酶在食品中的應(yīng)用講課課件

通過合理開發(fā)和應(yīng)用酶制劑及相關(guān)酶工程技術(shù)可有效提高食品原料的深加工程度、改進(jìn)食品的加工工藝以及改善食品的風(fēng)味和品質(zhì)，從而達(dá)到提高產(chǎn)品得率和質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本。通過合理開發(fā)和應(yīng)用酶制劑及相關(guān)酶工程技術(shù)可有1

目前，酶技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)的各個領(lǐng)域，如食品保鮮、制糖工業(yè)、釀造工業(yè)、、焙烤工業(yè)、乳制品工業(yè)、水果蔬菜加工、肉類及魚蝦類加工、蛋品加工、天然食品添加劑的生產(chǎn)以及改善食品的品質(zhì)和風(fēng)味等諸多方面。目前，酶技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)的各個領(lǐng)域，2一、在食品保鮮方面的應(yīng)用

食品在加工、運(yùn)輸和保鮮過程中，常易受到氧氣、微生物、溫度、濕度、光線等各種外界因素的影響，因使食品的色、香、味及營養(yǎng)會發(fā)生變化，甚至導(dǎo)致食品敗壞，降低食品的食用價值。因此，食品保鮮已是食品加工、運(yùn)輸、保藏中的重要問題，已引起食品行業(yè)的廣泛關(guān)注。一、在食品保鮮方面的應(yīng)用食品在加工、運(yùn)輸和保鮮3中性環(huán)境下,酶活損失較低,在pH6.1、在淀粉食品的加工與生產(chǎn)方面的應(yīng)用白酒和黃酒產(chǎn)業(yè)是我國的一大傳統(tǒng)民族工業(yè),多年來為我國的國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展作出了較大貢獻(xiàn)。在果蔬類食品的生產(chǎn)過程中，為了提高產(chǎn)量和產(chǎn)品質(zhì)量，常常使用各種酶。bolteaeDPEase酶的最適pH及pH穩(wěn)定性coliBL21/pET-22b(+)-CLOBOL_00069。6、在乳制品工業(yè)中的應(yīng)用3、在果蔬食品的加工與生產(chǎn)方面的應(yīng)用將質(zhì)粒pMD-CLOBOL_00069與載體pET-22b(+)分別用NdeI和XhoI酶切后,回收酶切產(chǎn)物的目的條帶純化后進(jìn)行連接,其構(gòu)建過程如圖2-8所示。利用mazF基因作為反向篩選標(biāo)記,成功構(gòu)建食品級重組菌株B.四、D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶bolteaeATCCBAA-613的DPEase的基因序列,利用pET-22b(+)表達(dá)載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主Escherichia.1、在淀粉食品的加工與生產(chǎn)方面的應(yīng)用其中包含的金屬離子結(jié)合位點表明金屬離子在催化時對于底物結(jié)合有重要的作用可穩(wěn)定差向異構(gòu)化過程中生成的烯二醇中間產(chǎn)物。bolteaeDPEase酶進(jìn)行表達(dá),成功構(gòu)建重組菌株B.

酶法保鮮技術(shù)就是利用酶的高效專一的催化作用，防止、降低或消除各種外界因素對食品產(chǎn)生的不良影響，進(jìn)而達(dá)到保持食品的優(yōu)良品質(zhì)和風(fēng)味特色，以及延長食品保藏期的技術(shù)。中性環(huán)境下,酶活損失較低,在pH6.酶法4

目前，葡萄糖氧化酶、溶菌酶等已應(yīng)用于罐裝果汁、果酒、水果罐頭、脫水蔬菜、肉類及蝦米類食品、低酒度、香腸、糕點、飲料、干酪、水產(chǎn)品、啤酒、清酒、鮮奶、奶粉、奶油、生面條等各種食品的防腐保鮮，并取得了較大進(jìn)展。目前，葡萄糖氧化酶、溶菌酶等已應(yīng)用于罐裝果汁、5二、在食品加工與生產(chǎn)方面的應(yīng)用

大多數(shù)用途是在原料的加工與食品的生產(chǎn)。應(yīng)用領(lǐng)域主要包括：淀粉類食品、蛋白質(zhì)類食品、果蔬類食品、乳制品、飲料、天然食品添加劑等。二、在食品加工與生產(chǎn)方面的應(yīng)用

大多數(shù)用途61、在淀粉食品的加工與生產(chǎn)方面的應(yīng)用2、在蛋白質(zhì)制品的加工與生產(chǎn)方面中的應(yīng)用3、在果蔬食品的加工與生產(chǎn)方面的應(yīng)用4、在釀酒工業(yè)中的應(yīng)用5、在焙烤食品制造中的應(yīng)用6、在乳制品工業(yè)中的應(yīng)用1、在淀粉食品的加工與生產(chǎn)方面的應(yīng)用71、在淀粉食品的加工與生產(chǎn)方面的應(yīng)用淀粉類食品是含有大量淀粉或以淀粉為主要原料加工的食品。淀粉在淀粉酶的催化下可以產(chǎn)生葡萄糖、麥芽糖、麥芽糖漿、麥芽糖醇、糊精、麥芽糊精、低聚糖、果糖等?；蚩梢陨晒咸菨{、環(huán)狀糊精（通過葡萄糖異構(gòu)酶、環(huán)狀糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶等的作用）現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于糖果、冰淇淋、飲料、面包等的加工。1、在淀粉食品的加工與生產(chǎn)方面的應(yīng)用淀粉類食品是含有大量淀粉82、在蛋白質(zhì)制品的加工與生產(chǎn)方面中的應(yīng)用蛋白質(zhì)食品是一種以蛋白質(zhì)為主要原料加工而成的食品。以天然的大分子蛋白存在的蛋白質(zhì)往往不具有生物活性或加工性能較差，而經(jīng)過某些蛋白酶的水解后往往能夠提高其生物活性或加工性能。目前較常用的是蛋白酶和乳糖酶。2、在蛋白質(zhì)制品的加工與生產(chǎn)方面中的應(yīng)用蛋白質(zhì)食品是一種以蛋93、在果蔬食品的加工與生產(chǎn)方面的應(yīng)用

在果蔬類食品的生產(chǎn)過程中，為了提高產(chǎn)量和產(chǎn)品質(zhì)量，常常使用各種酶。水果蔬菜加工用酶中最常用的有果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶等。將酶制劑應(yīng)用于果蔬加工，主要有以下幾方面的作用。3、在果蔬食品的加工與生產(chǎn)方面的應(yīng)用

在果蔬類食品的生產(chǎn)過程10果蔬本身所含有的果膠、纖維素、淀粉和蛋白質(zhì)等是引起果蔬汁渾濁、褐變等不良因素的主要原因，以傳統(tǒng)的壓榨和過濾等生產(chǎn)工藝難以使果蔬汁達(dá)到較高品質(zhì)，并且營養(yǎng)成分大量損失。而酶技術(shù)的應(yīng)用，不僅克服了傳統(tǒng)加工工藝的缺點，且大幅度增加了果蔬汁的品質(zhì)。在提高果蔬出汁率方面應(yīng)用最廣泛的酶是果膠酶，其次是纖維素酶。此外在增香、除異味、提取果膠、真空或加壓滲酶法處理完整果蔬和提取蔬菜汁中酶的應(yīng)用也非常廣泛。果蔬本身所含有的果膠、纖維素、淀粉和蛋白質(zhì)等是引起果蔬汁渾濁114、在釀酒工業(yè)中的應(yīng)用

1、啤酒工業(yè)中的應(yīng)用

啤酒以其特有的“麥芽的香味、細(xì)膩的泡沫、酒花的苦澀、透明的酒質(zhì)”為人們所喜愛。由于啤酒含有豐富的氨基酸和維生素,因此被稱為“液體面包”。制麥芽大麥含有全麥啤酒釀造用到的所有的酶,現(xiàn)在企業(yè)用到大量的谷物作為替代品,所以需要外源酶。而利用現(xiàn)代酶工程技術(shù)與傳統(tǒng)啤酒釀造技術(shù)相結(jié)合,將提高啤酒質(zhì)量,降低生產(chǎn)成本,增加企業(yè)效益。酶在啤酒生產(chǎn)中的作用主要有輔料液化、提高發(fā)酵度降低雙乙酰、改善麥汁過濾、增加α-氨基酸、提高啤酒穩(wěn)定性、改善膜過濾速度、消除雜菌污染、啤酒除氧等。4、在釀酒工業(yè)中的應(yīng)用

