共振光散射技術(shù)在藥物分析中的應用

共振光散射技術(shù)在藥物分析中的應用【內(nèi)容摘要】對共振光散射技術(shù)在藥物與生物大分子分析測定中的應用狀態(tài)及其進展進行了綜述。重點介紹了該方法在生物體液中藥物的分析和中藥成分的分析應用前景。為體內(nèi)大分子藥物及其他藥物成分的檢測方法研究提供了新途徑?！颈疚年P(guān)鍵詞語】共振光散射技術(shù);藥物分析abstract:theapplicationandthedevelopmentoftheresonancelightscattering(rls)methodusedindrugdeterminationandthebiomacromoleculedeterminationwasreviewed.theapplicationofrlsinpharmaceuticalquantificationinbiologicalfluids,andtheapplicationofrlsinquantificationofchinesemedicinewerereviewed.thismethodmightbeanovelwayforthedeterminationmacromoleculardrugsandothermedicinalingredientsinvivo.keywords:resonancelightscattering;pharmaceuticalquantification共振光散射(resonancelightscattering，rls)是利用普通熒光分光光度法對散射光進行測量的一種散射光分析技術(shù)[1]。該技術(shù)由于其簡單、快速、靈敏的分析特點，吸引了生命科學、分析化學、環(huán)境科學、材料科學等領(lǐng)域的分析工作者對其理論和應用進行了深切進入的研究，促進了分析學科內(nèi)部各個分支之間的聯(lián)絡，尤其是在生化領(lǐng)域已經(jīng)獲得一定的研究結(jié)果[2]。光散射現(xiàn)象廣泛存在于光與粒子互相作用的經(jīng)過中，當介質(zhì)中粒子的直徑(d)與入射光波長(λ0)存在d≤0.05λ0時，產(chǎn)生的是以瑞利(rayleigh)散射為主的分子散射光[3]。根據(jù)rls理論能夠得到散射光強度與散射粒子的濃度c成正比的關(guān)系，即irls=kcb。據(jù)此能夠用于大分子物質(zhì)溶液的分析測定[1]。rls分析法靈敏度高，操作簡單方便，可通過普通熒光分光光度計同步掃描得到完好的rls特征光譜和相應rls峰。由于rls法源于rayleigh散射光吸收光譜，它對分子構(gòu)造大小和形狀(如球形、鏈形、無規(guī)則線團等)、電荷分布、鍵合性質(zhì)等研究還能提供新的、更豐富的信息。近年來的研究證明，rls法還可用于痕量金屬、外表活性劑以及納米材料[4,5]等方面的研究測定。該方法一般不需要對樣品進行復雜的化學預處理，避免了一系列煩瑣的操作程序，而直接將處理好的樣品溶液置于普通的熒光分光光度計中進行測定即可。1體液中生物大分子的測定1.1蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的功能許多，與生命的起源和生物的進化、細胞構(gòu)造、病毒、免疫、酶、激素、物質(zhì)的遺傳等有親密的聯(lián)絡，它是生命現(xiàn)象的物質(zhì)基礎。蛋白質(zhì)定量測定是生物化學和生命學科中經(jīng)常牽涉的分析內(nèi)容，在臨床醫(yī)學中也有主要應用。當前，蛋白質(zhì)測定方法重要有l(wèi)owry法[6]，bradford法[7]，biuret法[8]，bromoeersolgreen法[9]與bormophenolblue法[10]等。pasetmack[1]將rls技術(shù)用于測定微量蛋白質(zhì)以來，rls法分析技術(shù)以其方法簡單、快速、靈敏度高，在生物大分子分析測定研究中的報道日益增加，靈敏度可達納克級[11]。黃承志等研究了陰離子外表活性劑羅丹明b(rhodamineb，rhb)與十二烷基硫酸鈉(sds)蛋白質(zhì)體系的rls光譜特征。實驗發(fā)現(xiàn)，sds與hsa(humanserumalbumin，hsa)結(jié)合后再與rhb作用，其散射光強度加強。且rls加強的水平與蛋白的濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。