高效液相色譜培訓(xùn)教案

關(guān)于高效液相色譜培訓(xùn)教案第1頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六第一節(jié)高效液相色譜的特點(diǎn)

高效液相色譜法作為色譜分析法的一個分支，是在20世紀(jì)60年代末期，在經(jīng)典液相色譜法和氣相色譜法的基礎(chǔ)上，發(fā)展起來的新型的分離分析技術(shù)。液相色譜包括傳統(tǒng)的柱色譜、薄層色譜和紙色譜。20世紀(jì)50年代后氣相色譜法在色譜理論研究和實驗技術(shù)上迅速崛起，而液相色譜技術(shù)仍停留在經(jīng)典操作方式，其操作繁瑣，分析時間很長，因而未受到重視。20世紀(jì)60年代以后，隨氣相色譜法對高沸點(diǎn)有機(jī)物分析局限性的逐漸顯現(xiàn)，人們又重新認(rèn)識到液相色譜法可彌補(bǔ)氣相色譜法的不足之處。因此，在20世紀(jì)60年代后，高效液相色譜技術(shù)才有了很快的發(fā)展。

第2頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六高效液相色譜（highperformanceliquidchromatography，HPLC）還可稱為高壓液相色譜（highpressureliquidchromatography）、高速液相色譜（highspeedliquidchromatography）、高分離度液相色譜（highresolutionliquidchromatography）或現(xiàn)代液相色譜（modernliquidchromatography）。

第3頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六1．1906年由俄國植物學(xué)家Tsweet創(chuàng)立

植物色素分離見圖示

2、20世紀(jì)20年代，許多植物化學(xué)家開始采用色譜方法對植物提取物進(jìn)行分離，色譜方法才被廣泛的應(yīng)用。3、30～40年代發(fā)表了薄層色譜、紙色譜的論文4、40年代瑞典科學(xué)家Tiselius等在分配液相色譜、吸附色譜和電泳領(lǐng)域取得了成果※5、50年代英國Martin和Synge建立GC色譜※6、60年代GC-MS聯(lián)用分析已不能滿足分析測試的要求

一、色譜法（chromatograph）的起源和發(fā)展第4頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六圖示固定相——CaCO3顆粒流動相——石油醚

植物色素混合物第5頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六7、70年代HPLC崛起，氣相色譜和高效液相色譜，逐步成為各行各業(yè)必不可少的分析工具，廣泛應(yīng)用于各個生產(chǎn)領(lǐng)域。8、1975年，美國Dow化學(xué)公司的H.Small等人首先提出的離子色譜的概念，在分離柱后加一個抑制柱，同年商品化的離子色譜儀問世。9、1979年，美國依阿華州立大學(xué)J.S.Fritz等人提出的非抑制型離子色譜儀。10、20世紀(jì)80年代以后，一種新型的色譜技術(shù)—毛細(xì)管電泳技術(shù)隨之出現(xiàn)。11、20世紀(jì)90年代以后，ELSD一種新型的檢測器出現(xiàn)，改變了弱紫外吸收物質(zhì)的梯度檢測難題。12、20世紀(jì)90年代中期以后，用于HPLC的MS檢測器開始普及，使液相進(jìn)入定性的時代。

第6頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六進(jìn)入21世紀(jì)，HPLC在多個方面取得突破：Merck商品化的一體化柱，給人們一種全新的色譜柱概念。2004年，Waters提出了UPLC的新概念，超高壓液相色譜。借助小顆粒的填料，特殊化的設(shè)計，實現(xiàn)超高效和快速、高通量的分析。2004年10月13日，ESA公司向外界宣布了一項高效液相色譜的最新技術(shù)突破，Corona?帶電氣溶膠檢測器（CAD）誕生，新一代的通用型檢測器。2005年，島津發(fā)布了第一個基于Web的HPLC系統(tǒng)。HPLC向高通量、高靈敏、網(wǎng)絡(luò)化、小型化發(fā)展。

第7頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六二、色譜法定義、分離基礎(chǔ)和目的定義：利用各組分物理化學(xué)性質(zhì)的不同，在流動相流 經(jīng)固定相時，由于各組分在兩相間的吸附、分 配或其它親和力的差異而產(chǎn)生不同速度的移 動，最終達(dá)到分離的目的。圖例分離基礎(chǔ)：差速遷移

(例:賽跑)目的：多組分分離，實現(xiàn)定性定量分析第8頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六圖示分離機(jī)制：各組分與流動相分子爭奪吸附劑表面活性中心利用吸附劑對不同組分的吸附能力差異而實現(xiàn)分離吸附→解吸→再吸附→再解吸→無數(shù)次洗脫→分開碳酸鈣吸附劑石油醚流動相色素第9頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六三、高效液相色譜與其它色譜方法的比較1.HPLC與經(jīng)典LC的比較從分析原理上講，高效液相色譜法和經(jīng)典液相（柱）色譜法沒有本質(zhì)的差別，但由于它采用了新型高壓輸液泵、高靈敏度檢測器和高效微粒固定相，而使經(jīng)典的液相色譜法煥發(fā)出新的活力。

第10頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六三、高效液相色譜與其它色譜方法的比較1.HPLC與經(jīng)典LC的比較經(jīng)典液相（柱）色譜法使用粗粒多孔固定相，裝填在大口徑、長玻璃柱管內(nèi)，流動相僅靠重力流經(jīng)色譜柱，溶質(zhì)在固定相的傳質(zhì)、擴(kuò)散速度緩慢，柱入口壓力低，僅有低柱效，分析時間很長。高效液相色譜法使用全多孔微粒固定相，裝填在小口徑、短不銹鋼柱內(nèi)，流動相通過高壓輸液泵進(jìn)入高柱壓的色譜柱，溶質(zhì)在固定相的傳質(zhì)，擴(kuò)散速度大大加快，從而在短的分析時間內(nèi)獲得高柱效和高分離能力。