1、啤酒工業(yè)中的應(yīng)用122、白酒和黃酒工業(yè)中的應(yīng)用

白酒和黃酒產(chǎn)業(yè)是我國的一大傳統(tǒng)民族工業(yè),多年來為我國的國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展作出了較大貢獻(xiàn)?，F(xiàn)代的白酒和黃酒的生產(chǎn),既要保持原酒的風(fēng)味特色,又要提高出酒率、簡化操作,這就要求傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝和現(xiàn)代技術(shù)相結(jié)合。目前,酶在這兩種酒的生產(chǎn)應(yīng)用中已經(jīng)很廣泛。2、白酒和黃酒工業(yè)中的應(yīng)用13釀酒工業(yè)中廣泛應(yīng)用的酶主要是糖化酶、液化酶、纖維素酶、蛋白酶、酯化酶等,具有酶活力強(qiáng)、用量少、使用方便等優(yōu)點,適量添加可提高出酒率和品質(zhì)。糖化酶、液化酶是白酒黃酒釀造中主要用酶,目前流行的生料釀酒和液化法黃酒釀造也主要是利用這兩種酶直接將淀粉液化糊化糖化來代替蒸煮作用的原理,而通過酶的固定化技術(shù)將它們固定在載體上,效果更好,也是當(dāng)前研究的熱點。釀酒工業(yè)中廣泛應(yīng)用的酶主要是糖化酶、液化酶、纖維素酶、蛋白酶145、在焙烤食品制造中的應(yīng)用

在一些國家對用化學(xué)劑改良法將作出立法限制，這就意味著更需要用酶法工藝來生產(chǎn)受歡迎的產(chǎn)品。用作焙烤食品面粉來源的小麥和其他谷物含有一些天然存在的酶,這些酶對于谷物的發(fā)芽和生長是必需的。這些酶在焙烤工藝中亦十分重要,沒有它們,焙烤加工便不可能。這些酶包括：淀粉酶、蛋白酶、脂肪氧合酶、乳糖分解酶等。5、在焙烤食品制造中的應(yīng)用在一些國家對156、在乳制品工業(yè)中的應(yīng)用

近年,

酶在乳品中的應(yīng)用已擴(kuò)展到更廣的領(lǐng)域?？偟膩碚f,當(dāng)前在乳制品生產(chǎn)中最常用、最重要的幾種酶為蛋白酶主要為凝乳酶、乳糖酶、乳過氧化物酶和脂肪酶等。酶在乳制品中最主要的應(yīng)用是蛋白酶的應(yīng)用,

特別是用凝乳酶加工干酪,

以及用乳糖酶將乳糖分解,

以提高有乳糖不耐癥的人對乳制品的消化力。乳過氧化物酶保鮮鮮奶和乳制品也已在國內(nèi)、國際得到了較廣泛的應(yīng)用。6、在乳制品工業(yè)中的應(yīng)用

近年,

酶在乳16三、在食品添加劑方面的應(yīng)用

食品添加劑是指用于改善食品品質(zhì)和風(fēng)味，以及為防腐和加工工藝的需要而加入食品中的少量化學(xué)合成或天然物質(zhì)，現(xiàn)已成為現(xiàn)代食品行業(yè)中不可缺少的部分。三、在食品添加劑方面的應(yīng)用

食品添加劑是17

按照食品添加劑的功能不同，可以分為酸味劑、抗結(jié)劑、抗氧化劑、漂白劑、膨松劑、著色劑、護(hù)色劑、酶制劑、增味劑、營養(yǎng)強(qiáng)化劑、防腐劑、甜味劑、增稠劑、香味劑等二十余類。按照食品添加劑的功能不同，可以分為酸味劑18酶法保鮮技術(shù)就是利用酶的高效專一的催化作用，防止、降低或消除各種外界因素對食品產(chǎn)生的不良影響，進(jìn)而達(dá)到保持食品的優(yōu)良品質(zhì)和風(fēng)味特色，以及延長食品保藏期的技術(shù)。淀粉在淀粉酶的催化下可以產(chǎn)生葡萄糖、麥芽糖、麥芽糖漿、麥芽糖醇、糊精、麥芽糊精、低聚糖、果糖等。三、在食品添加劑方面的應(yīng)用這些酶包括：淀粉酶、蛋白酶、脂肪氧合酶、乳糖分解酶等。bolteaeD-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的分離、純化及酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明,DPEase酶可在B.bolteaeDPEase酶的平衡率在啟動子P43的作用下,C.coliBL21/pET-22b(+)-CLOBOL_00069。coliBL21(DE3),成功構(gòu)建重組菌株E.研究表明,單一糖類消耗成為糖尿病發(fā)病的主要因素之一。bolteaeDTEase酶基因的測序及序列分析在提高果蔬出汁率方面應(yīng)用最廣泛的酶是果膠酶，其次是纖維素酶。淀粉類食品是含有大量淀粉或以淀粉為主要原料加工的食品。bolteaeDPEase酶的酶學(xué)性質(zhì)

隨著酶工程技術(shù)的迅速發(fā)展，作為高效、安全的生物催化劑，酶已在食品添加劑的生產(chǎn)中得到較為廣泛的應(yīng)用。酶法保鮮技術(shù)就是利用酶的高效專一的催化作用，防止、降低或消除19四、D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶

D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶家族酶可催化醛酮糖C-3位的差向異構(gòu),從而實現(xiàn)D-果糖向D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化。D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶家族酶因其底物專一性的不同,被分為D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶(DTEase酶)和D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶(DPEase酶)兩類。四、D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶家族201、DTEase家族酶的微生物來源自1993年,日本學(xué)者第一次于PseudomonascichoriiST-24中發(fā)現(xiàn)一種可以催化己酮糖C-3位差向異構(gòu)化的酶,命名為D-己酮糖3-差向異構(gòu)酶。因其最適底物為D-塔格糖,后重新命名為DTEase酶。隨后,又發(fā)現(xiàn)另一種潛在的DTEase酶,該酶的最適底物為D-阿洛酮糖,可高效催化D-果糖與D-阿洛酮糖之間的轉(zhuǎn)化,因此被命名為DPEase酶。與DTEase酶相比,DPEase酶對果糖的差向異構(gòu)活性更高,具有更高的應(yīng)用價值,所以近年來研究主要集中在DPEase酶上。1、DTEase家族酶的微生物來源自1993年,日本學(xué)者第212、DTEase家族酶的酶學(xué)性質(zhì)微生物來源不同的DTEase家族酶具有不同的酶學(xué)性質(zhì)。雖然DTEase家族酶的氨基酸序列同源性不高(20%~62%),但DTEase家族酶都可以催化D-果糖和D-阿洛酮糖的相互轉(zhuǎn)化,其活性中心,金屬離子結(jié)合部位和底物結(jié)合位點的關(guān)鍵氨基酸殘基高度保守。2、DTEase家族酶的酶學(xué)性質(zhì)微生物來源不同的DTEa22

3、DTEase家族酶的蛋白質(zhì)工程來源于A.tumefaciens和C.cellulolyticum的DPEase酶及來源于P.cichorii的DTEase酶的晶體結(jié)構(gòu)被揭示。DTEase家族酶具有一個典型的TIM桶狀結(jié)構(gòu),由8個重復(fù)的β-折疊和α-螺旋單元構(gòu)成(β/α)8結(jié)構(gòu)。其中包含的金屬離子結(jié)合位點表明金屬離子在催化時對于底物結(jié)合有重要的作用可穩(wěn)定差向異構(gòu)化過程中生成的烯二醇中間產(chǎn)物。3、DTEase家族酶的蛋白質(zhì)工程來源于A.tumef23ClostridiumbolteaeD-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的蛋白質(zhì)工程與食品級表達(dá)江南大學(xué)食品生物技術(shù)2014.6五、