據(jù)此，建立了一種測定人血清中總蛋白質(zhì)的新方法[12]。胡之德等基于在ph2.11的酸性溶液中，聚乙二醇辛基苯基醚(op)對亮麗春紅5r蛋白質(zhì)體系的rls信號有強烈的增敏現(xiàn)象，建立了op蛋白質(zhì)亮麗春紅5r三元體系測定人血清中蛋白質(zhì)濃度的新方法。該體系對人血清白蛋白檢測的線性范圍在0.0～10.0pg·ml-1之間，檢測限為5.0ng·ml-1，檢測實際樣品的回收率在97.80%～109.62%之間，方法令人滿意[13]。王錫寧等利用rls技術(shù)測定白蛋白、紅蛋白。研究了間苯二酚黃op蛋白質(zhì)體系rls光譜特性，確定了在340.0nm處，ph2.40，間苯二酚黃濃度為2.3×10-5mol·l-1，op的濃度為3.0×10-5mol·l-1時為最佳反應條件，據(jù)此建立了一種靈敏度高的測定蛋白質(zhì)的新方法[14]。薛蓓等研究了流動打針(fia)rls技術(shù)聯(lián)用在線測定人血清中蛋白質(zhì)含量。以sds為熒光探針，利用未曾報道過的rls與fia聯(lián)用檢測人血清樣品中蛋白質(zhì)含量。與單純用rls法測定比較，分析時間由40min縮短至1min，rls信號的重現(xiàn)性得到了顯著改善，提升了實驗的靈敏度和重現(xiàn)性[15]。梁宏等在普通熒光分光光度計上選擇適宜的激發(fā)光和發(fā)射光通帶寬度，利用rls技術(shù)，研究了生理ph值(7.43±0.02)，25℃下，金(ⅲ)與血清白蛋白的互相作用。初次觀測到金(ⅲ)對血清白蛋白的rls強度隨著金(ⅲ)濃度增長而降低。結(jié)果表示清楚，金(ⅲ)與血清白蛋白的結(jié)合會毀壞血清白蛋白分子聚集，使血清白蛋白中的二硫橋鍵斷裂，導致白蛋白分子趨于松懈，散射截面積減小，表現(xiàn)為rls強度降低[16]。1.2核酸核酸是遺傳信息的載體和基因表達的物質(zhì)基礎，在生物的生長、發(fā)育等活動中具有特別主要的作用。當前核酸分析測定的方法重要有分光光度法、熒光光度法、化學發(fā)光法、探針技術(shù)法、免疫分析法等，其中分光光度法[17]和熒光光度法[18]使用較多。紫外分光光度法操作簡單，但由于靈敏度低，測定的干擾因素多，使其在應用上遭到了限制;熒光分析法具有選擇性好和靈敏度高，但熒光試劑價格昂貴，而且部分熒光試劑有致癌活性。針對上述情況，rls法因操作簡便快速，靈敏度高，試劑無毒性等優(yōu)勢，在核酸分析中也得到了廣泛的應用。黃承志等利用溴化十六烷基三甲銨(cetyltrimethylammonsiumbromide,ctmab)是陽離子外表活性劑，核酸因帶有大量的磷酸根而帶負電荷的特性，證明了ctmab和核酸通過靜電引力共吸附到液/液界面上構(gòu)成兩性復合物，導致強烈增長的全內(nèi)反射共振光散射(totalinternalreflectedresonancelightscattering，tirrls)信號，tirrls信號強度與核酸的濃度呈線性[19]。劉紹璞等研究了5種陽離子外表活性劑與核酸反應的rls光譜[20]。陳展光等初次利用諾氟沙星做為rls光譜探針，測定了葉綠體脫氧核糖核酸(ctdna)。在ph5.87的br(brittonrobinson)緩沖溶液中，波長405.5nm處出現(xiàn)最大rls峰，ctdna的線性響應范圍為0.02～2.30μg·ml-1，檢測限為1.2ng·ml-1。還合成了希夫堿試劑三(2(鄰羥基苯基亞甲氨基)乙基)胺，而且研究了其與核酸在鹽酸介質(zhì)中的反應。對希夫堿劑三(2(鄰羥基苯基亞甲氨基)乙基)胺dna體系的研究發(fā)現(xiàn)，在393.0nm處增長的rls強度與核酸的濃度成線性關(guān)系(ctdna，0.01～4.50μg·ml-1;fsdna，0.01～5.00μg·ml-1)。ctdna的檢測限是1.4ng·ml-1，fsdna的檢測限是2.1ng·ml-1。結(jié)果與紫外可見分光光度法測得結(jié)果一致[21]。林楓等研究在ph4.0介質(zhì)中參加dna和陽離子外表活性劑可使二甲酚橙的rls加強，據(jù)此建立了以二甲酚橙為分子探針測定dna的分析方法，適用于合成樣品中的dna測定[22]。