第11頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六三、高效液相色譜與其它色譜方法的比較1.HPLC與經(jīng)典LC的比較見下表方法項目高效液相色譜法經(jīng)典液相色譜法色譜柱：柱長/cm柱內(nèi)徑/mm10~252~1010~20010-~50固定相粒度：粒徑/μm篩孔/目5~502500~30075~600200~30色譜柱入口壓力/MPa2~200.001~0.1色譜柱柱效/（理論塔板數(shù)/m）2×103~5×1042~50進(jìn)樣量/g10-6~10-21~10分析時間/h0.05~1.01~20第12頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六2.HPLC與GC的比較高效液相色譜法與氣相色譜法有許多相似之處。氣相色譜法具有選擇性高、分離效率高、靈敏度高，分析速度快的特點(diǎn)，但它僅適于分析蒸汽壓低、沸點(diǎn)低的樣品，而不適于分析高沸點(diǎn)有機(jī)物、高分子和熱穩(wěn)定性差的化合物以及生物活性物質(zhì)，因而使其應(yīng)用受到限制。在全部有機(jī)化合物中僅有20%的樣品適用于氣相色譜分析。高效液相色譜法卻恰可彌補(bǔ)氣相色譜法的不足之處，可對80%的有機(jī)化合物進(jìn)行分離和分析，此兩種方法的比較如下：不同色譜方法適用的分子量范圍方法縮寫方法全稱分子量范圍能檢測的有機(jī)化合物的比重GPC凝膠滲透色譜＞10380—85%HPLC高效液相色譜法400--2000GC氣相色譜法10—40015—20%第13頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六2.HPLC與GC的比較分析對象及范圍流動相的選擇操作條件GC能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點(diǎn)較低的樣品，占有機(jī)物的20%流動相為有限的幾種“惰性”氣體，只起運(yùn)載作用，對組分作用小加溫常壓操作HPLC溶解后能制成溶液的樣品，高沸點(diǎn)、高分子量、難氣化、離子型的穩(wěn)定或不穩(wěn)定化合物，占有機(jī)物的80%流動相為液體或各種液體的混合。它除了起運(yùn)載作用外，還可通過溶劑來控制和改進(jìn)分離。室溫、高壓下進(jìn)行相同：均為高效、高速、高選擇性的色譜方法，兼具分離和分析功能，均可以在線檢測第14頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六與經(jīng)典液相色譜法相比

顆粒極細(xì)（一般為10m以下）、規(guī)則均勻的固定相，(鍵合相)傳質(zhì)阻抗小，柱效高，分離效率高；高壓輸液泵輸送流動相，流速快，分析速度快；高靈敏度檢測器，靈敏度大大提高。紫外檢測器最小檢測限可達(dá)109g，而熒光檢測器最小檢測限可達(dá)1012g。

四、高效液相色譜法的特點(diǎn)第15頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六與氣相色譜法相比不受試樣的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，應(yīng)用范圍廣；可選用各種溶劑作為流動相，對分離的選擇性有很大作用，選擇性高；一般在室溫條件下進(jìn)行分離，不需要高柱溫。

第16頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六優(yōu)點(diǎn)：“三高”、“一快”、“一廣”缺點(diǎn)：高選擇性——可將性質(zhì)相似的組分分開高效能——反復(fù)多次利用組分性質(zhì)的差異產(chǎn)生很好分離效果高靈敏度——10-11~10-13g，適于痕量分析分析速度快——幾~幾十分鐘完成分離一次可以測多種樣品應(yīng)用范圍廣——?dú)怏w，液體、固體物質(zhì)

對未知物分析的定性專屬性差需要與其他分析方法聯(lián)用(GC-MS,LC-MS)第17頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六按分離機(jī)制分類：分配色譜法吸附色譜法離子交換色譜法空間排阻色譜法第二節(jié)HPLC分類第18頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六基本類型色譜法的分離機(jī)制對于不同的分離機(jī)理，K的含義不同。吸附色譜

吸附系數(shù)

分配色譜

分配系數(shù)

離子交換色譜

離子交換系數(shù)

統(tǒng)稱K

分子排阻色譜

分子排阻系數(shù)第19頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六1.吸附色譜（液-固吸附色譜）：以固體吸附劑為固定相，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑。流動相可以是各種不同極性的一元或多元溶劑。2.分配色譜（液-液分配色譜）：早期通過在擔(dān)體上涂漬一薄層固定液制備固定相,現(xiàn)多為化學(xué)鍵合固定相，即用化學(xué)反應(yīng)的方法通過化學(xué)鍵將固定液結(jié)合在擔(dān)體表面。第20頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六

3.離子交換色譜：固定相為離子交換樹脂，流動相為無機(jī)酸或無機(jī)堿的水溶液。各種離子根據(jù)它們與樹脂上的交換基團(tuán)的交換能力的不同而得到分離。4.空間排阻色譜（凝膠色譜）以凝膠為固定相。凝膠是一種經(jīng)過交聯(lián)的、具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和不同孔徑的多聚體的通稱。如葡聚糖凝膠、瓊脂糖等軟質(zhì)凝膠；多孔硅膠、聚苯乙烯凝膠等硬質(zhì)凝膠；第21頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六（一）吸附色譜法要求：固定相→吸附劑（硅膠或AL2O3）具表面活性吸附中心分離機(jī)制：見圖示吸附系數(shù)注：Ka與組分的性質(zhì)、吸附劑的活性、流動相的性質(zhì)及溫度有關(guān)next吸附平衡Xm+nYa→Xa+nYm

第22頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六圖示分離機(jī)制：各組分與流動相分子爭奪吸附劑表面活性中心利用吸附劑對不同組分的吸附能力差異而實現(xiàn)分離吸附→解吸→再吸附→再解吸→無數(shù)次洗脫→分開

back第23頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六（二）分配色譜法要求：固定相→機(jī)械吸附在惰性載體上的液體流動相→必須與固定相不為互溶載體→惰性，性質(zhì)穩(wěn)定，不與固定相和流動相發(fā)生化學(xué)反應(yīng)分離機(jī)制見圖示