ClostridiumbolteaeD-阿洛酮糖3-差向24摘要糖尿病是一種世界性新興的疾病,嚴(yán)重威脅人類的健康。研究表明,單一糖類消耗成為糖尿病發(fā)病的主要因素之一。因此,利用低血糖應(yīng)答的甜味劑代替蔗糖成為預(yù)防糖尿病的有效方法。摘要糖尿病是一種世界性新興的疾病,嚴(yán)重威脅人類的健康。研究25D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3位差向異構(gòu)體,是一種己酮糖甜味劑,屬于稀有糖。D-阿洛酮糖的甜度為蔗糖的70%,但其能量僅為蔗糖的0.3%,是食品中理想的代糖品。D-阿洛酮糖具有降低血糖、降低血脂、清除活性氧自由基和神經(jīng)保護(hù)等重要的生理功能。在食品加工過程中,可改善凝膠特性并可產(chǎn)生良好的風(fēng)味。D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3位差向異構(gòu)體,是一種己酮糖甜味26D-阿洛酮糖在天然產(chǎn)品中存在較少,但生物催化新技術(shù)的開發(fā)使D-阿洛酮糖的大規(guī)模生產(chǎn)成為可能。D-阿洛酮糖在天然產(chǎn)品中存在較少,但生物催化新技術(shù)的開發(fā)使D27本研究前期利用鮑氏梭菌(Clostridiumbolteae)ATCCBAA-613進(jìn)行全細(xì)胞反應(yīng),確定該菌株具有催化D-果糖差向異構(gòu)生成D-阿洛酮糖的能力,無副產(chǎn)物產(chǎn)生。在此基礎(chǔ)上,對該鮑氏梭菌(C.bolteae)ATCCBAA-613全基因組中預(yù)測的DPEase酶基因進(jìn)行克隆、表達(dá);對DPEase酶進(jìn)行分離純化、酶學(xué)性質(zhì)、構(gòu)效關(guān)系及分子改造等方面進(jìn)行研究;實現(xiàn)DPEase酶在食品級宿主枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis中表達(dá),并分別基于Cre/lox系統(tǒng)和反向篩選標(biāo)記mazF基因,成功構(gòu)建食品級表達(dá)系統(tǒng)。本研究前期利用鮑氏梭菌(Clostridiumboltea281、C.bolteaeD-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá)（1）、

C.bolteaeDTEase酶基因的擴(kuò)增（2）、PCR產(chǎn)物的克?。?）、C.bolteaeDTEase酶基因的測序及序列分析（4）、D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建（5）、誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化（6）、重組E.coli細(xì)胞催化D-果糖差向異構(gòu)化反應(yīng)（7）、D-阿洛酮糖的鑒定1、C.bolteaeD-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因29酶在食品中的應(yīng)用講課課件30證明基因CLOBOL_00069所翻譯的假定蛋白,其關(guān)鍵序列與DTEase家族酶有很高的同源性,具有相同的保守序列,因此,EDP19602可能是一種DTEase家族酶。證明基因CLOBOL_00069所翻譯的假定蛋白,其關(guān)鍵序31將質(zhì)粒pMD-CLOBOL_00069與載體pET-22b(+)分別用NdeI和XhoI酶切后,回收酶切產(chǎn)物的目的條帶純化后進(jìn)行連接,其構(gòu)建過程如圖2-8所示。載體pET-22b(+)帶有C末端His-Tag序列,利用pET-22b(+)表達(dá)的重組蛋白帶有6個His標(biāo)記,可利用Ni2+-ChelatingFaseFlow親和色譜柱進(jìn)行純化。將質(zhì)粒pMD-CLOBOL_00069與載體pET-232酶在食品中的應(yīng)用講課課件332、C.bolteaeD-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的分離、純化及酶學(xué)性質(zhì)研究（1）、Ni2+-ChelatingSepharoseFastFlow親和層析（2）、Superdex200(10/300GL)凝膠層析純化結(jié)果（3）、Superdex200凝膠色譜確定C.bolteaeDPEase酶的分子量（4）、金屬離子對C.bolteaeDPEase酶酶活的影響（5）、C.bolteaeDPEase酶的最適pH及pH穩(wěn)定性（6）、C.bolteaeDPEase酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性（7）、C.bolteaeDPEase酶的底物特異性及酶反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)研究（8）、C.bolteaeDPEase酶的平衡率2、C.bolteaeD-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的分離34C.bolteaeDTEase酶亞基分子量約為34kDa,比預(yù)測的分子量33kDa大約1kDa,可能是由于在其C端增加6個組氨酸標(biāo)簽。經(jīng)過Ni2+-ChelatingSepharoseFastFlow親和層析柱純化后,即可獲得較純的目的蛋白。計算得到目的蛋白分子量約為139kDa,說明該DTEase酶可能是四聚體。此結(jié)果與來源于A.Tumefaciens和C.cellulolyticum等DTEase家族酶中的DPEase酶一致。C.bolteaeDTEase酶亞基分子量約為34kD35該酶的最適反應(yīng)pH為7.0。中性環(huán)境下,酶活損失較低,在pH6.0~7.5的緩沖液中保持2h后,殘余酶活可在90%以上;而在偏酸或偏堿性環(huán)境下,其酶活損失較大。酶的在55℃的酶活最高當(dāng)溫度<55℃時,酶活力隨溫度的升高而升高,當(dāng)溫度>60℃后,酶活力隨溫度升高而顯著下降該酶的最適反應(yīng)pH為7.0。中性環(huán)境下,酶活損失較低,363、C.bolteaeD-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因的催化機(jī)理初探及分子改造（1）、

C.bolteaeDPEase的結(jié)構(gòu)分析及活性位點預(yù)測（2）、

改造位點的確定（3）、

Ala掃描定點突變（4）、催化活性中心關(guān)鍵氨基酸Glu152和Glu246的定點突變（5）、底物結(jié)合關(guān)鍵氨基酸Glu158,His188和Arg217的定點突變（6）、底物識別關(guān)鍵氨基酸Tyr68和Gly109的定點突變（7）、Y68和G109位突變體酶的酶學(xué)性質(zhì)（8）、雙突變體酶Y68I/G109P的酶學(xué)性質(zhì)研究3、C.bolteaeD-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因的374、C.bolteaeD-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)（1）、

C.bolteaeDPEase酶基因克隆（2）、

B.subtilis重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定（3）、B.subtilis重組菌的表達(dá)及活性鑒定（4）、重組C.bolteaeDPEase酶的分離純化（5）、重組

C.bolteaeDPEase酶的酶學(xué)性質(zhì)4、C.bolteaeD-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因在385、基于Cre/lox系統(tǒng)的C.bolteaeD-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因的食品級表達(dá)（1）、重疊PCR（2）、pP43DPE載體的克隆（3）、表達(dá)載體pDGI-7S6的構(gòu)建（4）、表達(dá)載體pDGI-7S6-DPE的構(gòu)建（5）、重組菌B.Subtilis/7S6-DPE的構(gòu)建及篩選（6）、重組菌B.subtilis/lox-DPE,pTSC的構(gòu)建及篩選（7）、重組菌B.subtilis/lox-DPE的構(gòu)建及篩（8）、重組菌B.subtilis/lox-DPE的發(fā)酵曲線5、基于Cre/lox系統(tǒng)的C.bolteaeD-阿洛酮394mmol/L時,C.或可以生成果葡糖漿、環(huán)狀糊精（通過葡萄糖異構(gòu)酶、環(huán)狀糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶等的作用）現(xiàn)代的白酒和黃酒的生產(chǎn),既要保持原酒的風(fēng)味特色,又要提高出酒率、簡化操作,這就要求傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝和現(xiàn)代技術(shù)相結(jié)合。subtilisWB800/pMA5-cbdpe-Y68I/G109P。這些酶包括：淀粉酶、蛋白酶、脂肪氧合酶、乳糖分解酶等。淀粉在淀粉酶的催化下可以產(chǎn)生葡萄糖、麥芽糖、麥芽糖漿、麥芽糖醇、糊精、麥芽糊精、低聚糖、果糖等。D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶家族酶可催化醛酮糖C-3位的差向異構(gòu),從而實現(xiàn)D-果糖向D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化。coli細(xì)胞催化D-果糖差向異構(gòu)化反應(yīng)通過合理開發(fā)和應(yīng)用酶制劑及相關(guān)酶工程技術(shù)可有效提高食品原料的深加工程度、改進(jìn)食品的加工工藝以及改善食品的風(fēng)味和品質(zhì)，從而達(dá)到提高產(chǎn)品得率和質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本。水果蔬菜加工用酶中最常用的有果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶等。利用Cre/lox系統(tǒng)成功構(gòu)建食品級重組菌株B.目前，葡萄糖氧化酶、溶菌酶等已應(yīng)用于罐裝果汁、果酒、水果罐頭、脫水蔬菜、肉類及蝦米類食品、低酒度、香腸、糕點、飲料、干酪、水產(chǎn)品、啤酒、清酒、鮮奶、奶粉、奶油、生面條等各種食品的防腐保鮮，并取得了較大進(jìn)展。（6）、底物識別關(guān)鍵氨基酸Tyr68和Gly109的定點突變（2）、PCR產(chǎn)物的克隆subtilisWB800/pMA5-cbdpe-Y68I/G109P。6、基于mazF反向篩選標(biāo)記的C.bolteaeD-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因的食品級表達(dá)（1）、表達(dá)載體pDGI-DPE的構(gòu)建（2）、重組菌

