核-殼型白藜蘆醇分子印跡微球研制及應用

核-殼型白藜蘆醇分子印跡微球研制及應用【內容摘要】以外表修飾乙烯基團的sio2微球為基體，白藜蘆醇為模板分子，丙烯酰胺〔aa〕為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯〔egdma〕為交聯(lián)劑，采取外表印跡技術制備核-殼型白藜蘆醇印跡微球。采取紅外光譜〔ir〕、掃描電子顯微鏡〔sem〕對該分子印跡微球進行表征，結果表示清楚，sio2外表成功接枝一層厚度為200nm的印跡聚合物，該印跡微球顆粒分散均勻。采取高效液相色譜技術對印跡微球的吸附性進行研究表示清楚，此印跡微球具有良好的辨別性能，利用scatchard模型分析得出印跡微球的最大吸附量分別為qmax1=9.087mg/g和qmax2=13.80mg/g。此印跡微球成功用于分離虎杖提取液中白藜蘆醇。【本文關鍵詞語】分子印跡微球；白藜蘆醇；吸附性能；核-殼型preparationandevaluationofcore-shellresveratrolmolecularlyimprintedmicrosphereszhangming-lei，zhangzhao-hui，liuli，zhangli-ji，nieli-hua(collegeofchemistryandchemicalengineering，jishouuniversity，jishou416000)(statekeylaboratoryofchemo/biosensingandchemometrics，hunanuniversity，changsha410082)abstractemployingresveratrolastemplatemolecule，acrylamideasfunctionalmonomerandethyleneglycoldimethacrylateascross-linkers，acore-shellresveratrolimprintedmicrosphereswaspreparedbasedonthesurfaceofsio2withasurfaceimprintingmolecularlyimprintedmicrospherewascharacterizedbyinfraredspectroscopyandscanningelectronmicroscopy，andtheresultsshowedthatthesurfacegraftingofmolecularlyimprintedpolymer-shellparticleonsio2wassuccessfulandtheparticleswereevenlyperformanceliquidchromatographywasalsousedtoinvestigatetheimprintedmicrosphereadsorptionperformance，andtheresultsshowedthattheimprintedmicrosphereexhibitedgoodrecognitionmaximumadsorptioncapacitieswereqmax1=9.087mg/gandqmax2=13.80mg/gbythemodelofscatchardimprintedmicosphereswasappliedtoseparateresveratrolfromtheextractionofrhizomapolygonicuspidatesuccessfully.keywordsmolecularlyimprintedmicrosphere；resveratrol；adsorptionproperty；core-shell1引言近年來，新型印跡技術不斷涌現(xiàn)，包含采取溶膠-凝膠技術進行本體聚合[1，2]，在硅膠外表進行外表聚合[3~5]。前者聚合物存在模板分子包埋過深、難以洗脫、形狀不規(guī)則、機械性能低等缺點;后者的外表印跡材料的大小可控，顆粒均勻，容易洗脫，尤其通過控制外表聚合殼層的厚度，可有效減少包埋現(xiàn)象?；⒄认缔た茖俣嗄晟荼局参铮哂徐铒L利濕、散瘀定痛、止咳化痰的作用，重要含有蒽醌類和芪類化合物，其中芪類成分白藜蘆醇〔resveratrol〕具有抗癌、抗氧化、抗自在基、抗細菌和真菌等作用[6]。當前，提取分離白藜蘆醇的方法重要有溶劑提取和酶法提取[7]及印跡技術[８~1０]。向海燕等[８]以溶膠-凝膠法合成白藜蘆醇印跡聚合物，但是其印跡聚合物模板分子包埋過深，難以洗脫，粒徑不規(guī)則、不均勻。