）酰胺氮上的孤對電子與相鄰羰基之間形成共振雜化體。（2）肽鍵具有部分雙鍵性質，不能自由旋轉。肽鍵比一般

C-N鍵短（3）肽鍵具有平面性，組成肽鍵的4個原子和2個

Cα幾乎處在同一平面內（酰氨平面）。（4）肽鍵亞氨基在pH014內不解離。（5）肽鏈中的肽鍵一般是反式構型，而Pro的肽鍵可能出現(xiàn)順、反兩種構型．肽鍵的結構特點肽鍵的紫外吸收 210～230nm

蛋白質溶液在238nm處的光吸收的強弱,與肽鍵的多少成正比。相關名詞-肽單元肽單元：參與肽鍵的6個原子被約束于一個平面上，與此相應的-Cα-CO-NH-Cα-則稱為肽單元。一個氨基酸相關名詞-多肽主鏈多肽主鏈：在多肽鏈中由肽鍵連接的各氨基酸殘基形成的長鏈骨架為多肽鏈的主鏈?；颍弘逆湹墓歉墒怯呻膯卧貜团帕卸砷L鏈，稱為主鏈。長鏈骨架N-C-C-N-C-C-N-C-C1、肽的晶體是離子晶格，溶點高。2、旋光性：一般短肽的旋光度等于其各個氨基酸的旋光度的總和，長肽不等于。3、具有兩性解離和等電點：肽的酸堿性質－－決定于末端α-氨基和α-羧基及R基。在長肽或蛋白質中，可解離的基團主要是側鏈基團。肽中C端的羧基的pK要比自由氨基酸的pK大.肽中N端的氨基的pK要比自由氨基酸的pK小，酸性強了

R基的解離和氨基酸差不多。（二）、肽的物理和化學性質氨基酸和肽解離比較自由氨基酸的pK要比肽中C端的羧基的pK小.自由氨基酸的pK要比肽中N端的氨基的pK大，-e+++-肽的兩性解離和肽的等電點ComparingthepKaValuesofAlanineandPolyalanineAminoacidorpeptidepK-cooHpK2-NH3+Ala2.349.69Ala–Ala3.128.30Ala–Ala–Ala3.398.03Ala–(Ala)n–Ala,n大于43.427.94Thetitrationofdi-,tri-,andlargeroligopeptidesofalaninealsoshowstheionizationofonlytwofunctionalgroups,althoughtheexperimentalpKavaluesaredifferent.ThetrendinpKavaluesissummarizedinthetable.肽的物理和化學性質雙縮脲反應是肽和蛋白質特有的反應，游離氨基酸無此反應。該法測定蛋白質含量需肽端完整，不能水解4、雙縮脲反應：含有兩個或兩個以上肽鍵的化合物與堿性硫酸銅作用，生成藍紫色的復合物，肽鍵越多顏色越深，受蛋白質特異性影響小，可用于肽和蛋白質定量測定及測定蛋白質水解程度（兩個肽鍵以上的肽均有該反應，二肽沒有）思考：用下列方法測定蛋白質含量，_需要完整的肽鍵。A.雙縮脲反應B.凱氏定氮C.紫外吸收D.茚三酮反應華中農(nóng)業(yè)大學2002年碩士研究生入學考試生物化學試題雙縮脲反應思考（判斷）：雙縮脲反應是肽和蛋白質特有的反應，所以二肽也有雙縮脲反應中國科學院2001年招收攻讀碩士學位研究生入學考試試卷5、肽也有茚三酮反應雙縮脲法測量蛋白質含量具有兩個或兩個以上肽鍵的化合物皆有雙縮脲反應。而蛋白質及多肽的肽鍵能與Cu2+形成紫紅色絡合物，其最大光吸收在540nm處。其顏色深淺與蛋白質濃度成正比，而與蛋白質的分子量及氨基酸的組成無關，該法測定蛋白質的濃度范圍適于1~10mg/mL。雙縮脲法常用于蛋白質的快速測定。雙縮脲法主要針對蛋白質的肽鍵多少雙縮脲法的缺點是靈敏度差、所需樣品量大。（三）.天然存在的活性肽在生物體中，多肽最重要的存在形式是作為蛋白質的亞單位。有許多分子量比較小的多肽以游離狀態(tài)存在，這類多肽通常都具有特殊的生理功能，常稱為活性肽。如：腦啡肽；激素類多肽；抗生素類多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。1.

