HPV21分型產品操作培訓課件

凱普技術支持中心2013.04凱普HPV產品操作培訓凱普技術支持中心凱普HPV產品操作培訓技術原理：基因擴增導流雜交低密度基因芯片分型：15種高危型別：HPV16,18,31,33,35,39,45,51,52,53,56,58,59,66,68.6種低危型別：HPV6,11,42,43,44,CP8304（81）.21分型技術原理：21分型宮頸脫落細胞用棉試子擦去宮頸口的分泌物，取宮頸環(huán)狀上皮與柱狀上皮轉化處宮頸脫落細胞男性尿道標本

用細小棉拭子伸入尿道約2-4厘米，捻動拭子采集上皮細胞，將棉拭子置入無菌玻璃管，密閉送檢（采集標本前2小時禁小便）。男女性疣體標本

既可以直接切下疣體組織放進無菌玻璃管內，又可以用一次性注射器把疣體刺破后再用棉拭子反復擦拭病灶處脫落細胞置入無菌玻璃管，密閉送檢。適用樣本及采集方法①細胞學檢測采集的樣本中，凱普可以使用TCT檢測所剩余的保存液來檢測，但需要根據所剩細胞的濃度適當增加取樣量至1~2ml。②如果必須使用同類產品保存液保存的樣本，亞能與港龍的保存系統(tǒng)我司可以提取使用，HC-II的保存系統(tǒng)要確保未進行處理過才可使用。宮頸脫落細胞適用樣本及采集方法①細胞學檢測采集的樣本中，樣本采集前注意事項A不可在碘試驗和醋酸試驗之后采集樣本。

（可能會抑制PCR反應）

B檢查前48小時內不要作陰道沖洗，不要用避孕藥膏等

等陰道內用藥物。

（（可能會抑制PCR反應）

C檢查前48小時不應有性生活。D月經期不可采集標本。（防止血液過多）E注意避免交叉污染。樣本采集前注意事項A不可在碘試驗和醋酸試驗之后采集樣本先采集HPV檢測樣本，再采集TCT或LCT、病理組織樣本樣本采集后，如若不能馬上檢測，應將樣本置于冰箱4℃存放，并在一周時間內檢測。應避免反復凍融。一周后檢測的標本應保存在-20℃。樣本采集前注意事項先采集HPV檢測樣本，再采集TCT或LCT、病理組織樣本樣本取800μl臨床樣本，加入離心管中14000rpm離心3分鐘，去上清加入400μl溶液Ⅰ，混勻100℃裂解15分鐘加入400μl溶液Ⅱ，混勻，放置5分鐘14000rpm離心5分鐘，去上清14000rpm離心1分鐘，再次去上清加入60μl溶液Ⅲ充分溶解，-20℃保存對于無明顯肉眼可見組織刷取物時，可適當加大實驗樣本量，或多次收集樣本。取樣前振蕩混勻。溶液Ⅰ用于裂解細胞，釋放DNA。金屬浴應防止爆蓋發(fā)生，可壓重物，15分鐘后，待金屬浴溫度降至80℃以下再取出離心管；水浴應用螺旋蓋離心管，旋緊，同時應防止進水。裂解后應點動離心再加入溶液Ⅱ溶液Ⅱ用于溶解脂類、蛋白質等雜質，沉淀DNA。溶液Ⅱ放入冰箱預冷可提高DNA的沉降效率該步意在充分去除溶液Ⅱ，因溶液Ⅱ為有機溶劑，會影響Taq酶的活性，抑制PCR擴增，導致IC點淺或者不出的情況。溶液Ⅲ用于溶解DNA。點樣上機前，應進行離心，14000rpm，1分鐘。以沉淀細胞碎片等物質，防止擴增受到抑制。取800μl臨床樣本，加入離心管中14000rpm離心3分鐘超凈工作臺離心機標本制備區(qū)旋渦混合器微量移液器金屬加熱器離心機樣本制備所需儀器超凈工作臺離心機標本制備區(qū)旋渦混合器微量移液器金屬加熱器離心提取操作注意事項提取操作注意事項提取操作注意事項臨床樣本中有效細胞量太少：取500ul臨床樣本離心后，管底基本上看不到或者看到很少沉淀的時候，把第一次離心后的上清小心去掉，再加入500ul臨床樣本進行第二次離心，收集兩次沉淀細胞。臨床樣本中血液太多：有些臨床樣本中由于種種原因，含有太多的血液。處理方法為取500ul臨床樣本離心后，去除上清，然后加入蒸餾水洗滌兩次，或樣本離心后用槍吸去沉淀的血細胞臨床樣本中黏液太多：1，建議醫(yī)生按正確的方法取樣。2，再加入500ul的臨床樣本，震蕩混勻后，用1ml槍頭洗出部分溶液，離心后按照正常的操作程序進行。如果離心后沉淀比較少，可以重復一次。3，將刷子連帶粘在其上的粘液取出提取操作注意事項臨床樣本中有效細胞量太少：取500ul臨床男性樣本或女性疣體樣本提取方法（棉拭子樣本）提取操作注意事項