為了克制這些缺陷，本研究以sio2微球為載體，通過接枝乙烯基三甲氧基硅烷〔vtmos〕，在sio2微球外表引入雙鍵，合成核-殼型的白藜蘆醇分子印跡微球，并用于分離虎杖提取液中的白藜蘆醇。2實驗部分2.1儀器與試劑lc-2010aht型高效液相色譜儀〔日本島津公司〕；wgh-30a型雙光束紅外分光光度計〔天津港東科技發(fā)展〕；kq-250e型超聲波清洗器〔昆山市超聲儀器〕；lg10-2.4a臺式高速離心機〔北京醫(yī)用離心機廠〕。正硅酸乙酯〔teos，sigma公司〕；丙烯酰胺〔aa，分析純〕；白藜蘆醇〔標樣，中國藥檢所〕；乙二醇二甲基丙烯酸酯〔egdma，sigma公司〕；偶氮二異丁腈〔aibn，分析純〕；乙烯基三甲基硅烷〔vtmos，sigma公司〕；乙腈〔色譜純〕；乙酸、無水乙醇、氨水、hcl〔分析純〕；虎杖〔采自湖南張家界〕粉末。2.2印跡微球的制備2.2.1sio2微球的制備[11]向裝有49.5ml乙醇的燒瓶中參加2.0ml氨水、6.3ml蒸餾水和2.23mlteos，室溫下以700r/min的速度攪拌，反應12h。采集產(chǎn)品，用乙醇沖刷，放入真空枯燥箱中枯燥，備用。2.2.2sio2微球的外表修飾稱取sio2微球2.0g，參加8.0mol/lhcl60.0ml，60℃回流12h，過濾，濾餅用蒸餾水洗滌至中性后，140℃下枯燥8h，即可得外表活化的sio2微球。取0.5g外表活化的sio2微球，分散于10.0ml50%乙醇的水溶液中，參加0.75mlvtmos，50℃下反應24h。硅烷化后，用乙醇在超聲下洗去未反應的vtmos，然后于100℃下枯燥3h，使vtmos與sio2外表的羥基充足交聯(lián)鍵合，得到乙烯基修飾的sio2微球〔vtm-sio2〕。2.2.3白藜蘆醇分子印跡微球〔mips〕的制備[3]取200mgvtm-sio2顆粒分散于100ml乙腈溶液中，參加170mg〔2.40mmol〕aa，1.83ml〔9.2mmol〕egdma，300mg〔1.3mmol〕白藜蘆醇，和100mg〔0.6mmol〕aibn，在冰水浴下通入氮氣10min。在50℃下聚合6h，然后升溫至60℃下再聚合24h，控制攪拌速度為300r/min。產(chǎn)品在85℃下再反應6h，沉淀，最后用乙腈和乙醇洗滌，120℃下枯燥，將采集的白藜蘆醇印跡微球〔mips〕用v(甲醇)∶v(乙酸)=9∶1混合溶液在索式提取器中反復洗滌24h除去模板分子，120℃下枯燥。非印跡微球〔nonimprintedpolymers，nips〕的合成方法與分子印跡微球合成方法完全一致，只是在合成時不參加模板分子。2.3印跡微球的吸附性能研究及其表征2.3.1靜態(tài)吸附取印跡微球20.0mg，8份，分別置于吸附管中，各自參加10.0ml濃度為0.1～0.4mol/l的白藜蘆醇的乙醇溶液，置于25℃恒溫水浴超聲波振蕩器中，振蕩12h后，以9000r/min速度離心分離，取上層清液用高效液相色譜測定平衡時白藜蘆醇的濃度。檢測波長303nm，流動相為v(甲醇)∶v(水)=41∶59，流速為1.0ml/min。根據(jù)吸附前后濃度變化，計算對白藜蘆醇的吸附量q。2.3.2紅外分析采取wgh-30a型雙光束紅外分光光度計，對sio2微球、vtm-sio2微球、洗脫脫模板分子〔白藜蘆醇〕前、后的mips進行紅外表征。2.4實際樣品檢測取1.0g洗脫后的分子印跡微球，裝入直徑為1.0cm、容量為10.0ml的聚丙烯柱中，柱子的下端口用棉花塞住，從上口裝入印跡微球，再塞上棉花，參加乙醇抽濾，使印跡微球在柱內排布嚴密。取3.0g虎杖原料粉末投入100ml圓底燒瓶中，參加30.0mlv(甲醇)∶v(乙酸)=8∶2混合溶液，超聲30min，80℃下回流3h，然后進行過濾，蒸出溶劑，用甲醇從新溶解，得虎杖提取液。取5.0ml虎杖提取液，注入提取柱，抽濾，采集過柱液，先用5.0ml甲醇沖刷提取柱，然后用5.0mlv(甲醇)∶v(乙酸)=9∶1混合溶液冼脫，采集洗脫液，用hplc檢測白藜蘆醇的含量。圖1sio2微球外表印跡制備路線圖〔略〕fig.1synthesisroutineofsio2molecularyimprinedpolymers3結果與討論3.1印跡微球的制備及形貌表征以vtmos為連接sio2和aa的媒介，采取熱聚合技術，以白藜蘆醇為模板分子，aa為功能單體，egdma為交聯(lián)劑，經(jīng)過abin引發(fā)，在溫和的條件下制備出包覆了白藜蘆醇的印跡聚合薄層。經(jīng)過甲醇-乙酸溶液洗脫后，白藜蘆醇從印跡微球聚合薄層中洗脫出來，在印跡微球的薄層中留下對白藜蘆醇具有特異吸收的空隙。