分配系數(shù)注：K與組分的性質(zhì)、流動相的性質(zhì)、固定相的性質(zhì)以及柱溫有關(guān)next第24頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六圖示分離機(jī)制利用組分在流動相和固定相間溶解度差別實現(xiàn)分離連續(xù)萃取過程back第25頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六分配色譜法分類正相分配色譜：流動相的極性弱于固定相的極性反相分配色譜：流動相的極性強(qiáng)于固定相的極性正相分配色譜：極性強(qiáng)的組分后被洗脫。 （庫侖力和氫鍵力）反相分配色譜：極性強(qiáng)的組分先出柱。第26頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六（三）離子交換色譜法要求：固定相→離子交換樹脂流動相→水為溶劑的緩沖溶液被分離組分→離子型的有機(jī)物或無機(jī)物分離機(jī)制見圖示選擇性系數(shù)

陽離子交換樹脂

RSO3-H++X+→RSO3-X++H+

注：Ks與離子的電荷數(shù)、水合離子半徑、流動相性質(zhì)、離子交換樹脂性質(zhì)以及溫度有關(guān)next

固定離子可交換離子待測離子第27頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六圖示分離機(jī)制：

依據(jù)被測組分與離子交換劑交換能力（親和力）不同而實現(xiàn)分離back第28頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六（四）空間排阻色譜法要求：固定相→多孔性凝膠流動相→水——凝膠過濾色譜流動相→有機(jī)溶劑——凝膠滲透色譜分離機(jī)制見圖示滲透系數(shù)

注：Kp僅取決于待測分子尺寸和凝膠孔徑大小，與流動相的性質(zhì)無關(guān)next第29頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六圖示分離機(jī)制：利用被測組分分子大小不同、在固定相上選擇性滲透實現(xiàn)分離back第30頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六結(jié)論：四種色譜的分離機(jī)制各不相同，分別形成吸附平衡、分配平衡、離子交換平衡和滲透平衡K分別為吸附系數(shù)，狹義分配系數(shù)，選擇性系數(shù)和滲透系數(shù)除了凝膠色譜法中的K僅與待測分子大小尺寸、凝膠孔徑大小有關(guān)外，其他三種K值都受組分的性質(zhì)、流動相的性質(zhì)、固定相的性質(zhì)以及柱溫的影響第31頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六按固定相的固定方式分：平面色譜

紙色譜薄層色譜高分子薄膜色譜柱色譜填充柱色譜毛細(xì)管柱色譜

第32頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六按溶質(zhì)在色譜柱洗脫的動力學(xué)過程分類：洗脫法前沿法置換法第33頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六洗脫法（elutionmethod）又稱淋洗法，將含有不同組分的樣品注入色譜柱，流動相連續(xù)流過色譜柱，并攜帶樣品組分在柱內(nèi)向前移動，經(jīng)色譜分離后，樣品中不同組分依據(jù)與固定相和流動相相互作用的差別，而順序流出色譜柱。前沿法（frontalmethod）又稱迎頭法，如將含三個等量組分的樣品溶于流動相，組成混合物溶液，并連續(xù)注入色譜柱，由于溶質(zhì)的不同組分與固定相的作用力不同，則與固定相作用最弱的第一個組分首先流出，其次是第二個組分與第一個組分混合流出，最后是與固定相作用最強(qiáng)的第三個組分與第二個組分和第一個組分混合一起流出。此法僅第一個組分的純度較高，其他流出物皆為混合物，不能實現(xiàn)各個組分的完全分離。置換法（displacementmethod）又稱頂替法，當(dāng)含有三種組分的混合物樣品注入色譜柱后，各組分皆與固定相有強(qiáng)作用力，若使用一般流動相無法將他們洗脫下來，為此可使用一種比樣品組分與固定相間作用力更強(qiáng)的置換劑（或稱頂替劑）作流動相，當(dāng)他注入色譜柱后，可迫使滯留在柱上的各個組分，依其與固定相作用力的差別而依次洗脫下來，且各譜帶皆為各個組分的純品。第34頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六第三節(jié)高效液相色譜法的應(yīng)用范圍和局限性

一、應(yīng)用范圍

高效液相色譜法適于分析高沸點(diǎn)不易揮發(fā)的、受熱不穩(wěn)定易分解的、分子量大、不同極性的有機(jī)化合物；生物活性物質(zhì)和多種天然產(chǎn)物；合成的和天然的高分子化合物等。涉及石油化工產(chǎn)品、食品、合成藥物、生物化工產(chǎn)品及環(huán)境污染物等，約占全部有機(jī)化合物的80%。其余20%的有機(jī)化合物，包括永久性氣體，易揮發(fā)低沸點(diǎn)及中等分子量的化合物，只能用氣相色譜法進(jìn)行分析。依據(jù)樣品分子量和極性則要選擇相應(yīng)的HPLC分離方法。第35頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六極性增加不溶于水溶于水非極性離子非離子極性吸附反向分配分配正向分配離子交換尺寸排阻凝膠滲透凝膠過濾分子量化學(xué)、生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等應(yīng)用廣泛。如氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸、烴、碳水化合物、藥品、多糖、高聚物、農(nóng)藥、抗生素、膽固醇、金屬有機(jī)物等分析，大多(80%)是通過HPLC來完成的。應(yīng)用各種HPLC方法的應(yīng)用范圍及對象第36頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六二、方法的局限性

高效液相色譜法雖具有應(yīng)用范圍廣等的優(yōu)點(diǎn)，但也有下述局限性：1、在高效液相色譜法中，使用多種溶劑作為流動相，當(dāng)進(jìn)行分析時所需成本高于氣相色譜法，且易引起環(huán)境污染。當(dāng)進(jìn)行梯度洗脫操作時，它比氣相色譜法的程序升溫操作復(fù)雜。2、高效液相色譜法中缺少如氣相色譜法中使用的通用型檢測器（熱導(dǎo)檢測器和氫火焰離子化檢測器）。3、高效液相色譜法不能替代氣相色譜法，去完成要求柱效高達(dá)10萬塊理論塔板數(shù)以上，必須用毛細(xì)管氣相色譜法分析組成復(fù)雜的具有多種沸程的石油產(chǎn)品。4、高效液相色譜法也不能代替中、低壓柱色譜法，在200kPa至1MPa柱壓下去分析受壓易分解、變形的具有生物活性的生化樣品。