B.subtilis/REF的構(gòu)建及篩選（3）、重組菌B.subtilis/DPE的構(gòu)建及篩選（4）、重組菌B.subtilis/DPE的發(fā)酵曲線4mmol/L時,C.6、基于mazF反向篩選標(biāo)記的C.407、結(jié)論1、利用PCR的方法擴(kuò)增獲得C.bolteaeATCCBAA-613的DPEase的基因序列,利用pET-22b(+)表達(dá)載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主Escherichia.coliBL21(DE3),成功構(gòu)建重組菌株E.coliBL21/pET-22b(+)-CLOBOL_00069。2.對重組菌株E.coliBL21/pET-22b(+)-CLOBOL_00069的誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行研究。結(jié)果表明在對數(shù)生長中期OD值為1.0左右后,加入終濃度為5g/L的乳糖,20℃

條件下誘導(dǎo)7h,可達(dá)到最大酶活,為6.1U/mL發(fā)酵液。利用重組菌株E.coliBL21/pET-22b(+)-CLOBOL_00069全細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。經(jīng)鑒定,產(chǎn)物為D-阿洛酮糖,說明C.bolteaeATCCBAA-613的DPEase基因在E.coliBL21中表達(dá)正確并具有轉(zhuǎn)化D-果糖為D-阿洛酮糖的能力。7、結(jié)論1、利用PCR的方法擴(kuò)增獲得C.bolteaeA413.利用Ni2+-ChelatingSepharoseFastFlow親和層析柱和Superdex20010/300GL凝膠柱對C.bolteaeDPEase酶進(jìn)行分離純化,其亞基分子量約為34kDa,酶蛋白分子量為139kDa,證實來源于C.bolteae的DPEase酶為四聚體酶。C.bolteaeDPEase酶是金屬蛋白酶,Mn2+和Co2+可顯著增強(qiáng)酶活。當(dāng)Co2+濃度為0.4mmol/L時,C.bolteaeDPEase酶獲得最大酶活。4.C.bolteaeDPEase酶的最適反應(yīng)pH為7.0,在pH6.5~7.5之間其相對酶活較高,表現(xiàn)出良好的活性。最適反應(yīng)溫度為55℃,在45℃以下,該酶較穩(wěn)定,當(dāng)溫度大于50℃時,酶的熱穩(wěn)定性較差。在Co2+存在的情況下,酶的熱穩(wěn)定性顯著提高。55℃

時,Co2+的添加可使酶的半衰期延長至原來的3.6倍。3.利用Ni2+-ChelatingSepharose425.研究C.bolteaeDPEase酶的底物特異性,發(fā)現(xiàn)該酶對D-阿洛酮糖的底物特異性最高,D-果糖次之,其次為D-塔格糖,而對磷酸化的糖基本沒有作用。并測定該酶的動力學(xué)常數(shù),當(dāng)以D-阿洛酮糖作為底物時,其Km、kcat和kcat/Km分別為27.4mM、2935min-1和107.1min-1mM-1。該酶對D-阿洛酮糖的Km值遠(yuǎn)小于其他底物,催化效率kcat/Km較其他底物更大,其說明其對D-阿洛酮糖的親和性更高,其最適底物是D-阿洛酮糖。因此該酶被鑒定為D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶。5.研究C.bolteaeDPEase酶的底物特異性436.利用已有的晶體結(jié)構(gòu)信息,利用SWISS-MODEL對C.bolteaeDPEase酶單體的結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬,利用Discoverystudio軟件對C.bolteaeDPEase酶和D-果糖進(jìn)行對接,獲得位于活性中心的關(guān)鍵氨基酸位點為Glu158,His188,Arg217,Glu152,Glu246,Y68和G109。突變結(jié)果表明,Glu152和Glu246為催化活性中心關(guān)鍵氨基酸,Glu158,His188和Arg217與底物結(jié)合有關(guān),68和109位的氨基酸與底物識別有關(guān),影響活性口袋的形成。并成功構(gòu)建雙突變體Y68I/G109P,該突變體酶對D-果糖的親和能力更高,具有更好的熱穩(wěn)定性。6.利用已有的晶體結(jié)構(gòu)信息,利用SWISS-MODEL447.利用B.subtilisWB800對C.bolteaeDPEase酶進(jìn)行表達(dá),成功構(gòu)建重組菌株B.subtilisWB800/pMA5-cbdpe-Y68I/G109P。該重組菌株無需誘導(dǎo)即可產(chǎn)生DPEase酶,18h時酶活可達(dá)到6.8U/mL。該酶最適pH為7.0,最適溫度為60℃,與E.coli表達(dá)的DPEase酶酶學(xué)性質(zhì)相似。結(jié)果表明,DPEase酶可在

B.subtilis中表達(dá)。7.利用B.subtilisWB800對C.b458.利用Cre/lox系統(tǒng)成功構(gòu)建食品級重組菌株B.Subtilis/lox-DPE,獲得的最高酶活可達(dá)6.5U/mL發(fā)酵液(B.subtilis1A751/lox-DPE)。其OD600值可達(dá)12左右,遠(yuǎn)高于重組菌

B.subtilisWB800/pMA5-cbdpe-Y68I/G109P。在啟動子P43的作用下,C.bolteaeDPEase酶基因在對數(shù)期及穩(wěn)定期均可高效迅速的表達(dá)。8.利用Cre/lox系統(tǒng)成功構(gòu)建食品級重組菌株B.469.利用mazF基因作為反向篩選標(biāo)記,成功構(gòu)建食品級重組菌株B.subtilis/DPE,獲得最高酶活可達(dá)6.4U/mL發(fā)酵液(B.subtilis1A751/DPE),與重組菌B.subtilis/lox-DPE和重組菌B.subtilisWB800/pMA5-cbdpe的最高酶活相差不大。其OD600值可達(dá)12左右,與重組菌B.subtilis/lox-DPE相同,遠(yuǎn)高于重組菌B.subtilisWB800/pMA5-cbdpe-Y68I/G109P。9.利用mazF基因作為反向篩選標(biāo)記,成功構(gòu)建食品級重47謝謝謝謝48

通過合理開發(fā)和應(yīng)用酶制劑及相關(guān)酶工程技術(shù)可有效提高食品原料的深加工程度、改進(jìn)食品的加工工藝以及改善食品的風(fēng)味和品質(zhì)，從而達(dá)到提高產(chǎn)品得率和質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本。通過合理開發(fā)和應(yīng)用酶制劑及相關(guān)酶工程技術(shù)可有49

目前，葡萄糖氧化酶、溶菌酶等已應(yīng)用于罐裝果汁、果酒、水果罐頭、脫水蔬菜、肉類及蝦米類食品、低酒度、香腸、糕點、飲料、干酪、水產(chǎn)品、啤酒、清酒、鮮奶、奶粉、奶油、生面條等各種食品的防腐保鮮，并取得了較大進(jìn)展。目前，葡萄糖氧化酶、溶菌酶等已應(yīng)用于罐裝果汁、50載體pET-22b(+)帶有C末端His-Tag序列,利用pET-22b(+)表達(dá)的重組蛋白帶有6個His標(biāo)記,可利用Ni2+-ChelatingFaseFlow親和色譜柱進(jìn)行純化。計算得到目的蛋白分子量約為139kDa,說明該DTEase酶可能是四聚體。結(jié)果表明,DPEase酶可在B.bolteaeDPEase酶進(jìn)行表達(dá),成功構(gòu)建重組菌株B.與DTEase酶相比,DPEase酶對果糖的差向異構(gòu)活性更高,具有更高的應(yīng)用價值,所以近年來研究主要集中在DPEase酶上。目前，葡萄糖氧化酶、溶菌酶等已應(yīng)用于罐裝果汁、果酒、水果罐頭、脫水蔬菜、肉類及蝦米類食品、低酒度、香腸、糕點、飲料、干酪、水產(chǎn)品、啤酒、清酒、鮮奶、奶粉、奶油、生面條等各種食品的防腐保鮮，并取得了較大進(jìn)展。隨著酶工程技術(shù)的迅速發(fā)展，作為高效、安全的生物催化劑，酶已在食品添加劑的生產(chǎn)中得到較為廣泛的應(yīng)用。subtilis/lox-DPE的構(gòu)建及篩Tumefaciens和C.（1）、Ni2+-ChelatingSepharoseFastFlow親和層析雖然DTEase家族酶的氨基酸序列同源性不高(20%~62%),但DTEase家族酶都可以催化D-果糖和D-阿洛酮糖的相互轉(zhuǎn)化,其活性中心,金屬離子結(jié)合部位和底物結(jié)合位點的關(guān)鍵氨基酸殘基高度保守。并成功構(gòu)建雙突變體Y68I/G109P,該突變體酶對D-果糖的親和能力更高,具有更好的熱穩(wěn)定性。（6）、底物識別關(guān)鍵氨基酸Tyr68和Gly109的定點突變bolteaeDTEase酶基因的測序及序列分析在提高果蔬出汁率方面應(yīng)用最廣泛的酶是果膠酶，其次是纖維素酶。1、在淀粉食品的加工與生產(chǎn)方面的應(yīng)用淀粉類食品是含有大量淀粉或以淀粉為主要原料加工的食品。淀粉在淀粉酶的催化下可以產(chǎn)生葡萄糖、麥芽糖、麥芽糖漿、麥芽糖醇、糊精、麥芽糊精、低聚糖、果糖等?；蚩梢陨晒咸菨{、環(huán)狀糊精（通過葡萄糖異構(gòu)酶、環(huán)狀糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶等的作用）現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于糖果、冰淇淋、飲料、面包等的加工。載體pET-22b(+)帶有C末端His-Tag序列515、在焙烤食品制造中的應(yīng)用