谷胱甘肽

三肽（Glu-Cys-Gly），廣泛存在于生物細胞中，含有自由的巰基，具有很強的還原性，可作為體內重要的還原劑，保護某些蛋白質或酶分子中的巰基免遭氧化，使其處于活性狀態(tài)。谷胱甘肽解毒作用：與毒物或藥物結合，消除其毒性作用；

參與氧化還原反應：作為重要的還原劑，參與體內多種氧化還原反應；

保護巰基酶的活性：使巰基酶的活性基團-

SH維持還原狀態(tài)；

維持紅細胞膜結構的穩(wěn)定：消除氧化劑對紅細胞膜結構的破壞作用。

蠶豆病？2抗生素類多肽含有D-苯丙氨酸、鳥氨酸，4、

α-鵝膏蕈堿主要抑制真核RNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ，對細菌的RNA聚合酶作用極小5肌肽和鵝肌肽肌肽（carnosine）:β-Ala-His鵝肌肽（anserine）:β-Ala-1-Me-His3激素類多肽天然存在的活性肽三、蛋白質一級結構的測定（一）蛋白質一級結構的定義:

蛋白質分子中氨基酸殘基的排列順序，即氨基酸的線性序列。一級結構中包含的共價鍵主要指肽鍵和二硫鍵。在基因編碼的蛋白質中，這種序列是由mRNA中的核苷酸序列決定的。

1、直接法（測蛋白質的序列）

2、

間接法（測核酸序列推斷氨基酸序列，目前往往采用從待測蛋白質的基因序列反推出蛋白質的一級結構）

一個純蛋白質，理想方法是從N端直接測至C端，但目前只能測60個N端氨基酸。所以需要將大化小，逐段分析，制成兩套肽片段，找出重疊位點，排出肽的前后位置，最后確定蛋白質的完整序列。一級結構測定的方法：蛋白質一級結構測定的策略：直接法樣品純度必須>97%以上；(1)測定蛋白質分子中多肽鏈的數(shù)目(2)拆分蛋白質分子的多肽鏈(3)斷開多肽鏈內的二硫橋

(4)分析每一多肽鏈的氨基酸組成(5)鑒定多肽鏈的N—末端和C—末端殘基(6)裂解多肽鏈成較小的片段。(7)測定各肽段的氨基酸序列。(8)重建完整多肽鏈的一級結構。(9)確定半胱氨酸殘基間形成的S--S交聯(lián)橋的位置蛋白質一級結構測定的策略：測定蛋白質多肽鏈種類和數(shù)目的方法種類：

SDS數(shù)目：N末端氨基酸殘基摩爾數(shù)/蛋白質摩爾數(shù)1、測定蛋白質中多肽鏈的條數(shù)2、多肽鏈的拆分

由多條多肽鏈組成的蛋白質，必須先進行拆分。

（1）拆分非共價鍵，可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈(亞基).如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；

（2）拆分二硫鍵3、斷開二硫鍵；拆分二硫鍵：幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起?？捎?mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍變性，應用過甲酸氧化法或過量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護生成的巰基，以防止它重新被氧化。氧化法或還原法鏈間非共價力—鹽酸胍；尿素二硫鍵—過甲氧酸氧化法、巰基還原法斷開二硫鍵還原法烷基化試劑保護巰基乙醇二硫蘇糖醇過甲酸氧化法4、多肽鏈的氨基酸組成分析方法：酸水解輔助以堿水解，再用蛋白質分析儀蛋白質水解↓↓↓氨基酸分析儀酸水解（Trp,Ser,Thr,Tyr,Asn,Gln）堿水解(exc.Trp)5、分析多肽鏈的N末端和C末端多肽鏈端基氨基酸分為兩類：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。1.N末端氨基酸的分析方法（1）二硝基氟苯法（DNFB)（2）丹磺酰氯法（3）苯異硫氰法（PITC)（4）氨肽酶法2.C末端測定方法（1）羧肽酶法：（2）肼解法（3）還原法：分析多肽鏈的N