第37頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六綜上所述可知，高效液相色譜法也和任何一種常用的分析方法一樣，都不可能十全十美，作為使用者在掌握了高效液相色譜法的特點(diǎn)，使用范圍和局限性的前提下，充分利用高效液相色譜法的特點(diǎn)，就可在解決實際分析任務(wù)中發(fā)揮重要的作用。

第38頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六第二章高效液相色譜基本概念一、什么是高效液相色譜？二、色譜過程三、常用的基本術(shù)語第39頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六HighPerformanceLiquidChromatography，高效液相色譜法，簡稱：HPLC。是一種區(qū)別于經(jīng)典液相色譜；基于儀器方法的高效能分離手段：高性能的色譜柱，高精度、耐高壓的輸液泵以及高靈敏度的檢測器。廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域：醫(yī)藥/環(huán)保/石化/生命科學(xué)/食品及農(nóng)業(yè)……

在技術(shù)，理論及應(yīng)用上仍處于發(fā)展階段。

一、什么是高效液相色譜？第40頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六二、色譜過程色譜過程：指物質(zhì)分子（被分離組分）在相對運(yùn)動的兩相（流動相和固定相）中的“分配”平衡過程以吸附色譜為例見圖示色譜過程：吸附→解吸→再吸附→再解吸→反復(fù)多次洗脫→被測組分分配系數(shù)不同→差速遷移→分離第41頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六圖示吸附能力弱的組分先流出吸附能力強(qiáng)的組分后流出組分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)微小差異與固定相作用差異隨流動相移動的速度不等差速遷移色譜分離。第42頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六三、常用的基本術(shù)語1、流出曲線和色譜峰2、基線、噪音和漂移3、峰寬——柱效參數(shù)4、峰高和峰面積——定量參數(shù)5、保留值——定性參數(shù)6、分配系數(shù)和容量因子——相平衡參數(shù)7、等溫線8、分離因子和分離度——分離參數(shù)第43頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六1．流出曲線和色譜峰流出曲線（色譜圖chromagtogram）：電信號強(qiáng)度隨時間變化曲線色譜峰(peak)：流出曲線上突起部分第44頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六2．基線、噪音和漂移

baseline,noiseanddrift基線：僅有流動相通過檢測器時產(chǎn)生的信號曲線。反映檢測器噪音隨時間變化的曲線

（穩(wěn)定—平直直線）噪音：儀器本身所固有的，以噪音帶表示（儀器越好，噪音越?。┢疲夯€向某個方向穩(wěn)定移動

（儀器未穩(wěn)定造成）第45頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六3．峰寬peakwidth：色譜柱效參數(shù)峰寬W：色譜峰兩側(cè)拐點(diǎn)切線與基線相交的截距標(biāo)準(zhǔn)差σ：σ為正態(tài)分布曲線兩拐點(diǎn)間距離的一半。對應(yīng)0.607h處峰寬的一半注：σ↓小，峰↓窄，柱效↑高半峰寬W1/2：峰高一半處所對應(yīng)的峰寬

注：除了用于衡量柱效，還可以計算峰面積第46頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六圖示第47頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六峰高(peakheight；h)：組分在柱后出現(xiàn)濃度 極大時的檢測信號，即色譜峰頂至基線的 距離。峰面積(peakarea；A)：色譜曲線與基線間 包圍的面積。4．峰高和峰面積：色譜定量參數(shù)第48頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六5．保留值：色譜定性參數(shù)保留時間retentiontime,tR：從進(jìn)樣開始到組分出現(xiàn)濃度極大點(diǎn)時所需時間，即組分通過色譜柱所需要的時間死時間deadtime,t0：不被固定相滯留組分的保留時間，相當(dāng)于流動相到達(dá)檢測器所需要的時間調(diào)整保留時間tR’：組分由于和固定相作用，比不作用的組分在柱中多停留的時間，即組分在固定相中滯留的時間。等于組分的保留時間與死時間之差值表示組分在色譜固定相內(nèi)滯留狀態(tài)的參數(shù)（1）時間表示的保留值第49頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六圖示第50頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六續(xù)前保留體積VR：從進(jìn)樣開始到組分出現(xiàn)濃度極大點(diǎn)時所需要的流動相的體積。VR與tR和Fc（流動相流速mL/min）的關(guān)系

死體積V0：由進(jìn)樣器至檢測器的流路中未被固定相占有的空間體積。包括從進(jìn)樣器到色譜柱導(dǎo)管的體積、固定相的孔隙及顆粒間隙、柱出口導(dǎo)管及檢測器內(nèi)腔體積的總和。（2）用體積表示的保留值第51頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六續(xù)前調(diào)整保留體積VR’：保留體積與死體積之差，即組分停留在固定相時所消耗流動相的體積第52頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六6．分配系數(shù)和容量因子：相平衡參數(shù)分配系數(shù)K（partitioncoefficient,平衡常數(shù)）：指在一定溫度和壓力下，組分在色譜柱中達(dá)分配平衡后，在固定相與流動相中的濃度比注：K為熱力學(xué)常數(shù)與組分性質(zhì)、固定相性質(zhì)、流動相性質(zhì)及溫度有關(guān)實驗條件固定，K僅與組分性質(zhì)有關(guān)不同分離機(jī)理的色譜中，K名稱雖有所不同，但物理意義都一樣，表示平衡狀態(tài)下兩相中濃度之比第53頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六討論：色譜條件一定時，tR主要取決K的大?。ㄉV法基本的定性參數(shù)）K↑，tR↑，組分后出柱K=0，組分不保留K→∞，組分完全保留分配系數(shù)K不容易獲得，不常用tR（保留時間）與K（分配系數(shù)）的關(guān)系：第54頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六容量因子（capacityfactor,容量比，分配比）k：在平衡狀態(tài)下，組分在固定相與流動相中的質(zhì)量比★★第55頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六

色譜分離前提→各組分分配系數(shù)不等注：應(yīng)選擇合適分離條件使得難分離的組分K不等2）色譜條件（s，m，T）一定時，K一定→tR一定1）組分一定，K不等的前提s和m改變T改變第56頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六7、等溫線：定義：指一定溫度下，組分在兩相中分配達(dá)平衡時，在兩相中的濃度關(guān)系曲線，即cs對cm的關(guān)系曲線圖示(1)線性等溫線（理想）→對稱峰(2)非線性等溫線凸形→拖尾峰（常見）凹形→前沿峰固定相表面活性吸附中心未達(dá)飽和，K一定，與溶質(zhì)濃度無關(guān)

