分子生物學(xué)技術(shù)在寄生蟲(chóng)學(xué)上應(yīng)用

分子生物學(xué)技術(shù)在寄生蟲(chóng)學(xué)研究及寄生蟲(chóng)病防治中的應(yīng)用概況中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院劉群一、在寄生蟲(chóng)病防治中的應(yīng)用

(疫苗研究）二、在寄生蟲(chóng)病診斷中的應(yīng)用三、在寄生蟲(chóng)的系統(tǒng)發(fā)育、種株鑒定和變異的研究中的應(yīng)用四、其它方面應(yīng)用第一節(jié)、分子生物學(xué)技術(shù)

在寄生蟲(chóng)病免疫預(yù)防中的應(yīng)用

一、基因工程苗（重組疫苗）的研制

所謂的基因工程是指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使之參入到原先沒(méi)有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)，而能維持穩(wěn)定的繁殖。

基因工程技術(shù)可能完成兩個(gè)基本任務(wù)：第一，可能按照人們的主觀愿望，創(chuàng)造出自然界中原先并不存在的新的生物類型；第二，它強(qiáng)調(diào)了一種確定的DNA小片段在新寄主細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增的事實(shí)。

基因工程苗的研制即是通過(guò)能夠獨(dú)立自主復(fù)制的載體分子質(zhì)粒或噬菌體為媒介，將來(lái)自于病原生物的外源DNA（目的基因）引入到寄主細(xì)胞進(jìn)行繁殖，從而生產(chǎn)出大量的帶有該外源基因的質(zhì)?；蚴删w，代替?zhèn)鹘y(tǒng)的疫苗。

基因工程苗研制主要步驟

（1）

從復(fù)雜的生物有機(jī)體基因組中，經(jīng)過(guò)酶切消化或PCR擴(kuò)增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片段。（2）

在體外，將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號(hào)的載體分子上，形成重組DNA分子。（3）

將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（亦稱寄主細(xì)胞），并與之一起增值。（4）

從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞克隆。（5）

從這些篩選出來(lái)的受體細(xì)胞克隆，提取出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因，供進(jìn)一步分析研究使用。（6）

將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。

二、核酸疫苗

核酸疫苗，就是把外源基因克隆到真核質(zhì)粒表達(dá)載體上，然后將重組的質(zhì)粒DNA直接注射到動(dòng)物體內(nèi)，使外源基因在活體內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生的抗原激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，引發(fā)免疫反應(yīng)

.核酸疫苗研制的技術(shù)路線

1）目的基因的選擇：選擇目的基因時(shí)須確認(rèn)目的基因中是否含有多余的內(nèi)含子，該該內(nèi)含子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)是否影響外顯子在轉(zhuǎn)錄成mRNA時(shí)的連接，如果侯選基因片段是PCR產(chǎn)物，須經(jīng)測(cè)序確認(rèn)。2）選擇合適的真核質(zhì)粒表達(dá)載體：載體需含有真核啟動(dòng)子，質(zhì)粒DNA不能整合到宿主細(xì)胞染色體并能持續(xù)穩(wěn)定地表達(dá)目的基因，CpG基元(motif)序列可增強(qiáng)免疫?，F(xiàn)一般選擇含CMV啟動(dòng)子的pcDNA3作為表達(dá)載體。3)將目的基因與表達(dá)載體相連，構(gòu)成重組子。提取重組子后用離子交換層析法純化。

4）轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞檢測(cè)相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)。5）可選擇含有報(bào)告基因的表達(dá)載體做對(duì)照，分析轉(zhuǎn)入的DNA是否表達(dá)，報(bào)告基因可為β-半乳糖苷酶基因或綠色熒光蛋白基因。6)確定疫苗接種的方式和劑量。

三、基因工程苗和DNA

疫苗在寄生蟲(chóng)病預(yù)防方面的研究與應(yīng)用

1）原蟲(chóng)病：很多嚴(yán)重的人及畜禽疾病都是由原蟲(chóng)引起的，如瘧疾、球蟲(chóng)病、弓形蟲(chóng)病等等。研究者在原蟲(chóng)分子疫苗的研制上花費(fèi)了大量的心血，分離鑒定了一些保護(hù)性抗原，并在體外克隆表達(dá)了部分抗原。