采集管內加500ul生理鹽水，充分振蕩

↓

溶液倒入提取管中，14000rpm離5min

↓

收集細胞

↓

下同宮頸分泌物標本操作采集管內加500ul溶液Ⅰ，充分振蕩

↓

轉移出400ul溶液至提取管中

100℃加熱15分鐘

↓

下同宮頸分泌物標本操作方法一方法二因方法二會因細胞太少而出現假陰性的情況，故建議用方法一操作男性樣本或女性疣體樣本提取方法（棉拭子樣本）提取操作注意事項石蠟包埋組織樣本提取方法提取操作注意事項WAYONE（1）稱取0.01-0.05克石蠟標本，放入到1.5ml的微量離心管中。

（2）加入1ml的二甲苯，室溫下孵育10分鐘除蠟，倒掉二甲苯。

（3）加入1ml100%無水乙醇，孵育10分鐘，倒掉無水乙醇。

（4）加入1ml95%1乙醇，孵育10分鐘，倒掉。

（5）加入1ml75%乙醇，孵育10分鐘，倒掉。

（6）室溫下讓乙醇揮發(fā)完全。

（7）組織重新懸浮在400μl溶液Ⅰ和1μl50mg/ml蛋白酶K，震蕩混勻。

（8）樣品56°C孵育3小時。

(9)

沸水中煮沸15分鐘。

(10)

冷卻,然后加入400μl溶液Ⅱ,充分混勻，室溫下放置2分鐘。

(11)

14000rpm離心5分鐘。

(12)

去干凈上清

(13)加入60μl溶液Ⅲ,充分溶解。取1μl作為PCR模板進行擴增或儲存在-20℃。新鮮組織樣本提取方法（1）稱取0.01-0.05克新鮮組織，研磨后加入細胞保存液形成懸液。若無法研磨可將組織剪碎并適當延長裂解時間。若有蛋白酶K，則在56℃下裂解直至消化完全，若無蛋白酶K則在100℃下裂解直至消化完全。（2）以下與常規(guī)提取相同。石蠟包埋組織樣本提取方法提取操作注意事項WAYON

匹基、達安等都是使用直接煮沸法提取的DNA，這樣的DNA純度較差，對于凱普HPV檢測中的PCR擴增過程會產生抑制，所以不能使用。

使用過柱法試劑盒，比如QIAGENE提取的DNA，可以保證其DNA的純度及濃度，可以使用。

提取DNA質量要求提取DNA質量要求PCR試劑的制備PCR試劑的制備1PCR試劑存放在-20℃中避光保存，避免反復凍融試劑。2

配制時嚴格按說明書上的比例和量進行混合分裝。3試劑準備區(qū)中進行，充分解凍試劑并且點動離心后，方可吸取混勻4酶與PCRmix要充分混勻。5分裝和加樣時，不可使用有粉橡膠手套，一般僅能佩戴薄膜手套。6PCR小管及其他實驗耗材不可長時間置于紫外燈下照射，否則會抑制PCR擴增。7