2在化學藥分析中的應用黃承志等利用具有雙親性的rhbctmab全內(nèi)反射共振光散射法測定肝素，肝素通過與rhb和ctmab互相作用構(gòu)成三元雙親性的復合物rhb肝素ctmab，而被rhb和ctmab協(xié)同吸附在水/四氯化碳(h2o/ccl4)界面上，引起強烈的tirrls加強信號用于肝素的測定[19]。陳展光等在氧氟沙星茜素紫3b體系中發(fā)現(xiàn)，ph5.09的br緩沖溶液中，在439.5nm處，0.10～2.50μg·ml-1范圍內(nèi)的氧氟沙星與增長的rls強度成線性關(guān)系。與此同時，在ph6.90，405.0nm處，0.05～3.00μg·ml-1范圍內(nèi)的氧氟沙星與rls強度成線性關(guān)系，檢測限分別為0.013μg·ml-1，0.021μg·ml-1[21]。氧氟沙星茜素紫3b體系可用于人體的氧氟沙星血藥濃度測定。還建立了人血清中抗菌類四季銨化合物的rls技術(shù)檢測方法[23]。陳展光等，建立的二溴羥基苯基熒光酮(dbhpf)曲通(triton)x100鉬的共振光散射光譜新體系，分析測定了中藥、頭發(fā)以及水中的微量鉬[21]。劉云富等研究發(fā)如今硫酸介質(zhì)中，砷鉬雜多酸與堿性染料rhb締合導致rhb體系的rls強度減弱，在一定濃度范圍內(nèi)，砷(ⅴ)的含量與體系減弱的rls強度成線性關(guān)系，據(jù)此建立了rls技術(shù)測定砷(ⅴ)的新方法[24]。3在中藥分析中的應用黃承志等，研究了熒光素(flu)小檗堿(be)全內(nèi)反射共振光散射法測定小檗堿。采取tirrls技術(shù)通過flu與be在水/1,2,二氯乙烷(h2o/dce)界面反應研究了be在界面上的特性。flu與be構(gòu)成雙親性的復合物，在h2o/dce界面富集，并引起強烈增長的tirrls信號，最大吸收波長位于373.0nm，所得信號強度在一定范圍內(nèi)與be濃度成正比關(guān)系，檢測限為1.3ng·ml-1。本方法與藥典使用的hplc方法對照靈敏度有所提升[19]。張憶華等，在ph為10.0的tris緩沖溶液中建立了綠原酸ctmabctdna體系，實驗表示清楚，440.0nm處加強的rls光強度(δirls)穩(wěn)定，在0.002～0.10μg·ml-1的濃度范圍內(nèi)，體系δirls與ctdna的濃度具有良好的線性關(guān)系，檢測限為0.6ng·ml-1。在厚樸酚ctmabctdna體系中，選擇ph值為10.0的tris緩沖溶液來控制反應體系的酸度，356.0nm作為定量分析的波長。在0.02～1.00μg·ml-1的濃度范圍內(nèi)，δirls與ctdna的濃度具有良好的線性關(guān)系。在最佳反應條件，320.0nm處，ph10.0時，兒茶素ctmabctdna體系在0.02～1.00μg·ml-1的濃度范圍內(nèi)，δirls與ctdna的濃度成線性關(guān)系。類似的實驗還有山柰酚ctmabctdna體系。除此之外，張憶華還研究了三價稀土離子與槲皮素、山柰酚所構(gòu)成的絡合物的rls光譜，研究了ctdna對它的淬滅作用。建立了tb3+/eu3+槲皮素ctdna體系以及tb3+/eu3+山柰酚ctdna體系，結(jié)果表示清楚，槲皮素與山柰酚通過配位作用與tb3+/eu3+結(jié)合，引起體系rls光強度的增長，而當參加ctdna后，體系的rls光強度降低，原因是ctdna構(gòu)造中的磷酸骨架能夠與tb3+和eu3+發(fā)生螯合作用，導致溶液中ctdna和山柰酚與tb3+/eu3+的競爭配位。該方法獲得了明顯的實驗結(jié)果[25]。4結(jié)束語由于rls技術(shù)是建立在普通光譜法基礎上，分析結(jié)果固然是物質(zhì)的散射光譜信息，但物質(zhì)形態(tài)特征等卻不能被獲取。基于此問題，一種結(jié)合顯微成像技術(shù)的共振光散射成像技術(shù)被建立起來，對生物大分子的聚集形態(tài)進行了深切進入的研究和討論[26]，儀器的性能和工作條件對所獲信號影響大。由于rls光譜在較大光譜通帶下獲得，因此晦氣于光譜精細構(gòu)造的研究。固然我們知道散射光強度與散射粒子濃度有關(guān)，但出發(fā)點是從同步光譜開始的，顯然其測定公式推導并未牽涉rls的散射實質(zhì)。因而，用于分析化學的rls技術(shù)原理與定量基礎尚未有定論。固然rls技術(shù)作為一種新興的分析測定技術(shù)存在一些不足，但隨著rls技術(shù)理論和應用上研