在一些國家對用化學(xué)劑改良法將作出立法限制，這就意味著更需要用酶法工藝來生產(chǎn)受歡迎的產(chǎn)品。用作焙烤食品面粉來源的小麥和其他谷物含有一些天然存在的酶,這些酶對于谷物的發(fā)芽和生長是必需的。這些酶在焙烤工藝中亦十分重要,沒有它們,焙烤加工便不可能。這些酶包括：淀粉酶、蛋白酶、脂肪氧合酶、乳糖分解酶等。5、在焙烤食品制造中的應(yīng)用在一些國家對52三、在食品添加劑方面的應(yīng)用

食品添加劑是指用于改善食品品質(zhì)和風(fēng)味，以及為防腐和加工工藝的需要而加入食品中的少量化學(xué)合成或天然物質(zhì)，現(xiàn)已成為現(xiàn)代食品行業(yè)中不可缺少的部分。三、在食品添加劑方面的應(yīng)用

食品添加劑是53摘要糖尿病是一種世界性新興的疾病,嚴(yán)重威脅人類的健康。研究表明,單一糖類消耗成為糖尿病發(fā)病的主要因素之一。因此,利用低血糖應(yīng)答的甜味劑代替蔗糖成為預(yù)防糖尿病的有效方法。摘要糖尿病是一種世界性新興的疾病,嚴(yán)重威脅人類的健康。研究54將質(zhì)粒pMD-CLOBOL_00069與載體pET-22b(+)分別用NdeI和XhoI酶切后,回收酶切產(chǎn)物的目的條帶純化后進(jìn)行連接,其構(gòu)建過程如圖2-8所示。載體pET-22b(+)帶有C末端His-Tag序列,利用pET-22b(+)表達(dá)的重組蛋白帶有6個His標(biāo)記,可利用Ni2+-ChelatingFaseFlow親和色譜柱進(jìn)行純化。將質(zhì)粒pMD-CLOBOL_00069與載體pET-2557.利用B.subtilisWB800對C.bolteaeDPEase酶進(jìn)行表達(dá),成功構(gòu)建重組菌株B.subtilisWB800/pMA5-cbdpe-Y68I/G109P。該重組菌株無需誘導(dǎo)即可產(chǎn)生DPEase酶,18h時酶活可達(dá)到6.8U/mL。該酶最適pH為7.0,最適溫度為60℃,與E.coli表達(dá)的DPEase酶酶學(xué)性質(zhì)相似。結(jié)果表明,DPEase酶可在

B.subtilis中表達(dá)。7.利用B.subtilisWB800對C.b56

通過合理開發(fā)和應(yīng)用酶制劑及相關(guān)酶工程技術(shù)可有效提高食品原料的深加工程度、改進(jìn)食品的加工工藝以及改善食品的風(fēng)味和品質(zhì)，從而達(dá)到提高產(chǎn)品得率和質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本。通過合理開發(fā)和應(yīng)用酶制劑及相關(guān)酶工程技術(shù)可有57

目前，酶技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)的各個領(lǐng)域，如食品保鮮、制糖工業(yè)、釀造工業(yè)、、焙烤工業(yè)、乳制品工業(yè)、水果蔬菜加工、肉類及魚蝦類加工、蛋品加工、天然食品添加劑的生產(chǎn)以及改善食品的品質(zhì)和風(fēng)味等諸多方面。目前，酶技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)的各個領(lǐng)域，58一、在食品保鮮方面的應(yīng)用

食品在加工、運(yùn)輸和保鮮過程中，常易受到氧氣、微生物、溫度、濕度、光線等各種外界因素的影響，因使食品的色、香、味及營養(yǎng)會發(fā)生變化，甚至導(dǎo)致食品敗壞，降低食品的食用價值。因此，食品保鮮已是食品加工、運(yùn)輸、保藏中的重要問題，已引起食品行業(yè)的廣泛關(guān)注。一、在食品保鮮方面的應(yīng)用食品在加工、運(yùn)輸和保鮮59中性環(huán)境下,酶活損失較低,在pH6.1、在淀粉食品的加工與生產(chǎn)方面的應(yīng)用白酒和黃酒產(chǎn)業(yè)是我國的一大傳統(tǒng)民族工業(yè),多年來為我國的國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展作出了較大貢獻(xiàn)。在果蔬類食品的生產(chǎn)過程中，為了提高產(chǎn)量和產(chǎn)品質(zhì)量，常常使用各種酶。bolteaeDPEase酶的最適pH及pH穩(wěn)定性coliBL21/pET-22b(+)-CLOBOL_00069。6、在乳制品工業(yè)中的應(yīng)用3、在果蔬食品的加工與生產(chǎn)方面的應(yīng)用將質(zhì)粒pMD-CLOBOL_00069與載體pET-22b(+)分別用NdeI和XhoI酶切后,回收酶切產(chǎn)物的目的條帶純化后進(jìn)行連接,其構(gòu)建過程如圖2-8所示。利用mazF基因作為反向篩選標(biāo)記,成功構(gòu)建食品級重組菌株B.四、D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶bolteaeATCCBAA-613的DPEase的基因序列,利用pET-22b(+)表達(dá)載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主Escherichia.1、在淀粉食品的加工與生產(chǎn)方面的應(yīng)用其中包含的金屬離子結(jié)合位點表明金屬離子在催化時對于底物結(jié)合有重要的作用可穩(wěn)定差向異構(gòu)化過程中生成的烯二醇中間產(chǎn)物。bolteaeDPEase酶進(jìn)行表達(dá),成功構(gòu)建重組菌株B.

酶法保鮮技術(shù)就是利用酶的高效專一的催化作用，防止、降低或消除各種外界因素對食品產(chǎn)生的不良影響，進(jìn)而達(dá)到保持食品的優(yōu)良品質(zhì)和風(fēng)味特色，以及延長食品保藏期的技術(shù)。中性環(huán)境下,酶活損失較低,在pH6.酶法60

目前，葡萄糖氧化酶、溶菌酶等已應(yīng)用于罐裝果汁、果酒、水果罐頭、脫水蔬菜、肉類及蝦米類食品、低酒度、香腸、糕點、飲料、干酪、水產(chǎn)品、啤酒、清酒、鮮奶、奶粉、奶油、生面條等各種食品的防腐保鮮，并取得了較大進(jìn)展。目前，葡萄糖氧化酶、溶菌酶等已應(yīng)用于罐裝果汁、61二、在食品加工與生產(chǎn)方面的應(yīng)用

大多數(shù)用途是在原料的加工與食品的生產(chǎn)。應(yīng)用領(lǐng)域主要包括：淀粉類食品、蛋白質(zhì)類食品、果蔬類食品、乳制品、飲料、天然食品添加劑等。二、在食品加工與生產(chǎn)方面的應(yīng)用

