實驗 親和層析純化IgG課件

生物分離與純化實驗共34學時持續(xù)改進協(xié)作實驗報告：1.信息欄填全，遺漏項：同組人員；2.結果計算：過程完整3.討論分析不可缺項，內容豐滿，見解細致。上次實驗總結實驗（三）血清中抗體純化（16學時）低

pH下洗脫用rProteinASepharose?分離IgGColumn:HiTrap?ProteinAFF結合緩沖液: 20mM磷酸鈉,pH7.0洗脫緩沖液: 0.1M甘氨酸-HCl,pH3注意: 為了保護抗體的活性，將洗脫組分收集于1MTris-HCl,pH7.5中二、實驗原理二、實驗原理蛋白A和蛋白G的結合特異性種屬 蛋白A 蛋白G

結合 結合人IgA 可變的 -IgD - -IgEIgG1 ++++ ++++IgG2 ++++ ++++IgG3 - ++++IgG4 ++++ ++++IgM* 可變的 -鳥類蛋黃IgY? - -牛 ++ ++++狗 ++ +山羊 - ++豚鼠IgG1 ++++ ++IgG2 ++++ ++倉鼠 + ++馬 ++ ++++考拉 - +駱駝 - +種屬 蛋白A 蛋白G

結合 結合恒河猴 ++++ ++++大鼠IgG1 + ++++IgG2a ++++ ++++IgG2b +++ +++IgG3 ++ +++IgM* 可變的 -豬 +++ +++兔 ++++ +++小鼠IgG1 - +IgG2a - ++++IgG2b - ++IgG3 + ++綿羊 +/- +++

相對結合強度–弱或不結合三、實驗材料——純化試劑：磷酸二氫鈉、磷酸氫鈉、氯化鈉、異地酸二鈉、枸櫞酸、精氨酸、鹽酸胍、氫氧化鈉、95%乙醇；均為分析純。容器：50ml燒杯/三角瓶/試管10個；15ml收集試管5個；100ml三角瓶5個；250ml燒杯5個填料：ProteinA層析柱：XK10或預充柱裝柱體積：~2ml血清：~2ml濾器：0.45μm針頭式濾器5個；SDS:緩沖液：

平衡液：20mM磷酸二氫鈉，150mM氯化鈉，pH7.2；(1L)

沖洗液：20mM磷酸二氫鈉，0.5M氯化鈉，10mMEDTA二鈉，pH7.2；(1L)

洗脫液：0.1MGlycine-HCl，pH3.5；(1L)

清洗液：6mM氫氧化鈉。(1L)稀釋血清：

取2ml血清，用平衡緩沖液稀釋5倍，0.45um針頭濾器過濾。標記為S.三、實驗材料——純化三、實驗試劑——濃度測定考馬斯亮藍G-250蛋白染色液(1)牛血清白蛋白標準液（100ug/ml）精確稱取0.010g牛血清白蛋白，溶于約50ml蒸餾水，定容到100ml.(2)考馬斯亮藍G-250試劑

取100mg考馬斯亮藍G-250，溶于50ml90%乙醇中，加入85%正磷酸100ml，最后用蒸餾水定容到1000ml，此試劑在常溫下可放1個月。實驗步驟

1.ProteinA純化：

3）沖洗：加2倍柱體積沖洗緩沖液，打開止水夾，控制流出速度為2ml/min，并用試管收集流出液(記為W)，在床表面僅有1毫米左右液層時，關止水夾，再加入2倍柱體積平衡緩沖液沖洗填料，床表面僅有1毫米左右液層時，關止水夾，。4）洗脫收集：取刻度試管2支編號，柱床上面加3倍柱體積洗脫緩沖液，控制止水夾流出1倍柱體積洗脫液后，關止水夾，室溫下柱料與洗脫液孵育15min，打開止水夾控制流出速度為1ml/min收集2倍柱體積（記為E1），待床表面僅有1毫米左右液層時再加入3倍柱體積洗脫緩沖液，收集2倍柱體積記為E2。5）收集結束后，加入清洗液（6MNaOH）洗滌2cv，平衡液5cv。濃縮膠（5ml）雙蒸水0.5mol/LpH6.8Tris-HCl30%膠貯液10%SDSTEMED10%AP5%3.4ml0.63ml0.83ml50μl5μl50μl分離膠（10ml）雙蒸水1.5mol/LpH8.8Tris-HCl膠貯液10%SDSTEMED10%AP7.5%12%10%4.8ml3.3ml4.0ml2.5ml2.5ml2.5ml2.5ml4ml3.3ml100μl100μl100μl10μl10μl10μl100μl100μl100μl3、按比例配好分離膠，用移液管快速加入，大約5cm左右，之后加少許蒸餾水，靜置30分鐘。凝膠配制過程要迅速，催化劑TEMED要在注膠前再加入，否則凝結無法注膠。注膠過程最好一次性完成，避免產生氣泡。水封的目的是為了使分離膠上延平直，并排除氣泡。凝膠聚合好的標志是膠與水層之間形成清晰的界面。4、倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干，按比例配好濃縮膠，連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣5mm處，迅速插入樣梳，靜置10分鐘。樣梳需一次平穩(wěn)插入，梳口處不得有氣泡，梳底需水平。四、實驗步驟

2.SDS純度測定5、樣品處理：還原樣品：取30ul樣品（S,W,E1E2），加入30ul還原上樣緩沖液，100℃水浴5min，非還原樣品加入30ul非還原上樣緩沖液室溫孵育5min。6、加樣：拔出樣梳后，空出第一個孔，從第二個開始按已編排好的順序依次加入相應體積的樣品和蛋白Marker。其中S和Marker加樣量為2μl，W,E1，E2加樣量為15μl，還原與非還原樣品間空一孔道。注射器不可過低，以防刺破膠體，也不可過高，在樣下沉時會發(fā)生擴散。為避免邊緣效應，最好選用中部的孔注樣。四、實驗步驟

2.SDS純度測定7、電泳槽中加入緩沖液，接通電源，進行電泳，開始電壓恒定在160V，當進入分離膠后改為240V，溴酚藍距凝膠邊緣約5mm時，停止電泳。8、凝膠板剝離與染色：電泳結束后，用專用工具撬開短玻璃板，從凝膠板上切下一角作為加樣標記，然后放在大培養(yǎng)皿內，加入染色液微波煮沸后，染色10min左右。剝膠時要小心，保持膠完好無損，染色要充分。9、脫色：染色后的凝膠板用蒸餾水沖洗染色液，再用微波煮沸后的脫色液脫色，可更換2次，直到蛋白質區(qū)帶清晰。四、實驗步驟

2.SDS純度測定實驗步驟

3.蛋白質含量測定

1）取洗脫液E1，E20.5毫升，用蒸餾水稀釋至5毫升，然后吸取稀釋后的酶洗脫液G-250.5毫升，用考馬斯亮藍G-250染色法測定其蛋白質含量。

將凝膠至于