固定相表面吸附中心活性不均，溶質(zhì)分子先占據(jù)強(qiáng)吸附中心再占據(jù)弱吸附中心，K隨著溶質(zhì)濃度的增加而減小溶質(zhì)與固定相作用，改變其表面性質(zhì)，K隨著溶質(zhì)濃度的增加而增加第57頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六斜率=K線性：對稱峰凹形：前沿峰凸形：拖尾峰第58頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六對稱因子：（拖尾因子）正常峰（對稱）非正常峰

前沿峰

拖尾峰色譜峰——fs在0.95~1.05之間——fs小于0.95——fs大于1.05

對稱因子(symmetryfactor)——衡量色譜峰對稱性第59頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六8.分離因子和分離度：—分離參數(shù)

描述相鄰組分分離狀態(tài)的指標(biāo)（1）分離因子（分配系數(shù)比或選擇性系數(shù)）定義：兩種物質(zhì)調(diào)整保留值之比分離因子α>1是色譜分離的必需條件第60頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六（2）分離度（resolution,R）：衡量色譜分離條件優(yōu)劣的參數(shù)定義：相臨兩組分間峰頂間距離是峰底寬平均值的幾倍第61頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六討論設(shè)色譜峰為正常峰，W1≈W2=4σ

第62頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六第三章HPLC儀器介紹第63頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六第64頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六第65頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六高壓輸液系統(tǒng)：儲液罐、吸濾器、高壓輸液泵、脫氣裝置及梯度洗脫裝置進(jìn)樣系統(tǒng)：進(jìn)樣器，進(jìn)樣閥分離系統(tǒng)：色譜柱，恒溫箱檢測系統(tǒng)：檢測器數(shù)據(jù)處理和計算機(jī)控制系統(tǒng)：記錄裝置、色譜工作站第66頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六1、貯液器和吸濾器：一、高壓輸液系統(tǒng)貯液器:0.5-2L的玻璃瓶溶劑吸濾器:Ni合金，孔約0.45

m，防止顆粒物進(jìn)入泵內(nèi)。第67頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六流動相貯器俗稱貯液瓶，它對大多數(shù)有機(jī)化合物呈化學(xué)惰性，耐酸堿腐蝕。常見質(zhì)地為玻璃或塑料，容量約為0.5L～2.0L，通常無色透明，若流動相需避光，有棕色瓶供選擇。貯液瓶放置位置要高于泵體，以便保持一定的輸液靜壓差。使用過程貯液瓶應(yīng)密閉，以防溶劑蒸發(fā)引起流動相組成的改變和防止空氣中的O2、CO2重新溶解于已脫氣的流動相中。第68頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六2、高壓輸液泵一、高壓輸液系統(tǒng)要求流量準(zhǔn)確可調(diào)、可調(diào)范圍寬：流動相流速在0.5-1.5mL/min，輸液泵的最大流量5-10mL/min耐高壓：輸出壓力常達(dá)30-60MPa液流穩(wěn)定。結(jié)構(gòu)材料應(yīng)耐化學(xué)腐蝕第69頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六第70頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六活塞型往復(fù)泵——液相色譜儀中使用最廣泛的恒流泵第71頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六雙活塞型往復(fù)泵第72頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六一、高壓輸液系統(tǒng)在線真空脫氣裝置3、脫氣裝置：將相對分子量小的氣體從溶劑中除去第73頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六流動相在使用前必須進(jìn)行脫氣處理，目的是除去其中溶解的氣體。在裝入貯液瓶之前必須經(jīng)過0.45μm或0.22μm濾膜過濾。在洗脫過程中如存在氣泡會增加基線噪音，嚴(yán)重時使分析靈敏度降低。此外溶解在流動相中的氧氣，會造成熒光猝滅，影響熒光檢測器的檢測，還可能導(dǎo)致樣品中某些組分被氧化或使柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。常用的脫氣方法有如下幾種：第74頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六1．超聲波振動脫氣將欲脫氣的流動相置放于超聲波提取器中，用超聲波振蕩10～30min。此法較簡單、常用。2．抽真空脫氣用微型真空泵，降壓至0.05～0.07Mpa既可除去溶解的氣體，使用水泵連接抽濾瓶和G4微孔玻璃漏斗可以一起完成過濾機(jī)械雜質(zhì)和脫氣的雙重任務(wù)。由于抽真空會引起混合溶劑組成的變化，故此法適用于單一溶劑的體系脫氣。對于多元溶劑體系，每種溶劑應(yīng)預(yù)先脫氣后再進(jìn)行混合，以保證混合后的比例不變。第75頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六3.加熱回流脫氣用于需要徹底脫氣的流動相（電化學(xué)檢測器），因為使用了回流冷凝器可減少揮發(fā)性組分的損失。此法的脫氣效果較好，不提倡用于混合流動相。4.吹氦脫氣使用在液體中比空氣溶解度低的氦氣在0.1Mpa壓力下，以60mL/min的流速緩緩地通過流動相10～15min，趕去溶入的氣體。此法適用于所有的溶劑，脫氣效果較好，但價格較貴。5．真空在線脫氣把真空脫氣裝置串接到貯液系統(tǒng)中，并結(jié)合膜過濾器，實現(xiàn)流動相在進(jìn)入輸液泵前的連續(xù)真空脫氣。此法可適用于多元溶劑體系。第76頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六一、高壓輸液系統(tǒng)4、梯度洗脫裝置：為什么要進(jìn)行梯度洗脫？使保留值相差很大的多種成分在合理的時間內(nèi)全部洗脫并達(dá)到相互分離梯度洗脫：在分離過程中逐漸改變流動相組成，如溶劑的極性、離子強(qiáng)度、pH值等。第77頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六一、高壓輸液系統(tǒng)高壓梯度：用于二元梯度，用兩個泵分別按設(shè)定的比例輸送A和B兩溶液至混合器

第78頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六一、高壓輸液系統(tǒng)低壓梯度：只用一個高壓泵，在泵前安裝了一個比例閥，混合就在比例閥中完成。