大多數(shù)用途621、在淀粉食品的加工與生產(chǎn)方面的應(yīng)用2、在蛋白質(zhì)制品的加工與生產(chǎn)方面中的應(yīng)用3、在果蔬食品的加工與生產(chǎn)方面的應(yīng)用4、在釀酒工業(yè)中的應(yīng)用5、在焙烤食品制造中的應(yīng)用6、在乳制品工業(yè)中的應(yīng)用1、在淀粉食品的加工與生產(chǎn)方面的應(yīng)用631、在淀粉食品的加工與生產(chǎn)方面的應(yīng)用淀粉類食品是含有大量淀粉或以淀粉為主要原料加工的食品。淀粉在淀粉酶的催化下可以產(chǎn)生葡萄糖、麥芽糖、麥芽糖漿、麥芽糖醇、糊精、麥芽糊精、低聚糖、果糖等?；蚩梢陨晒咸菨{、環(huán)狀糊精（通過葡萄糖異構(gòu)酶、環(huán)狀糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶等的作用）現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于糖果、冰淇淋、飲料、面包等的加工。1、在淀粉食品的加工與生產(chǎn)方面的應(yīng)用淀粉類食品是含有大量淀粉642、在蛋白質(zhì)制品的加工與生產(chǎn)方面中的應(yīng)用蛋白質(zhì)食品是一種以蛋白質(zhì)為主要原料加工而成的食品。以天然的大分子蛋白存在的蛋白質(zhì)往往不具有生物活性或加工性能較差，而經(jīng)過某些蛋白酶的水解后往往能夠提高其生物活性或加工性能。目前較常用的是蛋白酶和乳糖酶。2、在蛋白質(zhì)制品的加工與生產(chǎn)方面中的應(yīng)用蛋白質(zhì)食品是一種以蛋653、在果蔬食品的加工與生產(chǎn)方面的應(yīng)用

在果蔬類食品的生產(chǎn)過程中，為了提高產(chǎn)量和產(chǎn)品質(zhì)量，常常使用各種酶。水果蔬菜加工用酶中最常用的有果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶等。將酶制劑應(yīng)用于果蔬加工，主要有以下幾方面的作用。3、在果蔬食品的加工與生產(chǎn)方面的應(yīng)用

在果蔬類食品的生產(chǎn)過程66果蔬本身所含有的果膠、纖維素、淀粉和蛋白質(zhì)等是引起果蔬汁渾濁、褐變等不良因素的主要原因，以傳統(tǒng)的壓榨和過濾等生產(chǎn)工藝難以使果蔬汁達(dá)到較高品質(zhì)，并且營養(yǎng)成分大量損失。而酶技術(shù)的應(yīng)用，不僅克服了傳統(tǒng)加工工藝的缺點，且大幅度增加了果蔬汁的品質(zhì)。在提高果蔬出汁率方面應(yīng)用最廣泛的酶是果膠酶，其次是纖維素酶。此外在增香、除異味、提取果膠、真空或加壓滲酶法處理完整果蔬和提取蔬菜汁中酶的應(yīng)用也非常廣泛。果蔬本身所含有的果膠、纖維素、淀粉和蛋白質(zhì)等是引起果蔬汁渾濁674、在釀酒工業(yè)中的應(yīng)用

1、啤酒工業(yè)中的應(yīng)用

啤酒以其特有的“麥芽的香味、細(xì)膩的泡沫、酒花的苦澀、透明的酒質(zhì)”為人們所喜愛。由于啤酒含有豐富的氨基酸和維生素,因此被稱為“液體面包”。制麥芽大麥含有全麥啤酒釀造用到的所有的酶,現(xiàn)在企業(yè)用到大量的谷物作為替代品,所以需要外源酶。而利用現(xiàn)代酶工程技術(shù)與傳統(tǒng)啤酒釀造技術(shù)相結(jié)合,將提高啤酒質(zhì)量,降低生產(chǎn)成本,增加企業(yè)效益。酶在啤酒生產(chǎn)中的作用主要有輔料液化、提高發(fā)酵度降低雙乙酰、改善麥汁過濾、增加α-氨基酸、提高啤酒穩(wěn)定性、改善膜過濾速度、消除雜菌污染、啤酒除氧等。4、在釀酒工業(yè)中的應(yīng)用

1、啤酒工業(yè)中的應(yīng)用682、白酒和黃酒工業(yè)中的應(yīng)用

白酒和黃酒產(chǎn)業(yè)是我國的一大傳統(tǒng)民族工業(yè),多年來為我國的國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展作出了較大貢獻(xiàn)?，F(xiàn)代的白酒和黃酒的生產(chǎn),既要保持原酒的風(fēng)味特色,又要提高出酒率、簡化操作,這就要求傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝和現(xiàn)代技術(shù)相結(jié)合。目前,酶在這兩種酒的生產(chǎn)應(yīng)用中已經(jīng)很廣泛。2、白酒和黃酒工業(yè)中的應(yīng)用69釀酒工業(yè)中廣泛應(yīng)用的酶主要是糖化酶、液化酶、纖維素酶、蛋白酶、酯化酶等,具有酶活力強(qiáng)、用量少、使用方便等優(yōu)點,適量添加可提高出酒率和品質(zhì)。糖化酶、液化酶是白酒黃酒釀造中主要用酶,目前流行的生料釀酒和液化法黃酒釀造也主要是利用這兩種酶直接將淀粉液化糊化糖化來代替蒸煮作用的原理,而通過酶的固定化技術(shù)將它們固定在載體上,效果更好,也是當(dāng)前研究的熱點。釀酒工業(yè)中廣泛應(yīng)用的酶主要是糖化酶、液化酶、纖維素酶、蛋白酶705、在焙烤食品制造中的應(yīng)用

在一些國家對用化學(xué)劑改良法將作出立法限制，這就意味著更需要用酶法工藝來生產(chǎn)受歡迎的產(chǎn)品。用作焙烤食品面粉來源的小麥和其他谷物含有一些天然存在的酶,這些酶對于谷物的發(fā)芽和生長是必需的。這些酶在焙烤工藝中亦十分重要,沒有它們,焙烤加工便不可能。這些酶包括：淀粉酶、蛋白酶、脂肪氧合酶、乳糖分解酶等。5、在焙烤食品制造中的應(yīng)用在一些國家對716、在乳制品工業(yè)中的應(yīng)用

近年,

酶在乳品中的應(yīng)用已擴(kuò)展到更廣的領(lǐng)域。總的來說,當(dāng)前在乳制品生產(chǎn)中最常用、最重要的幾種酶為蛋白酶主要為凝乳酶、乳糖酶、乳過氧化物酶和脂肪酶等。酶在乳制品中最主要的應(yīng)用是蛋白酶的應(yīng)用,

特別是用凝乳酶加工干酪,

以及用乳糖酶將乳糖分解,

以提高有乳糖不耐癥的人對乳制品的消化力。乳過氧化物酶保鮮鮮奶和乳制品也已在國內(nèi)、國際得到了較廣泛的應(yīng)用。6、在乳制品工業(yè)中的應(yīng)用

近年,

酶在乳72三、在食品添加劑方面的應(yīng)用

食品添加劑是指用于改善食品品質(zhì)和風(fēng)味，以及為防腐和加工工藝的需要而加入食品中的少量化學(xué)合成或天然物質(zhì)，現(xiàn)已成為現(xiàn)代食品行業(yè)中不可缺少的部分。三、在食品添加劑方面的應(yīng)用

食品添加劑是73

按照食品添加劑的功能不同，可以分為酸味劑、抗結(jié)劑、抗氧化劑、漂白劑、膨松劑、著色劑、護(hù)色劑、酶制劑、增味劑、營養(yǎng)強(qiáng)化劑、防腐劑、甜味劑、增稠劑、香味劑等二十余類。按照食品添加劑的功能不同，可以分為酸味劑74酶法保鮮技術(shù)就是利用酶的高效專一的催化作用，防止、降低或消除各種外界因素對食品產(chǎn)生的不良影響，進(jìn)而達(dá)到保持食品的優(yōu)良品質(zhì)和風(fēng)味特色，以及延長食品保藏期的技術(shù)。淀粉在淀粉酶的催化下可以產(chǎn)生葡萄糖、麥芽糖、麥芽糖漿、麥芽糖醇、糊精、麥芽糊精、低聚糖、果糖等。三、在食品添加劑方面的應(yīng)用這些酶包括：淀粉酶、蛋白酶、脂肪氧合酶、乳糖分解酶等。bolteaeD-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的分離、純化及酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明,DPEase酶可在B.bolteaeDPEase酶的平衡率在啟動子P43的作用下,C.coliBL21/pET-22b(+)-CLOBOL_00069。coliBL21(DE3),成功構(gòu)建重組菌株E.研究表明,單一糖類消耗成為糖尿病發(fā)病的主要因素之一。bolteaeDTEase酶基因的測序及序列分析在提高果蔬出汁率方面應(yīng)用最廣泛的酶是果膠酶，其次是纖維素酶。淀粉類食品是含有大量淀粉或以淀粉為主要原料加工的食品。bolteaeDPEase酶的酶學(xué)性質(zhì)