球蟲(chóng)病、瘧疾、利什曼原蟲(chóng)病、隱孢子蟲(chóng)病

2）吸蟲(chóng)病片形吸蟲(chóng)病、血吸蟲(chóng)病

3）

囊尾蚴及棘球蚴病

4）胃腸道線蟲(chóng)病

牛的血矛線蟲(chóng)、食道口線蟲(chóng)、仰口線蟲(chóng)病，5）外寄生蟲(chóng)病

蠅、虱、螨、蜱等外寄生蟲(chóng)嚴(yán)重危害著牛、羊的健康，這方面疫苗研究取得的重大突破就是澳大利亞Biotech及CSIRO（聯(lián)邦科學(xué)及工業(yè)研究組織）研制的大腸桿菌表達(dá)的微小牛蜱基因工程苗（Bm86疫苗），商品名為TickGard，與此類似的是古巴用酵母Pichiapastoralis表達(dá)的Gavac苗，并由HeberBiotec公司生產(chǎn)。

第二節(jié)分子生物學(xué)技術(shù)

在寄生蟲(chóng)病診斷（檢測(cè)）中的應(yīng)用主要應(yīng)用于原蟲(chóng)病的診斷。例如應(yīng)用PCR技術(shù)診斷新孢子蟲(chóng)病、弓形蟲(chóng)病、球蟲(chóng)病等第三節(jié)在寄生蟲(chóng)的系統(tǒng)發(fā)育、種株鑒定和變異的研究中的應(yīng)用

（一）PCR技術(shù)以及PCR衍生技術(shù)的應(yīng)用

寄生蟲(chóng)的遺傳變異現(xiàn)象十分普遍，精確分析寄生蟲(chóng)的遺傳變異在寄生蟲(chóng)的分類鑒定及遺傳變異研究中就具有重要意義，這類研究已成為近年的熱點(diǎn)。由于PCR技術(shù)的高度敏感性，利用PCR技術(shù)在體外由微量模板DNA(理論上為一個(gè)分子)合成大量DNA，對(duì)于分析單個(gè)蟲(chóng)卵、幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)的遺傳變異十分有利。它克服了傳統(tǒng)分類學(xué)研究的缺點(diǎn),近年來(lái)在寄生蟲(chóng)的分類研究中得到了廣泛的應(yīng)用。1、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RandomlyAmplifiedPolymorphicDNAs,簡(jiǎn)稱RAPD)

1）RAPD是用一個(gè)隨機(jī)的、短的脫氧核苷酸序列（一般9~10個(gè)）作做引物，對(duì)基因組DNA繼續(xù)擴(kuò)增而顯示多態(tài)性片段。RAPD與常規(guī)PCR相比有如下優(yōu)點(diǎn)：事先不需要知道DNA序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，技術(shù)上簡(jiǎn)便、快速，成本低，只需微量DNA即可進(jìn)行擴(kuò)增，可以對(duì)整個(gè)基因組作變異研究。2）RAPD數(shù)據(jù)分析:（1）定性判斷分析：每一引物擴(kuò)增產(chǎn)物大小可從電泳時(shí)所用的相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中計(jì)算出來(lái)，這些擴(kuò)增帶形成RAPD圖譜。從個(gè)體、群體、亞種和物種水平上比較每一引物的RAPD圖譜，可以獲得個(gè)體、群體、亞種和種水平上的特異性帶，由這些帶組成圖譜，以用于各種水平的分類鑒定。（2）性狀數(shù)據(jù)分析法：將每一引物擴(kuò)增每一樣品產(chǎn)生的每條帶作為性狀看待，當(dāng)在某一樣品中有該條帶時(shí)編碼為1，否則為0，構(gòu)成二態(tài)狀集，用非參數(shù)判別分析方法進(jìn)行分析。

（3）距離數(shù)據(jù)分析方法：Williams和Black用FORTRAN語(yǔ)言編寫(xiě)的RAPD分析軟件“RAPDLOT”將擴(kuò)增片段的二態(tài)數(shù)據(jù)按下式數(shù)據(jù)變換成距離數(shù)據(jù)：