有條件的客戶，要對離心管、移液器吸嘴進行高壓滅菌，包裝完整的PCR小管可直接使用。8

注意對移液器的保養(yǎng)，移液器使用后應及時調回最大量程，并定期進行校準，防止量程偏大或者偏小。9

加樣時，盡量做到加完一個樣，立即關蓋，再加下一個樣。加樣完畢后，點動離心，清除氣泡。PCR試劑的制備1PCR試劑存放在-20℃中避光保存，避免反復凍融試劑。P擴增區(qū)PCR儀的質量要求最好選用進口PCR儀PCR儀的擴增速率不能太高，擴增儀的擴增速率最好保證1℃/s沒有熱蓋的PCR儀要注意加樣后再加一滴礦物油儀器運行的房間一定要打開空調擴增區(qū)PCR儀的質量要求①蠕動泵損壞

啟動蠕動泵后聽不到蠕動泵運轉的聲音，請送修。

②排液管粘連這種情況一般出現在新儀器第一次使用或儀器閑置太久后第一次使用。當啟動蠕動泵后聽到儀器內部有類似“啪啪”的聲音，可判斷是排液管粘連。解決方法是：在反應室內注入水，然后啟動蠕動泵直到排水即可。

③排液管堵塞

主要是實驗后清洗不徹底，或使用時間較久后，實驗液體中的化學物質殘留于排液管內形成結晶物，堵塞了排液管導致不能排液，其現象特征是啟動蠕動泵后，有蠕動泵正常運轉的聲音，但沒有液體排出。

解決方法：在反應室內加蒸餾水,升溫至65℃并保持幾分鐘,使結晶物溶化,然后排液。反復幾次使排水管暢通。如若仍不能排液則需要拆出排液管來清洗或更換排液管。

雜交前配件安裝問題解決方法①蠕動泵損壞雜交前配件安裝問題解決方法

④密封不良

A配件組裝不良

多孔板及分隔膜、硅膠圈沒有放好，形成空隙，造成整個系統(tǒng)不密封,建議重新放置。

B多孔板問題多孔板因跌落或其他原因造成變形，也會造成密封不良。另外由于多孔板加工精度的限制，多孔板的厚度并不完全均勻，在放入反應室時，放置的面或方向不同都會造成排液速度的變化，有時甚至會引起排液慢的現象，如果是這種情況可把多孔板翻轉一下。

C硅膠圈問題硅膠圈的老化，彈性不足，也是造成密封不良的原因之一，同時也會引起互滲。硅膠圈平時使用后應存放在陰涼干凈的地方，防止紫外線照射，定期更換硅膠圈。

雜交前配件安裝問題解決方法雜交前配件安裝問題解決方法外殼用軟布沾清水或稀釋的中性清洗劑擰干后擦拭，勿用酒精或其它有機溶劑清潔顯示屏部分。反應室、分隔室、多孔板、硅膠圈用軟刷子刷洗3次，再用紙吸干表面的水珠，自然晾干。分隔膜、硅膠圈沖洗即可，不要揉搓，用紙吸干表面的水珠，自然晾干。不可照紫外，不可浸泡次氯酸鈉溶液。外置電源表面的灰塵用干布擦拭干凈即可，注意檢查接線柱是否擰緊。雜交儀的維護外殼用軟布沾清水或稀釋的中性清洗劑擰干后擦拭，勿用酒精或其它水浴鍋HybirMax?醫(yī)用核酸分子快速雜交儀擴增產物分析區(qū)（雜交區(qū)）微量移液器雜交間所需儀器水浴鍋HybirMax?醫(yī)用核酸擴增產物分析區(qū)（雜交區(qū)）微量雜交操作注意事項雜交操作注意事項雜交操作注意事項酶標液與封阻液的瓶子規(guī)格及顏色一致（標簽顏色不同），加液前應確認后再加液。溶液I與溶液II亦如此。第一個孔與最后一個孔之間存在著加液時間差，第一個孔比最后一個孔的雜交時間要長2～3min。所以在加酶標液及顯色液時，順序應由最后一個孔往第一個孔加。減少膜整體之間的背景及點深淺差異。加熱變性后應保持儀器仍在運行狀態(tài)下迅速轉移出PCR產物放入冰水浴中雜交操作注意事項酶標液與封阻液的瓶子規(guī)格及顏色一致（標簽顏色①互滲