第79頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六二、進(jìn)樣系統(tǒng)將樣品溶液準(zhǔn)確送入色譜柱的裝置

——手動方式、自動方式密封性好、死體積小、重復(fù)性好、進(jìn)樣時引起色譜系統(tǒng)的壓力和流量波動要很小。進(jìn)樣器要求常用手動進(jìn)樣器——六通閥進(jìn)樣器第80頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六二、進(jìn)樣系統(tǒng)六通閥進(jìn)樣LoadInject第81頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六自動進(jìn)樣裝置采用微處理機(jī)控制進(jìn)樣閥采樣（通過閥針）、進(jìn)樣和清洗等操作。操作者只需把裝好樣品的小瓶按一定次序放入樣品架上（有轉(zhuǎn)盤式、排式），然后輸入程序（如進(jìn)樣次數(shù)、分析周期等），啟動，設(shè)備將自行運(yùn)轉(zhuǎn)。第82頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六三、色譜分離系統(tǒng)

色譜分離系統(tǒng)包括保護(hù)柱、色譜柱、恒溫裝置和連接閥等。分離系統(tǒng)性能的好壞是色譜分析的關(guān)鍵。1、保護(hù)柱

為保護(hù)分析柱擋住來源于樣品和進(jìn)樣閥墊圈的微粒，常在進(jìn)樣器與分析柱之間裝上保護(hù)柱。保護(hù)柱是一種消耗性柱，一般只有5cm左右長，在分析50～100個比較臟的樣品之后需要換新的保護(hù)柱芯。保護(hù)柱用分析柱的同種填料填裝，但粒徑要大得多，便于裝填。第83頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六三、色譜分離系統(tǒng)柱長15~30cm，內(nèi)徑4~5mm基質(zhì)(硅膠或高分子聚合物微球)功能層(固定在基質(zhì)表面對樣品分子保留起實質(zhì)作用的有機(jī)分子或功能團(tuán))2、色譜柱第84頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六常見色譜柱的類型專業(yè)的液相色譜儀廠家都有色譜柱生產(chǎn)，除此外還有很多專業(yè)的色譜柱廠家。C18—又稱ODS柱，使用最普遍、規(guī)格多，適合大多數(shù)化合物的分析，市場上品種繁多，值得注意的是同樣的C18柱，得到的結(jié)果可能非常不一致，尤其是極性或離子化合物。流動相為甲醇（乙腈）水系統(tǒng)。C8—類同于C18柱，保留能力比C18差。C4，C2，C1—反相，用于一些特定的化合物分析，壽命較短。NH2—既能用于反相又可用于正相，常用于小分子的糖分析。第85頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六色譜柱的保護(hù)1、在使用新柱之前，最好用有機(jī)溶劑在低流量下（0.2-0.3ml/min）沖洗30min，長時間未用的分析柱也要同樣處理。2、定期使用有機(jī)溶劑沖洗柱子。3、使用緩沖鹽時，要先用含5%-10%甲醇的水溶液沖洗，再用有機(jī)溶劑沖洗4、凈化樣品5、分離條件6、不使用時，要蓋上蓋子，避免固定相干涸第86頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六3、柱恒溫箱柱溫是液相色譜的重要參數(shù)，精確控制柱溫可提高保留時間的重現(xiàn)性。一般情況下較高柱溫能增加樣品在流動相的溶解度，縮短分析時間，通常柱溫升高6℃，組分保留時間減少約30%；升高柱溫能增加柱效，提高分離效率；分析高分子化合物或粘度大的樣品，柱溫必須高于室溫；對一些具有生物活性的生物分子分析時柱溫應(yīng)低于室溫。液相色譜常用柱溫范圍一般為室溫至60℃。第87頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六四、檢測系統(tǒng)用來連續(xù)檢測經(jīng)色譜柱分離后的流出物的組成和含量變化的裝置。溶質(zhì)性檢測器：僅對被分離組分理化特性響應(yīng)紫外、熒光、電化學(xué)檢測器總體檢測器：對試樣和洗脫液總理化性質(zhì)響應(yīng)示差折光，電導(dǎo)檢測器第88頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六石英窗接色譜柱UV光電倍增管廢液四、檢測系統(tǒng)1、紫外檢測器微量吸收池，光程為2-10mm,體積約為1~10L最小檢測量10-9g·ml-1對流量和溫度波動不敏感可用于梯度洗脫。

最常用的通用型檢測器第89頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六原理：基于被分析組分對特定波長紫外光的選擇性吸收優(yōu)點(diǎn)：①靈敏度高②對溫度和流速不敏感③可用于梯度洗脫缺點(diǎn)：僅適用于測定有紫外吸收的物質(zhì)。第90頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六四、檢測系統(tǒng)光電二極管陣列檢測器時間、光強(qiáng)度和波長三維譜第91頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六二極管陣列檢測器的優(yōu)點(diǎn)①采集三維譜圖②峰純度檢驗③光譜庫檢索④可以發(fā)現(xiàn)單波長檢測時未檢測到的峰第92頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六2、熒光檢測器四、檢測系統(tǒng)靈敏度高選擇性好樣品量很小適合藥物和生化樣品分析第93頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六原理：基于被分析組分發(fā)射的熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測優(yōu)點(diǎn)：①靈敏度高，是最靈敏的檢測器之一②選擇性好③對溫度和流速不敏感，可用于梯度洗脫缺點(diǎn)：僅適用于測定可產(chǎn)生熒光的物質(zhì)可檢測物質(zhì)：多環(huán)芳烴、霉菌毒素、酪氨酸、色氨酸、兒茶酚氨等（具有對稱共軛體系）第94頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六3、蒸發(fā)光散射檢測器四、檢測系統(tǒng)適于無紫外吸收、無電活性和不發(fā)熒光的樣品的檢測通用型和質(zhì)量型檢測器第95頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六原理：流出物在檢測器中被高速氮?dú)鈬姵伸F狀液滴，溶劑揮發(fā)后，溶質(zhì)形成微小顆粒，被載氣帶到檢測系統(tǒng)，進(jìn)入散射室中，檢測散射光的強(qiáng)度。優(yōu)點(diǎn)：消除了溶劑干擾以及溫度變化帶來的基線漂移，可梯度洗脫，靈敏度高，是HPLC的通用型檢測器。缺點(diǎn)：不能使用不揮發(fā)性鹽做流動相，如磷酸鹽第96頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六光源調(diào)零光學(xué)零參比樣品平面鏡透鏡光電轉(zhuǎn)換記錄儀放大器遮光板溶劑相和樣品+溶劑相對光的折射率不同，造成兩束光強(qiáng)度差變化，差示信號放大記錄代表樣品濃度通用型檢測器，靈敏度為10-7g/ml對溫度變化敏感，且不適于梯度淋洗4、示差折光檢測器四、檢測系統(tǒng)第97頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六原理：連續(xù)測定流通池中溶液折射率來測定試樣中各組分濃度。優(yōu)點(diǎn)：通用型檢測器缺點(diǎn)：①對溫度變化敏感②對溶劑組成變化敏感，不能用于梯度檢測③屬于中等靈敏度的檢測器第98頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六檢測器梯度