隨著酶工程技術(shù)的迅速發(fā)展，作為高效、安全的生物催化劑，酶已在食品添加劑的生產(chǎn)中得到較為廣泛的應(yīng)用。酶法保鮮技術(shù)就是利用酶的高效專一的催化作用，防止、降低或消除75四、D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶

D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶家族酶可催化醛酮糖C-3位的差向異構(gòu),從而實現(xiàn)D-果糖向D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化。D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶家族酶因其底物專一性的不同,被分為D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶(DTEase酶)和D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶(DPEase酶)兩類。四、D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶家族761、DTEase家族酶的微生物來源自1993年,日本學(xué)者第一次于PseudomonascichoriiST-24中發(fā)現(xiàn)一種可以催化己酮糖C-3位差向異構(gòu)化的酶,命名為D-己酮糖3-差向異構(gòu)酶。因其最適底物為D-塔格糖,后重新命名為DTEase酶。隨后,又發(fā)現(xiàn)另一種潛在的DTEase酶,該酶的最適底物為D-阿洛酮糖,可高效催化D-果糖與D-阿洛酮糖之間的轉(zhuǎn)化,因此被命名為DPEase酶。與DTEase酶相比,DPEase酶對果糖的差向異構(gòu)活性更高,具有更高的應(yīng)用價值,所以近年來研究主要集中在DPEase酶上。1、DTEase家族酶的微生物來源自1993年,日本學(xué)者第772、DTEase家族酶的酶學(xué)性質(zhì)微生物來源不同的DTEase家族酶具有不同的酶學(xué)性質(zhì)。雖然DTEase家族酶的氨基酸序列同源性不高(20%~62%),但DTEase家族酶都可以催化D-果糖和D-阿洛酮糖的相互轉(zhuǎn)化,其活性中心,金屬離子結(jié)合部位和底物結(jié)合位點的關(guān)鍵氨基酸殘基高度保守。2、DTEase家族酶的酶學(xué)性質(zhì)微生物來源不同的DTEa78

3、DTEase家族酶的蛋白質(zhì)工程來源于A.tumefaciens和C.cellulolyticum的DPEase酶及來源于P.cichorii的DTEase酶的晶體結(jié)構(gòu)被揭示。DTEase家族酶具有一個典型的TIM桶狀結(jié)構(gòu),由8個重復(fù)的β-折疊和α-螺旋單元構(gòu)成(β/α)8結(jié)構(gòu)。其中包含的金屬離子結(jié)合位點表明金屬離子在催化時對于底物結(jié)合有重要的作用可穩(wěn)定差向異構(gòu)化過程中生成的烯二醇中間產(chǎn)物。3、DTEase家族酶的蛋白質(zhì)工程來源于A.tumef79ClostridiumbolteaeD-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的蛋白質(zhì)工程與食品級表達(dá)江南大學(xué)食品生物技術(shù)2014.6五、

ClostridiumbolteaeD-阿洛酮糖3-差向80摘要糖尿病是一種世界性新興的疾病,嚴(yán)重威脅人類的健康。研究表明,單一糖類消耗成為糖尿病發(fā)病的主要因素之一。因此,利用低血糖應(yīng)答的甜味劑代替蔗糖成為預(yù)防糖尿病的有效方法。摘要糖尿病是一種世界性新興的疾病,嚴(yán)重威脅人類的健康。研究81D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3位差向異構(gòu)體,是一種己酮糖甜味劑,屬于稀有糖。D-阿洛酮糖的甜度為蔗糖的70%,但其能量僅為蔗糖的0.3%,是食品中理想的代糖品。D-阿洛酮糖具有降低血糖、降低血脂、清除活性氧自由基和神經(jīng)保護(hù)等重要的生理功能。在食品加工過程中,可改善凝膠特性并可產(chǎn)生良好的風(fēng)味。D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3位差向異構(gòu)體,是一種己酮糖甜味82D-阿洛酮糖在天然產(chǎn)品中存在較少,但生物催化新技術(shù)的開發(fā)使D-阿洛酮糖的大規(guī)模生產(chǎn)成為可能。D-阿洛酮糖在天然產(chǎn)品中存在較少,但生物催化新技術(shù)的開發(fā)使D83本研究前期利用鮑氏梭菌(Clostridiumbolteae)ATCCBAA-613進(jìn)行全細(xì)胞反應(yīng),確定該菌株具有催化D-果糖差向異構(gòu)生成D-阿洛酮糖的能力,無副產(chǎn)物產(chǎn)生。在此基礎(chǔ)上,對該鮑氏梭菌(C.bolteae)ATCCBAA-613全基因組中預(yù)測的DPEase酶基因進(jìn)行克隆、表達(dá);對DPEase酶進(jìn)行分離純化、酶學(xué)性質(zhì)、構(gòu)效關(guān)系及分子改造等方面進(jìn)行研究;實現(xiàn)DPEase酶在食品級宿主枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis中表達(dá),并分別基于Cre/lox系統(tǒng)和反向篩選標(biāo)記mazF基因,成功構(gòu)建食品級表達(dá)系統(tǒng)。本研究前期利用鮑氏梭菌(Clostridiumboltea841、C.bolteaeD-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá)（1）、

C.bolteaeDTEase酶基因的擴(kuò)增（2）、PCR產(chǎn)物的克?。?）、C.bolteaeDTEase酶基因的測序及序列分析（4）、D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建（5）、誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化（6）、重組E.coli細(xì)胞催化D-果糖差向異構(gòu)化反應(yīng)（7）、D-阿洛酮糖的鑒定1、C.bolteaeD-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因85酶在食品中的應(yīng)用講課課件86證明基因CLOBOL_00069所翻譯的假定蛋白,其關(guān)鍵序列與DTEase家族酶有很高的同源性,具有相同的保守序列,因此,EDP19602可能是一種DTEase家族酶。證明基因CLOBOL_00069所翻譯的假定蛋白,其關(guān)鍵序87將質(zhì)粒pMD-CLOBOL_00069與載體pET-22b(+)分別用NdeI和XhoI酶切后,回收酶切產(chǎn)物的目的條帶純化后進(jìn)行連接,其構(gòu)建過程如圖2-8所示。載體pET-22b(+)帶有C末端His-Tag序列,利用pET-22b(+)表達(dá)的重組蛋白帶有6個His標(biāo)記,可利用Ni2+-ChelatingFaseFlow親和色譜柱進(jìn)行純化。將質(zhì)粒pMD-CLOBOL_00069與載體pET-288酶在食品中的應(yīng)用講課課件892、C.bolteaeD-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的分離、純化及酶學(xué)性質(zhì)研究（1）、Ni2+-ChelatingSepharoseFastFlow親和層析（2）、Superdex200(10/300GL)凝膠層析純化結(jié)果（3）、Superdex200凝膠色譜確定C.bolteaeDPEase酶的分子量（4）、金屬離子對C.bolteaeDPEase酶酶活的影響（5）、C.bolteaeDPEase酶的最適pH及pH穩(wěn)定性（6）、C.bolteaeDPEase酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性（7）、C.bolteaeDPEase酶的底物特異性及酶反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)研究（8）、C.bolteaeDPEase酶的平衡率2、C.bolteaeD-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的分離90C.bolteaeDTEase酶亞基分子量約為34kDa,比預(yù)測的分子量33kDa大約1kDa,可能是由于在其C端增加6個組氨酸標(biāo)簽。經(jīng)過Ni2+-ChelatingSepharoseFastFlow親和層析柱純化后,即可獲得較純的目的蛋白。計算得到目的蛋白分子量約為139kDa,說明該DTEase酶可能是四聚體。此結(jié)果與來源于A.Tumefaciens和C.cellulolyticum等DTEase家族酶中的DPEase酶一致。C.bolteaeDTEase酶亞基分子量約為34kD91該酶的最適反應(yīng)pH為7.0。中性環(huán)境下,酶活損失較低,在pH6.0~7.5的緩沖液中保持2h后,殘余酶活可在90%以上;而在偏酸或偏堿性環(huán)境下,其酶活損失較大。酶的在55℃的酶活最高當(dāng)溫度<55℃時,酶活力隨溫度的升高而升高,當(dāng)溫度>60℃后,酶活力隨溫度升高而顯著下降該酶的最適反應(yīng)pH為7.0。中性環(huán)境下,酶活損失較低,923、C.bolteaeD-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因的催化機(jī)理初探及分子改造（1）、