互滲的測定方法參見技術巡訪指引，若在雜交實驗前發(fā)現有互滲現象需立即停止后續(xù)實驗，重新安裝分隔硅膠圈、分隔室及壓扣蓋，再進行互滲現象試驗，如果仍然有此現象出現，則即使聯系廠家更換硅膠圈。

②反滲、下滲

A：確保分隔膜、硅膠圈、分隔室及壓扣蓋安裝正確。B：開泵抽液不要抽的太干，太快。待液體快排完時采用點動排液。

③漏液

在雜交前發(fā)現漏液的話需重新安裝配件。在雜交過程中要時時查看反應室的液體情況，若有漏液現象再加適量的雜交液即可。雜交實時問題解決方法雜交實時問題解決方法1）最佳：每次實驗做陰陽性對照各一（符合PCR實驗室考評標準）2）其二：每個批號做陰陽對照各一。3）其三：每周、每月或者每季度，做陰陽對照各一。4）大多臨床：不做陰陽對照（最節(jié)省醫(yī)院成本）。建議醫(yī)院做對照，但由檢驗科主任、PCR室負責人依據自身情況要求決定對照實驗頻率。陰陽性對照設置問題1）最佳：每次實驗做陰陽性對照各一（符合PCR實驗室考評標準結果判讀陰性結果陽性結果多重感染結果判讀陰性結果陽性結果多重感染導流雜交原理導流雜交原理

結果常見問題分析可能原因：1、

PCR產物變性后部分復性；2、DNA樣本中有對PCR反應的抑制物質，影響了PCR擴增的效率。1、弱/無信號或IC點不清楚，同時陽性點也不清楚或者比較淡2、IC及HPV分型陽性點不顯色（只有生物素點）可能原因：①可能存在PCR抑制劑，建議重新提取，如無原始標本，可用1：10稀釋DNA模板重復PCR過程；

②PCR產物變性后復性，可重新PCR擴增，然后再雜交分析。3、IC點弱/不顯色，但HPV分型陽性點顯色可能原因：①IC和HPVDNA之間存在競爭，高濃度的HPVDNA可能會對IC點的擴增反應產生競爭性抑制，此現象出現時如HPV分型點顯色正常，則分型結果正確；

②

可能雜交儀溫度輕微偏低，IC點的探針Tm值比各型別探針高。結果常見問題分析可能原因：1、PCR產物變性后部分復性；1

結果常見問題分析①PCR試劑可能被污染，取10l以上PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析；②陰性對照模板被污染，對照實驗驗證；③實驗過程操作污染，建議操作環(huán)境及所用移液槍消毒滅菌處理。5、陰性對照顯現HPV分型陽性點6、很高的背景①可能由于封閉不足，使未結合的酶殘留在膜上，請確保封阻液完全覆蓋整個雜

交膜；②可能因為沒有完全將未結合的試劑清洗干凈，請確保在顯色過程中雜交膜充分清洗，無剩余殘留液體；③顯色時間過長，顯色時間為3-5min，但可根據顯色程度來終止顯色反應。4、Biotin點不顯色①請確認所使用試劑是否仍在有效期內。②確定實驗操作是否嚴格按照說明書進行、試劑是否按要求保存使用。結果常見問題分析①PCR試劑可能被污染，取10l以上PC