主要特點(diǎn)紫外-可見光可對流速和溫度變化敏感；池體積可制作得很?。粚θ苜|(zhì)的響應(yīng)變化大。熒光可選擇性和靈敏度高；易受背景熒光、消光、溫度、pH和溶劑的影響。化學(xué)發(fā)光困難靈敏度高；發(fā)光試劑受限；受流動相和脈動的影響。電導(dǎo)不可是離子性物質(zhì)的通用檢測器；受溫度和流速影響；不能用于有機(jī)溶劑體系。電化學(xué)困難選擇性高；受流動相pH值和雜質(zhì)的影響；穩(wěn)定性差。蒸發(fā)光散射可可檢測所有物質(zhì)。示差折光不可檢測所有物質(zhì)；不適合微量分析；對溫度變化敏感質(zhì)譜可主要用于定性和半定量。原子吸收光譜可選擇性高。ICP發(fā)射光譜可可進(jìn)行多元素同時檢測。火焰離子化可柱外峰展寬。第99頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六五、數(shù)據(jù)處理和計算機(jī)控制系統(tǒng)色譜工作站在線顯示自動采集處理儲存自動控制第100頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六第四章高效液相色譜方法第一節(jié)HPLC的固定相和流動相

第二節(jié)HPLC方法及原理第101頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六1、要求：粒徑小、顆粒分布均勻傳質(zhì)快、滲透壓小機(jī)械強(qiáng)度高、能耐高壓化學(xué)穩(wěn)定性好第一節(jié)HPLC的固定相和流動相

一、固定相第102頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六一、固定相（1）按承受壓力分剛性固體：硅膠為基質(zhì)

主要用于吸附、分配和鍵合色譜硬膠：以聚合物為基質(zhì)主要用于離子交換和尺寸排阻色譜2、固定相載體第103頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六（2）按孔隙深度分表面多孔型：實心玻璃珠為基體，基體表面覆蓋一層多孔活性材料適于常規(guī)分離分析全多孔型：全部由硅膠或氧化鋁微粒聚集而成適于復(fù)雜混合物的分離。一、固定相2、固定相載體第104頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六3.常用固定相液固色譜固定相常用粒徑3~10μm，理論塔板數(shù)過5萬/米無定形全多孔硅膠：YWG球形全多孔硅膠：YQG高分子多孔微球：YSG一、固定相第105頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六3.常用固定相化學(xué)鍵合固定相以硅膠為載體，借化學(xué)反應(yīng)方法將有機(jī)分子以共價鍵連接在硅醇基上一、固定相第106頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六Si-O-R：熱不穩(wěn)定、易水解，適于不含水或醇的流動相Si-R(或Si-N)：不水解，熱穩(wěn)定性較好。使用水溶液作流動相時，其pH應(yīng)在4-8之間。Si-O-Si-R：不水解，熱穩(wěn)定性好，pH2-8范圍內(nèi)對水穩(wěn)定3.常用固定相化學(xué)鍵合固定相一、固定相第107頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六3.常用固定相化學(xué)鍵合固定相非極性鍵合相：十八烷基鍵合相（ODS，C18）中等極性鍵合相：醚基鍵合相極性鍵合相：氨基、氰基鍵合相一、固定相第108頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六3.常用固定相其它固定相離子交換固定相：離子交換樹脂、鍵合型離子交換樹脂空間排阻色譜固定相：凝膠手性固定相：手性官能團(tuán)鍵合或天然手性物質(zhì)固著在載體上如環(huán)糊精親合色譜固定相：生物專一性配基+載體一、固定相第109頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六二、流動相——淋洗液，洗脫劑對樣品有適宜溶解度，k=2~5；溶劑要與檢測器匹配。高純度、化學(xué)穩(wěn)定性好適宜的粘度。過高柱壓增加；過低易產(chǎn)生氣泡1、流動相要求常用的低粘度溶劑：甲醇、乙腈等粘度過低的溶劑：戊烷、乙醚等第110頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六2、流動相組成按組成不同：單組分和多組分；按極性：極性、弱極性、非極性；按使用方式：固定組成淋洗和梯度淋洗。二元或多元組合溶劑可靈活調(diào)節(jié)流動相極性常用溶劑:烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、甲醇、水。二、流動相——淋洗液，洗脫劑第111頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六正相色譜：極性固定相——非極性流動相（加極性調(diào)節(jié)劑如氯仿）——極性柱（正相柱）三、固定相和流動相的選擇

反相色譜：非極性鍵合固定相（ODS）——極性流動相——非極性柱（反相柱）組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。流動相可選水或一定pH緩沖液，加甲醇或乙腈調(diào)節(jié)極性）第112頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六正相色譜低極性流動相反相色譜高極性流動相中等極性流動相中等極性流動相時間時間時間時間待測物極性：A>B>C正、反相色譜中極性和保留時間的關(guān)系第113頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六HPLC方法按流動相和固定相特征分為正相色譜、反相色譜按分離目的分為分析型、制備型按分離機(jī)理分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、空間排阻色譜等。第114頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六第二節(jié)HPLC方法及原理