末端和C末端N端氨基不能被封閉1.DNS-Cl法：丹磺酰氯最常用，黃色熒光，靈敏度極高，DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。2.DNFB法：Sanger試劑，DNP-多肽，酸水解，黃色DNP-氨基酸，有機溶劑（乙酸乙酯）抽提分離，紙層析、薄層層析、液相等。3.PITC法：Edman法，逐步切下。無色PTH-氨基酸，有機溶劑抽提，層析。（1）N端分析方法①二硝基氟苯法（DNP法）

Sanger法。2,4-二硝基氟苯在堿性條件下，能夠與肽鏈N-端的游離氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性條件下水解，得到黃色DNP-氨基酸。該產(chǎn)物能夠用乙醚抽提分離。不同的DNP-氨基酸可以用色譜法進行鑒定。Sanger試劑和Sanger應用：鑒定多肽或蛋白質的N-末端氨基酸。Sanger法。2,4-二硝基氟苯在堿性條件下，能夠與肽鏈N-端的游離氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性條件下水解，得到黃色DNP-氨基酸。該產(chǎn)物能夠用乙醚抽提分離。不同的DNP-氨基酸可以用色譜法進行鑒定

Sanger，確定了胰島素的一級結構，1958年獲Nobel化學獎。1975年建立了快速測定DNA序列的加、減法，1976年又一次獲NobelPrize.）N端分析方法②丹磺酰氯法（DNS法）

在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以與N-端氨基酸的游離氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的優(yōu)點是丹磺酰-氨基酸有很強的熒光性質，檢測靈敏度可以達到110-9mol。③苯異硫氰酸(酯)法（PITC法、PTH法、Edman降解法）蛋白質序列分析儀的分析原理！N端分析方法氨肽酶法

從多肽鏈的N-末端逐個地向里切。根據(jù)不同的反應時間測出酶水解所釋放的氨基酸種類和數(shù)量，按反應時間和殘基釋放量作動力學曲線。?亮氨酸氨肽酶：最常用?氨肽酶M：較常用N端分析方法分析多肽鏈的N

末端

有些蛋白質的肽鏈沒有游離的氨基端，較多的情況是氨基端因受到乙?；蚬劝彼釟埢陨憝h(huán)化為焦谷氨酸殘基而被封閉。此時我們可采用相應方法對封閉N-末端進行測定。

甲?；Ｒ约柞＜琢虬彼岬男问酱嬖谟谠梭w系的初生肽鏈的端部。乙酰化N-末端環(huán)肽甲?；┒?2).C-末端分析方法1.羧肽酶法，（Pro不能測）

羧肽酶A：除Pro、Arg、Lys外的所有C端a.a

羧肽酶B：只水解Arg、Lys2.還原法,硼氫化鋰(LiBH4)

肽-COOH?生成肽-CH2OH?水解,分離,層析鑒定。此法比較少用。3.肼解法Val—Ser—Gly6、多肽鏈部分裂解成較小的片段酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶等。化學法：溴化氰水解法，它能選擇性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽鍵。酶解法A.胰蛋白酶(trypsin)

專一裂解Lys、Arg的羧基參與形成的肽鍵。為了減少的作用位點，可用化學修飾將多肽鏈側鏈保護起來，1.2－環(huán)己酮封閉Arg，馬來酸酐封閉Lys。氮丙啶形成帶正電荷點，增加位點。B.糜蛋白酶(Chymotrypsin)

斷裂Phe,Trp,Tyr等疏水AA的羧基所形成的肽鍵。斷裂鍵鄰近的基團，堿性：裂解能力↑，酸性：裂解能力↓C.胃蛋白酶(Pepsin)

斷裂鍵兩側的殘基都是疏水性或芳香氨基酸殘基。其后和前為Pro時抑制。化學法——溴化氰（BrCN）水解法，選擇性切割甲硫氨酸的羧基所形成的肽鍵。蛋白質一級結構測定的策略①