可判讀的弱陽性可能擴增效率低，導致各點顯色較淺；樣本的DNA濃度較低；PCR產物變性后復性等。

IC點及陽性點都很弱多重感染在多重感染中，不同型別之間可能會存在競爭性抑制，導致個別型別被抑制，排除污染的情況下，弱陽性點都要報結果。可判讀的弱陽性可能擴增效率低，導致各點顯色較淺；IC點及陽污染的防治污染的防治用次氯酸鈉溶液（消毒水）/稀鹽酸擦拭相關實驗器材；打開實驗室窗戶，給實驗室通風；用紫外燈照射；如果以上方法處理兩三天均無效，將實驗室內耗材丟棄，換新耗材，同時做以上處理。污染的處理用次氯酸鈉溶液（消毒水）/稀鹽酸擦拭相關實驗器材；污染的處理陽性點很弱，IC點也很弱，應考慮是否為有抑制物，擴增效率低，導致雜交信號很弱與病理學結果不相符解釋客觀原因操作原因①HPV感染先于細胞學感染，HPV消退先于細胞學消退②HPV感染型別不在21種型別檢測范圍內③轉化區(qū)在宮頸管內，取不到轉化區(qū)細胞④病毒基因組整合入人細胞染色體并丟失L1片段而得到假陰性結果⑤樣本本身DNA濃度低，低于HPV分型檢測下限①樣本本身DNA濃度低，低于HPV分型檢測下限②反復凍融、運輸過程中DNA降解③DNA提取過程中，由于操作不慎造成DNA丟失（如去上清時，將DNA倒掉或者吸走、DNA溶解不夠充分等）

取樣造成：TCT取樣后取樣，沒取到有效細胞或用藥造成假陰性病理科結果判讀失誤陽性點很弱，IC點也很弱，應考慮是否為有抑制物，擴增效率低，創(chuàng)新專業(yè)追求卓越創(chuàng)新專業(yè)追求卓越演講完畢，謝謝觀看！演講完畢，謝謝觀看！凱普技術支持中心2013.04凱普HPV產品操作培訓凱普技術支持中心凱普HPV產品操作培訓技術原理：基因擴增導流雜交低密度基因芯片分型：15種高危型別：HPV16,18,31,33,35,39,45,51,52,53,56,58,59,66,68.6種低危型別：HPV6,11,42,43,44,CP8304（81）.21分型技術原理：21分型宮頸脫落細胞用棉試子擦去宮頸口的分泌物，取宮頸環(huán)狀上皮與柱狀上皮轉化處宮頸脫落細胞男性尿道標本

用細小棉拭子伸入尿道約2-4厘米，捻動拭子采集上皮細胞，將棉拭子置入無菌玻璃管，密閉送檢（采集標本前2小時禁小便）。男女性疣體標本

既可以直接切下疣體組織放進無菌玻璃管內，又可以用一次性注射器把疣體刺破后再用棉拭子反復擦拭病灶處脫落細胞置入無菌玻璃管，密閉送檢。適用樣本及采集方法①細胞學檢測采集的樣本中，凱普可以使用TCT檢測所剩余的保存液來檢測，但需要根據所剩細胞的濃度適當增加取樣量至1~2ml。②如果必須使用同類產品保存液保存的樣本，亞能與港龍的保存系統(tǒng)我司可以提取使用，HC-II的保存系統(tǒng)要確保未進行處理過才可使用。宮頸脫落細胞適用樣本及采集方法①細胞學檢測采集的樣本中，樣本采集前注意事項A不可在碘試驗和醋酸試驗之后采集樣本。