C.bolteaeDPEase的結(jié)構(gòu)分析及活性位點預(yù)測（2）、

改造位點的確定（3）、

Ala掃描定點突變（4）、催化活性中心關(guān)鍵氨基酸Glu152和Glu246的定點突變（5）、底物結(jié)合關(guān)鍵氨基酸Glu158,His188和Arg217的定點突變（6）、底物識別關(guān)鍵氨基酸Tyr68和Gly109的定點突變（7）、Y68和G109位突變體酶的酶學(xué)性質(zhì)（8）、雙突變體酶Y68I/G109P的酶學(xué)性質(zhì)研究3、C.bolteaeD-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因的934、C.bolteaeD-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)（1）、

C.bolteaeDPEase酶基因克?。?）、

B.subtilis重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定（3）、B.subtilis重組菌的表達(dá)及活性鑒定（4）、重組C.bolteaeDPEase酶的分離純化（5）、重組

C.bolteaeDPEase酶的酶學(xué)性質(zhì)4、C.bolteaeD-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因在945、基于Cre/lox系統(tǒng)的C.bolteaeD-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因的食品級表達(dá)（1）、重疊PCR（2）、pP43DPE載體的克?。?）、表達(dá)載體pDGI-7S6的構(gòu)建（4）、表達(dá)載體pDGI-7S6-DPE的構(gòu)建（5）、重組菌B.Subtilis/7S6-DPE的構(gòu)建及篩選（6）、重組菌B.subtilis/lox-DPE,pTSC的構(gòu)建及篩選（7）、重組菌B.subtilis/lox-DPE的構(gòu)建及篩（8）、重組菌B.subtilis/lox-DPE的發(fā)酵曲線5、基于Cre/lox系統(tǒng)的C.bolteaeD-阿洛酮954mmol/L時,C.或可以生成果葡糖漿、環(huán)狀糊精（通過葡萄糖異構(gòu)酶、環(huán)狀糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶等的作用）現(xiàn)代的白酒和黃酒的生產(chǎn),既要保持原酒的風(fēng)味特色,又要提高出酒率、簡化操作,這就要求傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝和現(xiàn)代技術(shù)相結(jié)合。subtilisWB800/pMA5-cbdpe-Y68I/G109P。這些酶包括：淀粉酶、蛋白酶、脂肪氧合酶、乳糖分解酶等。淀粉在淀粉酶的催化下可以產(chǎn)生葡萄糖、麥芽糖、麥芽糖漿、麥芽糖醇、糊精、麥芽糊精、低聚糖、果糖等。D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶家族酶可催化醛酮糖C-3位的差向異構(gòu),從而實現(xiàn)D-果糖向D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化。coli細(xì)胞催化D-果糖差向異構(gòu)化反應(yīng)通過合理開發(fā)和應(yīng)用酶制劑及相關(guān)酶工程技術(shù)可有效提高食品原料的深加工程度、改進(jìn)食品的加工工藝以及改善食品的風(fēng)味和品質(zhì)，從而達(dá)到提高產(chǎn)品得率和質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本。水果蔬菜加工用酶中最常用的有果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶等。利用Cre/lox系統(tǒng)成功構(gòu)建食品級重組菌株B.目前，葡萄糖氧化酶、溶菌酶等已應(yīng)用于罐裝果汁、果酒、水果罐頭、脫水蔬菜、肉類及蝦米類食品、低酒度、香腸、糕點、飲料、干酪、水產(chǎn)品、啤酒、清酒、鮮奶、奶粉、奶油、生面條等各種食品的防腐保鮮，并取得了較大進(jìn)展。（6）、底物識別關(guān)鍵氨基酸Tyr68和Gly109的定點突變（2）、PCR產(chǎn)物的克隆subtilisWB800/pMA5-cbdpe-Y68I/G109P。6、基于mazF反向篩選標(biāo)記的C.bolteaeD-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因的食品級表達(dá)（1）、表達(dá)載體pDGI-DPE的構(gòu)建（2）、重組菌

B.subtilis/REF的構(gòu)建及篩選（3）、重組菌B.subtilis/DPE的構(gòu)建及篩選（4）、重組菌B.subtilis/DPE的發(fā)酵曲線4mmol/L時,C.6、基于mazF反向篩選標(biāo)記的C.967、結(jié)論1、利用PCR的方法擴(kuò)增獲得C.bolteaeATCCBAA-613的DPEase的基因序列,利用pET-22b(+)表達(dá)載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主Escherichia.coliBL21(DE3),成功構(gòu)建重組菌株E.coliBL21/pET-22b(+)-CLOBOL_00069。2.對重組菌株E.coliBL21/pET-22b(+)-CLOBOL_00069的誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行研究。結(jié)果表明在對數(shù)生長中期OD值為1.0左右后,加入終濃度為5g/L的乳糖,20℃

條件下誘導(dǎo)7h,可達(dá)到最大酶活,為6.1U/mL發(fā)酵液。利用重組菌株E.coliBL21/pET-22b(+)-CLOBOL_00069全細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。經(jīng)鑒定,產(chǎn)物為D-阿洛酮糖,說明C.bolteaeATCCBAA-613的DPEase基因在E.coliBL21中表達(dá)正確并具有轉(zhuǎn)化D-果糖為D-阿洛酮糖的能力。7、結(jié)論1、利用PCR的方法擴(kuò)增獲得C.bolteaeA973.利用Ni2+-ChelatingSepharoseFastFlow親和層析柱和Superdex20010/300GL凝膠柱對C.bolteaeDPEase酶進(jìn)行分離純化,其亞基分子量約為34kDa,酶蛋白分子量為139kDa,證實來源于C.bolteae的DPEase酶為四聚體酶。C.bolteaeDPEase酶是金屬蛋白酶,Mn2+和Co2+可顯著增強(qiáng)酶活。當(dāng)Co2+濃度為0.4mmol/L時,C.bolteaeDPEase酶獲得最大酶活。4.C.bolteaeDPEase酶的最適反應(yīng)pH為7.0,在pH6.5~7.5之間其相對酶活較高,表現(xiàn)出良好的活性。最適反應(yīng)溫度為55℃,在45℃以下,該酶較穩(wěn)定,當(dāng)溫度大于50℃時,酶的熱穩(wěn)定性較差。在Co2+存在的情況下,酶的熱穩(wěn)定性顯著提高。55℃

時,Co2+的添加可使酶的半衰期延長至原來的3.6倍。3.利用Ni2+-ChelatingSepharose985.研究C.bolteaeDPEase酶的底物特異性,發(fā)現(xiàn)該酶對D-阿洛酮糖的底物特異性最高,D-果糖次之,其次為D-塔格糖,而對磷酸化的糖基本沒有作用。并測定該酶的動力學(xué)常數(shù),當(dāng)以D-阿洛酮糖作為底物時,其Km、kcat和kcat/Km分別為27.4mM、2935min-1和107.1min-1mM-1。該酶對D-阿洛酮糖的Km值遠(yuǎn)小于其他底物,催化效率kcat/Km較其他底物更大,其說明其對D-阿洛酮糖的親和性更高,其最適底物是D-阿洛酮糖。因此該酶被鑒定為D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶。5.研究C.bolteaeDPEase酶的底物特異性996.利用已有的晶體結(jié)構(gòu)信息,利用SWISS-MODEL對C.bolteaeDPEase酶單體的結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬,利用Discoverystudio軟件對C.bolteaeDPEase酶和D-果糖進(jìn)行對接,獲得位于活性中心的關(guān)鍵氨基酸位點為Glu158,His188,Arg217,Glu152,Glu246,Y68和G109。突變結(jié)果表明,Glu152和Glu246為催化活性中心關(guān)鍵氨基酸,Glu158,His188和Arg217與底物結(jié)合有關(guān),68和109位的氨基酸與底物識別有關(guān),影響活性口袋的形成。并成功構(gòu)建雙突變體Y68I/G109P,該突變體酶對D-果糖的親和能力更高,具有更好的熱穩(wěn)定性。6.利用已有的晶體結(jié)構(gòu)信息,利用SWISS-MODEL1007.利用B.subtilisWB800對C.bolteaeDPEase酶進(jìn)行表達(dá),成功構(gòu)建重組菌株B.subtilisWB800/pMA5-cbdpe-Y68I/G109P。該重組菌株無需誘導(dǎo)即可產(chǎn)生DPEase酶,18h時酶活可達(dá)到6.8U/mL。該酶最適pH為7.0,最適溫度為60℃,與E.coli表達(dá)的DPEase酶酶學(xué)性質(zhì)相似。結(jié)果表明,DPEase酶可在