電泳法：SDS－PAGE：根據(jù)分子量大小分離②

離子交換層析法（DEAE—Cellulose、DEAE—Sephadex）根據(jù)肽段的電荷特性分離③

反相HPLC法：根據(jù)肽段的極性分離④

凝膠過濾：根據(jù)分子大小6、肽段的分離純化7、測定各短肽段的氨基酸序列方法：蛋白質序列分析儀原理：

1.Edman法

2.DNS-Edman法

3.有色-Edman法質譜法質譜法一般采用高速電子來撞擊氣態(tài)分子，將樣品轉化為運動的帶電氣態(tài)正離子，加速導入質量分析器，然后按質荷比（m/z）的大小順序進行收集和記錄，測出了離子的準確質量，得到質譜圖，根據(jù)質譜峰的位置進行定性和結構分析，根據(jù)峰的強度進行定量分析質譜分析法基本原理基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜電噴射串聯(lián)質譜可分析微量的肽鏈，短肽在第一臺質譜儀中經(jīng)電噴射電離，按荷質比分離，依次在經(jīng)碰撞池被裂解成離子碎片，在第二臺質譜儀中測出各個離子碎片的譜線，推算出短肽的氨基酸序列。在蛋白質組學中應用廣泛，但不能區(qū)分亮氨酸和異亮氨酸。質譜法測序的突出優(yōu)點是可以識別翻譯后修飾(post-translationsmodification)而得到的特殊氨基酸。8、重建完整多肽鏈的一級結構不同的方法指的是斷裂的專一性不同，即切口彼此是錯位的。因此兩套肽段正好相互跨過切口而重疊，這種跨過切口而重疊的肽稱為重疊肽(overlapingpeptide)。借助重疊肽可以確定肽段在原多肽鏈中的正確位置，拼湊出整個多肽鏈的氨基酸順序。9、二硫鍵位置的確定-對角線電泳來測點樣、濾紙中央↓

PH6.5第一向電流

↓

肽段按大小及電荷分開

↓

濾紙暴露在過甲酸蒸汽中（－S－S－斷裂）

↓

含二硫鍵肽段被氧化成氧化成一對含半胱氨磺酸的肽

↓

濾紙旋轉90，PH6.5第二向電流

↓

含半胱氨磺酸的成對肽段負電荷偏離對角線

↓

茚三酮AA順序分析

↓

確定二硫鍵的位置二硫鍵位置的確定-對角線電泳

二硫鍵位置的確定-對角線電泳來測

2．分離含胡二硫鍵的肽段可以用（②）

①SDS－PAGE電泳；②對角線電泳；③瓊脂糖電泳

中科院上海生化與細胞所生物化學2002年中國計量學院20071、為測定蛋白質中的二硫鍵位置,常采用對角線電泳法,問點樣時樣品應點在下列所指的哪個位置濾紙的

①左下角;②右上角;③邊緣中間;④中央答()3、對角線電泳。先是用專一性適中的蛋白質水解酶，將蛋白質降解為若干片段。隨后進行二維紙電泳，在第一相電泳用氧化劑處理，然后進行第二相電泳。經(jīng)顯色后，在多角線上的肽段均不含有二硫鍵，而偏離對角線的肽段是形成二硫鍵的肽段。目前利用質譜技術也可以測定二硫鍵。廈門大學生命科學學院2005年考研試題10、酰胺基位置的確定

Asp—Asn、Glu—Gln方法：酶解肽鏈，產(chǎn)生含有單個Asx或Glx的肽，用電泳法確定是Asp還是Asn。舉例：Leu-Glx-Pro-Val肽在pH=6.0時，電荷量是Leu+Pro0Val-此肽除Glx外，凈電荷為0，可根據(jù)此肽的電泳行為確定是Glu或是Gln。

1953年FrederickSanger和他的同事們首次測定了牛胰島素的氨基酸一級結構，它包含2條肽鏈、51個氨基酸。由于此項工作，他獲得了1958年度諾貝爾獎。

60年代,我國首次人工合成結晶牛胰島素蛋白質測序舉例第一個側出二、三級結構的蛋白質：肌紅蛋白第一個側出四級結構的蛋白質：血紅蛋白第一個被確定氨基酸序列的酶:核酸酶

(Hirs等，1960年)蛋白質測序舉例蛋白質測序直接法和間接法比較優(yōu)點：成本低、周期短，一次可測序列長缺點：二硫鍵無法確定無法測定其修飾基團未必是蛋白質的最終形式推測出的蛋白質可能比實際蛋白質大或小

？間接法：待測蛋白質做抗原免疫動物得抗體再以后者做抗原免疫動物，沉淀含有待測蛋白質得核糖體，得到待測蛋白質得mRNA，逆轉錄得cDNA測序蛋白質一級結構的實例用幾種酶或試劑把蛋白質水解成大小不