（可能會抑制PCR反應）

B檢查前48小時內不要作陰道沖洗，不要用避孕藥膏等

等陰道內用藥物。

（（可能會抑制PCR反應）

C檢查前48小時不應有性生活。D月經期不可采集標本。（防止血液過多）E注意避免交叉污染。樣本采集前注意事項A不可在碘試驗和醋酸試驗之后采集樣本先采集HPV檢測樣本，再采集TCT或LCT、病理組織樣本樣本采集后，如若不能馬上檢測，應將樣本置于冰箱4℃存放，并在一周時間內檢測。應避免反復凍融。一周后檢測的標本應保存在-20℃。樣本采集前注意事項先采集HPV檢測樣本，再采集TCT或LCT、病理組織樣本樣本取800μl臨床樣本，加入離心管中14000rpm離心3分鐘，去上清加入400μl溶液Ⅰ，混勻100℃裂解15分鐘加入400μl溶液Ⅱ，混勻，放置5分鐘14000rpm離心5分鐘，去上清14000rpm離心1分鐘，再次去上清加入60μl溶液Ⅲ充分溶解，-20℃保存對于無明顯肉眼可見組織刷取物時，可適當加大實驗樣本量，或多次收集樣本。取樣前振蕩混勻。溶液Ⅰ用于裂解細胞，釋放DNA。金屬浴應防止爆蓋發(fā)生，可壓重物，15分鐘后，待金屬浴溫度降至80℃以下再取出離心管；水浴應用螺旋蓋離心管，旋緊，同時應防止進水。裂解后應點動離心再加入溶液Ⅱ溶液Ⅱ用于溶解脂類、蛋白質等雜質，沉淀DNA。溶液Ⅱ放入冰箱預冷可提高DNA的沉降效率該步意在充分去除溶液Ⅱ，因溶液Ⅱ為有機溶劑，會影響Taq酶的活性，抑制PCR擴增，導致IC點淺或者不出的情況。溶液Ⅲ用于溶解DNA。點樣上機前，應進行離心，14000rpm，1分鐘。以沉淀細胞碎片等物質，防止擴增受到抑制。取800μl臨床樣本，加入離心管中14000rpm離心3分鐘超凈工作臺離心機標本制備區(qū)旋渦混合器微量移液器金屬加熱器離心機樣本制備所需儀器超凈工作臺離心機標本制備區(qū)旋渦混合器微量移液器金屬加熱器離心提取操作注意事項提取操作注意事項提取操作注意事項臨床樣本中有效細胞量太少：取500ul臨床樣本離心后，管底基本上看不到或者看到很少沉淀的時候，把第一次離心后的上清小心去掉，再加入500ul臨床樣本進行第二次離心，收集兩次沉淀細胞。臨床樣本中血液太多：有些臨床樣本中由于種種原因，含有太多的血液。處理方法為取500ul臨床樣本離心后，去除上清，然后加入蒸餾水洗滌兩次，或樣本離心后用槍吸去沉淀的血細胞臨床樣本中黏液太多：1，建議醫(yī)生按正確的方法取樣。2，再加入500ul的臨床樣本，震蕩混勻后，用1ml槍頭洗出部分溶液，離心后按照正常的操作程序進行。如果離心后沉淀比較少，可以重復一次。3，將刷子連帶粘在其上的粘液取出提取操作注意事項臨床樣本中有效細胞量太少：取500ul臨床男性樣本或女性疣體樣本提取方法（棉拭子樣本）提取操作注意事項

采集管內加500ul生理鹽水，充分振蕩

↓

溶液倒入提取管中，14000rpm離5min

↓

收集細胞

↓

下同宮頸分泌物標本操作采集管內加500ul溶液Ⅰ，充分振蕩

↓

轉移出400ul溶液至提取管中

100℃加熱15分鐘

↓

下同宮頸分泌物標本操作方法一方法二因方法二會因細胞太少而出現假陰性的情況，故建議用方法一操作男性樣本或女性疣體樣本提取方法（棉拭子樣本）提取操作注意事項石蠟包埋組織樣本提取方法提取操作注意事項WAYONE（1）稱取0.01-0.05克石蠟標本，放入到1.5ml的微量離心管中。

（2）加入1ml的二甲苯，室溫下孵育10分鐘除蠟，倒掉二甲苯。

（3）加入1ml100%無水乙醇，孵育10分鐘，倒掉無水乙醇。

（4）加入1ml95%1乙醇，孵育10分鐘，倒掉。

（5）加入1ml75%乙醇，孵育10分鐘，倒掉。

（6）室溫下讓乙醇揮發(fā)完全。

（7）組織重新懸浮在400μl溶液Ⅰ和1μl50mg/ml蛋白酶K，震蕩混勻。

（8）樣品56°C孵育3小時。

(9)