sio2微球外表印跡微球制備路線如此圖1所示。制備的分子印跡聚合物微球有下面特點：在sio2微球外表引入了雙鍵，加強了分子印跡聚合物薄層與載體之間的共價鍵作用力，使聚合物薄層結實地聚合在微球外表；通過改變vtm-sio2，aa和egdma的比例，控制殼層厚度，有效減少了包埋，利于洗脫。研究表示清楚，當vtm-sio2，aa和egdma的質量比為1∶1∶9，其殼層厚度可控制在200nm下面；可加強分子印跡聚合物微粒外表的記憶效應和機械性能。圖2sio2和印跡微球的掃描電鏡圖〔略〕fig.2scanningelectronmicroscopic(sem)imagesofsio2andmolecularlyimprintedpolymers(mips)掃描電鏡對sio2微球和mips進行形貌分析的結果見圖2。sio2微球粒徑均勻〔約為200nm〕、規(guī)則。mips外表光滑，粒徑均勻，粒徑約為600nm。由此可估算外表印跡聚合物殼層厚度約為200nm。3.2吸附實驗采取靜態(tài)吸附法，通過hplc檢測，分別得出mips和nips對白藜蘆醇的吸附等溫線，如此圖3a所示。結果表示清楚，mips對白藜蘆醇具有較強的吸附能力，而nips對白藜蘆醇的吸附能力小，這表示清楚mips對白藜蘆醇具有較強的印跡效應。進一步利用scatchard模型[7]分析，scatchard方程為：q/c=〔qmax－q〕/kd。式中，kd是接合位點的平衡解離常數(shù)；qmax是結合位點的最大表觀結合量〔mg/g〕；c表示吸附平衡液的平衡濃度〔g/l〕。以q/c對q作圖可得兩條不同斜率的直線〔圖3b〕，mips在研究濃度范圍內對模板分子存在兩種吸附的結合位點。根據(jù)斜率和截距能夠得出親和位點解離常數(shù)和最大表觀結合量分別為kd1=0.1724g/l，qmax1=9.087mg/g；kd2=0.6018g/l，qmax2=13.80mg/g。圖3印跡微球和非印跡微球的吸附等溫線(a)及scathchard曲線(b)〔略〕fig.3adsorptionisotherms(a)andscatchardplots(b)ofadsorptionisothermsofmipsandnonimprintedpolymers(nips)3.3紅外光譜分析將sio2，vtm-sio2，mips〔模版洗脫后〕、mips〔未洗脫模版〕分別進行紅外光譜分析(圖4)。比較圖4a和4b可見，在1413和1637cm－1有吸收峰，其中1413cm－1處是甲基的彎曲振動，1637cm－1是cc的伸縮振動，這表示清楚乙烯基硅烷成功的修飾到sio2微球外表。在圖4c和4d中，3500cm－1是oh的吸收峰，3150~3400cm－1是nh鍵的伸縮振動區(qū)域，1725cm－1屬于cｏ的伸縮振動。圖4d中，1450~1660cm－1屬于苯環(huán)的伸縮振動，3100cm－1是苯環(huán)ch和乙烯基ch的伸縮振動，而圖4c卻沒有這些峰，這表示清楚白藜蘆醇分子能夠從印跡微球外表洗脫干凈。圖4sio2(a)、乙烯基修飾的sio2(b)、mips(模板洗脫后)(c)、mips(未洗脫模板)(d)的紅外圖譜〔略〕fig.4irspectraofsio2(a)，sio2modifiedwithvinyl(b)，mips(afterelutingthetemplate)(c)，mips(beforeelutingtemplate)(d)3.４印跡微球對虎杖提取液中白藜蘆醇的分離采取hplc檢測白藜蘆醇標準溶液，確定白藜蘆醇的出峰時間，分別檢測虎杖提取液、過柱液、洗脫液中白藜蘆醇的含量，如此圖５所示。比照虎杖提取液〔圖５b〕和過柱液〔圖５c〕的色譜圖，計算提取液中白藜蘆醇的含量為45.7%，過柱后溶液中白藜蘆醇含量為5.4%，這表示清楚虎杖提取液通過印跡分離柱，白藜蘆醇容易被印跡填充物吸附。用甲醇沖刷印跡柱后，再用v(甲醇)∶v(乙酸)=9∶1混合溶液洗脫，采集洗脫液、檢測，得色譜圖５d，柱洗脫液中白藜蘆醇含量為89.3%。結果表示清楚，本印跡填充材料具有較強的吸附性能，白藜蘆醇與印跡微球的結合鍵比較結實，能夠將虎杖溶液中的白藜蘆醇得到較好的分離。圖５白藜蘆醇標準液(a)、虎杖提取液(b)、過柱后溶液(c)和柱洗脫液(d)的液相色譜圖〔略〕fig.５liquidchromatogramsofresveratrolstandardsolution(a)，extractingsolutionofrhizomapolygonicuspidati(b)，afterpassi