D=1-MM=Nab/Nt其中Nab為兩樣品具有相同擴(kuò)增片段的數(shù)目，Nt為樣品記錄中的片段總數(shù)。計(jì)算出的距離矩陣用UPGMA進(jìn)行聚類分析。個(gè)體中的RAPD圖譜可以在群體內(nèi)或個(gè)體間兩個(gè)水平上比較比較。某一片段在一個(gè)個(gè)體中存在時(shí)記為1，否則則記為0。個(gè)體間的相似系數(shù)：

Sxy=2Nxy/Nx+Ny。群體內(nèi)的相似系數(shù)為群體內(nèi)所有個(gè)體Sxy值的平均值，群體間相似系數(shù)可以從群體內(nèi)相似系數(shù)校正為

Sij=1=Sˊij-0.5(Si+Sj)Sij也可以轉(zhuǎn)化為遺傳距離：

Dˊij=-In(Sˊij/√SiSj)Dˊij值構(gòu)成的矩陣可用UPGMA法進(jìn)行聚類分析。

3、RAPD在寄生蟲(chóng)學(xué)研究中的應(yīng)用

1)血吸蟲(chóng)：1993年Neto等對(duì)5株曼氏分體吸蟲(chóng)（Schistosommamansoni）和S.intercalatum及S.curassoni進(jìn)行DNA多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)同種不同株間吸蟲(chóng)用某些引物擴(kuò)增時(shí)DNA條帶出現(xiàn)明顯差異，而不同種吸蟲(chóng)間的DNA條帶的差異明顯高于株間的差異。Barral等對(duì)5種分體吸蟲(chóng)和3株曼氏分體吸蟲(chóng)的RAPD分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)該技術(shù)可作為寄生蟲(chóng)種株鑒定和遺傳變異分析的工具。2）錐蟲(chóng)及其它原蟲(chóng)：Waitumbi等應(yīng)用RAPD方法對(duì)錐蟲(chóng)（Trypanosomes）進(jìn)行種間及種內(nèi)差異的研究，發(fā)現(xiàn)該技術(shù)同樣適用于錐蟲(chóng)的亞屬和亞種的鑒別。Joachim等應(yīng)用RAPD技術(shù)區(qū)分寄生于綿羊體內(nèi)的4種原蟲(chóng)：Sarcocystistenella,Sarcocystisgigamea,Sarcocystisarieticanis和Toxoplasmagondii，并認(rèn)為RAPD技術(shù)可以用于分離和鑒定住肉孢子蟲(chóng)(Sarcocystis)蟲(chóng)種的遺傳標(biāo)記。汪明采用RAPD方法對(duì)水牛梭形住肉孢子蟲(chóng)、待定種及黃?？菔献∪怄咦酉x(chóng)緩殖子基因組DNA進(jìn)行了分析，篩選出能夠鑒別不同住肉孢子蟲(chóng)蟲(chóng)種的引物。3）球蟲(chóng)：Macpherson等（1993）利用RAPD技術(shù)鑒別了包括柔嫩、尼氏、邱氏艾美耳球蟲(chóng)等寄生于不同宿主的7種球蟲(chóng)，發(fā)現(xiàn)選擇合適的引物可以鑒別出這7種艾美耳球蟲(chóng)。劉群（1998）分析了雞的4種球蟲(chóng)及多個(gè)蟲(chóng)株之間的RAPD多態(tài)性，認(rèn)為RAPD技術(shù)可以用于同宿主艾美耳球蟲(chóng)蟲(chóng)種的分類鑒定，并且可以作為球蟲(chóng)株間變異的分子標(biāo)記方法及球蟲(chóng)株間關(guān)系距離的檢測(cè)手段。4）線蟲(chóng)：張路平對(duì)松材線蟲(chóng)和擬松材線蟲(chóng)的線粒體DNA進(jìn)行了RAPD多態(tài)性分析，得到了彼此之間的遺傳關(guān)系圖和遺傳距離，并認(rèn)為松材線蟲(chóng)和擬松材線蟲(chóng)是兩個(gè)獨(dú)立的種。此外，RAPD技術(shù)還可以與基因突變檢測(cè)技術(shù)結(jié)合，以檢測(cè)“隱藏”在看起來(lái)為單態(tài)帶中的序列變異。4）RAPD技術(shù)也有局限性。首先，反應(yīng)條件的細(xì)小變化或使用不同的PCR擴(kuò)增儀可能使實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性差；其次，由于不嚴(yán)格的PCR擴(kuò)增條件及引物的隨機(jī)特性，污染的異源DNA可與目的DNA同時(shí)被擴(kuò)增。為了使結(jié)果的重復(fù)性好，可以通過(guò)提高退火溫度來(lái)增加其嚴(yán)格性。（二）、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AmplifiedFragmentLengthPolymorphic,簡(jiǎn)稱AFLP）