沸水中煮沸15分鐘。

(10)

冷卻,然后加入400μl溶液Ⅱ,充分混勻，室溫下放置2分鐘。

(11)

14000rpm離心5分鐘。

(12)

去干凈上清

(13)加入60μl溶液Ⅲ,充分溶解。取1μl作為PCR模板進行擴增或儲存在-20℃。新鮮組織樣本提取方法（1）稱取0.01-0.05克新鮮組織，研磨后加入細胞保存液形成懸液。若無法研磨可將組織剪碎并適當延長裂解時間。若有蛋白酶K，則在56℃下裂解直至消化完全，若無蛋白酶K則在100℃下裂解直至消化完全。（2）以下與常規(guī)提取相同。石蠟包埋組織樣本提取方法提取操作注意事項WAYON

匹基、達安等都是使用直接煮沸法提取的DNA，這樣的DNA純度較差，對于凱普HPV檢測中的PCR擴增過程會產生抑制，所以不能使用。

使用過柱法試劑盒，比如QIAGENE提取的DNA，可以保證其DNA的純度及濃度，可以使用。

提取DNA質量要求提取DNA質量要求PCR試劑的制備PCR試劑的制備1PCR試劑存放在-20℃中避光保存，避免反復凍融試劑。2

配制時嚴格按說明書上的比例和量進行混合分裝。3試劑準備區(qū)中進行，充分解凍試劑并且點動離心后，方可吸取混勻4酶與PCRmix要充分混勻。5分裝和加樣時，不可使用有粉橡膠手套，一般僅能佩戴薄膜手套。6PCR小管及其他實驗耗材不可長時間置于紫外燈下照射，否則會抑制PCR擴增。7

有條件的客戶，要對離心管、移液器吸嘴進行高壓滅菌，包裝完整的PCR小管可直接使用。8

注意對移液器的保養(yǎng)，移液器使用后應及時調回最大量程，并定期進行校準，防止量程偏大或者偏小。9

加樣時，盡量做到加完一個樣，立即關蓋，再加下一個樣。加樣完畢后，點動離心，清除氣泡。PCR試劑的制備1PCR試劑存放在-20℃中避光保存，避免反復凍融試劑。P擴增區(qū)PCR儀的質量要求最好選用進口PCR儀PCR儀的擴增速率不能太高，擴增儀的擴增速率最好保證1℃/s沒有熱蓋的PCR儀要注意加樣后再加一滴礦物油儀器運行的房間一定要打開空調擴增區(qū)PCR儀的質量要求①蠕動泵損壞

啟動蠕動泵后聽不到蠕動泵運轉的聲音，請送修。

②排液管粘連這種情況一般出現在新儀器第一次使用或儀器閑置太久后第一次使用。當啟動蠕動泵后聽到儀器內部有類似“啪啪”的聲音，可判斷是排液管粘連。解決方法是：在反應室內注入水，然后啟動蠕動泵直到排水即可。

③排液管堵塞

主要是實驗后清洗不徹底，或使用時間較久后，實驗液體中的化學物質殘留于排液管內形成結晶物，堵塞了排液管導致不能排液，其現象特征是啟動蠕動泵后，有蠕動泵正常運轉的聲音，但沒有液體排出。

解決方法：在反應室內加蒸餾水,升溫至65℃并保持幾分鐘,使結晶物溶化,然后排液。反復幾次使排水管暢通。如若仍不能排液則需要拆出排液管來清洗或更換排液管。

雜交前配件安裝問題解決方法①蠕動泵損壞雜交前配件安裝問題解決方法

④密封不良

A配件組裝不良

多孔板及分隔膜、硅膠圈沒有放好，形成空隙，造成整個系統(tǒng)不密封,建議重新放置。

B多孔板問題多孔板因跌落或其他原因造成變形，也會造成密封不良。另外由于多孔板加工精度的限制，多孔板的厚度并不完全均勻，在放入反應室時，放置的面或方向不同都會造成排液速度的變化，有時甚至會引起排液慢的現象，如果是這種情況可把多孔板翻轉一下。