一、液-液分配色譜法（LLPC）二、化學(xué)鍵合相色譜法（CBPC）三、液-固吸附色譜法(LSAC)四、離子交換色譜法（IEC）五、尺寸排阻色譜法（SEC）第115頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六一、液-液分配色譜法（LLPC）

1.固定相強(qiáng)極性固定液：β，β′一氧二丙睛中等極性固定液：聚乙二醇非極性固定液：角鯊?fù)?/p>

要求：流動相不與固定相互溶，流動相與固定相極性差別顯著——避免固定液流失2.流動相第116頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六

一、液-液分配色譜法（LLPC）適于各種極性化合物的分離4.用途根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不同的分配系數(shù)。

3.分離原理缺點(diǎn)：固定液機(jī)械涂漬、固定液易流失第117頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六1、反相鍵合相色譜法（RPBPC）固定相：采用極性較小的鍵合固定相，如硅膠-C18H37（ODS，C18）、硅膠-苯基等二、化學(xué)鍵合相色譜法（CBPC）流動相：

采用極性較強(qiáng)的溶劑，如甲醇、乙睛-水、水和無機(jī)鹽的緩沖溶液等。第118頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六分離機(jī)理——疏溶劑作用理論非極性的烷基鍵合相——硅膠表面的十八烷基“分子毛”——較強(qiáng)的疏水特性。二、化學(xué)鍵合相色譜法（CBPC）1、反相鍵合相色譜法（RPBPC）第119頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六分子中非極性部分——疏水烷基

——締合作用，分子保留分子極性部分——極性流動相

——離開固定相，減小保留兩種作用力之差，決定分子在色譜中的保留行為流動相——極性溶劑分離物——極性官能團(tuán)有機(jī)物第120頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六改變流動相配比可分離極性化合物用水和無機(jī)鹽的緩沖液為流動相可分離易離解的樣品有機(jī)酸、有機(jī)堿等。用途

1、反相鍵合相色譜法（RPBPC）主要用于分離非極性至中等極性的各類有機(jī)化合物二、化學(xué)鍵合相色譜法（CBPC）第121頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六固定相：極性的有機(jī)基團(tuán)，CN、NH2。雙羥基等鍵合在硅膠表面流動相：非極性或極性小的溶劑（如正已烷）中加入適量極性溶劑（如氯仿、醇等）

分離機(jī)理：范德華力、誘導(dǎo)力或氫鍵力用途：多用于分離極性或中等極性化合物2、正相鍵合相色譜法（NPBPC）二、化學(xué)鍵合相色譜法（CBPC）第122頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六3、離子鍵合相色譜法

固定相：硅膠為基質(zhì)，鍵合各種離子交換基團(tuán)，如一SO3H、一CH2NH2、－C00H流動相：一般采用緩沖溶液。二、化學(xué)鍵合相色譜法（CBPC）分離原理：與離子交換色譜類同用途：多用于分離離子型化合物如酸、無機(jī)陰陽離子、氨基酸等第123頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六分離原理：物質(zhì)在固定相上的吸附作用不同三、液-固吸附色譜法(LSAC)固定相：吸附活性強(qiáng)弱不等的吸附劑

硅膠、氧化鋁、聚酸膠等。流動相：各種極性的洗脫劑用途：非極性溶劑中、具有中等相對分子質(zhì)量且為非離子型的試樣。特別適用于分離異構(gòu)體第124頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六原理：不同待測離子對固定相親和力的差別固定相：基質(zhì)：合成樹脂（聚苯乙烯）、纖維素和硅膠表面鍵合離子：陽離子和陰離子交換樹脂四、離子交換色譜法（IEC）流動相：一定pH和鹽濃度的緩沖溶液用途：適用無機(jī)離子、有機(jī)離子混合物的分離例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。第125頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六固定相：

化學(xué)惰性的多孔性材料，如聚苯乙烯凝膠、親水凝膠、無機(jī)多孔材料。流動相：

作用不是為了控制分離，而是為了溶解樣品或減小流動相粘度。五、尺寸排阻色譜法（SEC）常用流動相——四氫呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水原理：利用被測組分分子大小不同、在固定相上選擇性滲透實現(xiàn)分離。第126頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六凝膠過濾色譜：以水或緩沖液作流動相主要適合于水溶性高分子的分離凝膠滲透色譜：以有機(jī)溶劑作流動相主要適合于脂溶性高分子的分離用途五、尺寸排阻色譜法（SEC）特點(diǎn)：固定相與分子間作用力趨于零，柱壽命長相對分子質(zhì)量差別必須大于10％才能分離第127頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六第五章HPLC的建立與應(yīng)用一、建立HPLC分析方法的一般步驟

1、根據(jù)被分析樣品的特性選擇適用于樣品分析的一種HPLC分離方式。材料來源、濃度范圍組分特性、結(jié)構(gòu)、分子量、溶解性等第128頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六

一、建立HPLC分析方法的一般步驟

第129頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六一、建立HPLC分析方法的一般步驟

2、選擇合適的分析方法適用的色譜柱：柱的規(guī)格（柱內(nèi)徑及柱長）和選用固定相（粒徑及孔徑）流動相檢測器樣品預(yù)處理第130頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六一、建立HPLC分析方法的一般步驟

3.分析條件的優(yōu)化流動相種類與配比梯度溫度流速檢測波長進(jìn)樣量第131頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六一、建立HPLC分析方法的一般步驟

4、由獲得的色譜圖進(jìn)行定性分析和定量分析。第132頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六二、HPLC定性定量分析方法1、定性分析（1）色譜鑒定法：保留時間對照各物質(zhì)在一定色譜條件下均有確定不變的保留時間，因此保留時間可作為定性指標(biāo)。第133頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六應(yīng)用范圍：適用于簡單混合物，對該樣品已有了解并具有純物質(zhì)的情況。優(yōu)點(diǎn)：應(yīng)用簡便，不需要其它儀器。缺點(diǎn)：定性結(jié)果的可信度不高。第134頁，共153頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)5分，星期六（2）與其他儀器或化學(xué)方法聯(lián)合定性混合物經(jīng)色譜分析后，將各組分直接由接口導(dǎo)入其它儀器中進(jìn)行定性。常用的聯(lián)用方法有：LC-