C硅膠圈問題硅膠圈的老化，彈性不足，也是造成密封不良的原因之一，同時也會引起互滲。硅膠圈平時使用后應存放在陰涼干凈的地方，防止紫外線照射，定期更換硅膠圈。

雜交前配件安裝問題解決方法雜交前配件安裝問題解決方法外殼用軟布沾清水或稀釋的中性清洗劑擰干后擦拭，勿用酒精或其它有機溶劑清潔顯示屏部分。反應室、分隔室、多孔板、硅膠圈用軟刷子刷洗3次，再用紙吸干表面的水珠，自然晾干。分隔膜、硅膠圈沖洗即可，不要揉搓，用紙吸干表面的水珠，自然晾干。不可照紫外，不可浸泡次氯酸鈉溶液。外置電源表面的灰塵用干布擦拭干凈即可，注意檢查接線柱是否擰緊。雜交儀的維護外殼用軟布沾清水或稀釋的中性清洗劑擰干后擦拭，勿用酒精或其它水浴鍋HybirMax?醫(yī)用核酸分子快速雜交儀擴增產物分析區(qū)（雜交區(qū)）微量移液器雜交間所需儀器水浴鍋HybirMax?醫(yī)用核酸擴增產物分析區(qū)（雜交區(qū)）微量雜交操作注意事項雜交操作注意事項雜交操作注意事項酶標液與封阻液的瓶子規(guī)格及顏色一致（標簽顏色不同），加液前應確認后再加液。溶液I與溶液II亦如此。第一個孔與最后一個孔之間存在著加液時間差，第一個孔比最后一個孔的雜交時間要長2～3min。所以在加酶標液及顯色液時，順序應由最后一個孔往第一個孔加。減少膜整體之間的背景及點深淺差異。加熱變性后應保持儀器仍在運行狀態(tài)下迅速轉移出PCR產物放入冰水浴中雜交操作注意事項酶標液與封阻液的瓶子規(guī)格及顏色一致（標簽顏色①互滲

互滲的測定方法參見技術巡訪指引，若在雜交實驗前發(fā)現有互滲現象需立即停止后續(xù)實驗，重新安裝分隔硅膠圈、分隔室及壓扣蓋，再進行互滲現象試驗，如果仍然有此現象出現，則即使聯系廠家更換硅膠圈。

②反滲、下滲

A：確保分隔膜、硅膠圈、分隔室及壓扣蓋安裝正確。B：開泵抽液不要抽的太干，太快。待液體快排完時采用點動排液。

③漏液

在雜交前發(fā)現漏液的話需重新安裝配件。在雜交過程中要時時查看反應室的液體情況，若有漏液現象再加適量的雜交液即可。雜交實時問題解決方法雜交實時問題解決方法1）最佳：每次實驗做陰陽性對照各一（符合PCR實驗室考評標準）2）其二：每個批號做陰陽對照各一。3）其三：每周、每月或者每季度，做陰陽對照各一。4）大多臨床：不做陰陽對照（最節(jié)省醫(yī)院成本）。建議醫(yī)院做對照，但由檢驗科主任、PCR室負責人依據自身情況要求決定對照實驗頻率。陰陽性對照設置問題1）最佳：每次實驗做陰陽性對照各一（符合PCR實驗室考評標準結果判讀陰性結果陽性結果多重感染結果判讀陰性結果陽性結果多重感染導流雜交原理導流雜交原理

結果常見問題分析可能原因：1、

PCR產物變性后部分復性；2、DNA樣本中有對PCR反應的抑制物質，影響了PCR擴增的效率。1、弱/無信號或IC點不清楚，同時陽性點也不清楚或者比較淡2、IC及HPV分型陽性點不顯色（只有生物素點）可能原因：①可能存在PCR抑制劑，建議重新提取，如無原始標本，可用1：10