AFLP是一種用于分析基因組變異的新型DNA指紋技術(shù)，是基于對(duì)基因組DNA酶切后限制性片段的選擇性擴(kuò)增。原理：采用兩種限制性內(nèi)切酶將基因組DNA消化，將特異的寡核苷酸與酶切片段連接在一起，以形成用于PCR擴(kuò)增的模板DNA；然后用序列能與限制性位點(diǎn)核苷酸序列配對(duì)的特異引物對(duì)限制性片段進(jìn)行特異性擴(kuò)增；最后，PCR產(chǎn)物通過(guò)變性凝膠電泳進(jìn)行分離。根據(jù)電泳系統(tǒng)的分辯力，可以擴(kuò)增50-100個(gè)限制性片段，并且通過(guò)變性凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。優(yōu)點(diǎn)：由于使用了特異性引物，與RAPD相比，AFLP具有更好的重復(fù)性和可靠性，避免了非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)生。這項(xiàng)技術(shù)現(xiàn)在主要被用于植物基因組、昆蟲(chóng)和細(xì)菌基因組研究中。利用這種技術(shù)進(jìn)行細(xì)菌的分類與鑒定，不需要事先知道DNA序列資料，可用于來(lái)源復(fù)雜的目的DNA,穩(wěn)定可靠。由于AFLP方法需要較大量的DNA(0.2-1mg),所以這項(xiàng)技術(shù)在寄生蟲(chóng)研究特別是原蟲(chóng)研究中的應(yīng)用受到一定限制。但Thompson等認(rèn)為在蟲(chóng)體DNA量較少和缺少序列信息的情況下，AFLP可以作為初步的篩選手段，發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)體的DNA多態(tài)性，便于設(shè)計(jì)引物和克隆基因。三、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SingleStrandConformationPolymorphism,簡(jiǎn)稱SSCP)

SSCP是Orita等于1989年建立的一種簡(jiǎn)便、靈敏的基因突變檢測(cè)方法。它不同于根據(jù)DNA片段大小分離雙股DNA分子的傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)電泳方法，而是根據(jù)相同或相似分子量但序列不同的DNA分子的物理特性來(lái)分離DNA分子。由于SSCP常常用于分析PCR產(chǎn)物，因此也被稱為PCR-SSCP

。原理：在非變性凝膠基質(zhì)中，單股DNA分子的電泳遷移率取決于其結(jié)構(gòu)（構(gòu)象）及大小，在每股DNA分子內(nèi)，由于核苷酸之間的堿基配對(duì)，使單股DNA分子發(fā)生二級(jí)及三級(jí)構(gòu)象，這些構(gòu)象取決于單股DNA分子的長(zhǎng)度、堿基組成、堿基配對(duì)區(qū)的位置及數(shù)量，在最佳條件下，即使在某一特定位置的一個(gè)堿基變化亦可改變分子構(gòu)象，從而導(dǎo)致電泳遷移率有所改變。不同遷移率的單股DNA帶可從電泳膠上切下來(lái)，進(jìn)行再次PCR擴(kuò)增并測(cè)序，以確定核苷酸變異。由于SSCP技術(shù)簡(jiǎn)便、快速、成本低，已在許多研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。寄生蟲(chóng)學(xué)家們也開(kāi)始將這種方法用于寄生蟲(chóng)的分類、鑒定及遺傳結(jié)構(gòu)研究中。Gasser等]應(yīng)用PCR-SSCP方法對(duì)多種蛔蟲(chóng)與圓線蟲(chóng)進(jìn)行了分類鑒定，研究表明，不同蟲(chóng)種的核糖體DNA的ITS-2片段的單股構(gòu)象可以用于蟲(chóng)種種間鑒別。Gasser認(rèn)為,PCR-SSCP方法可以用于線蟲(chóng)蟲(chóng)種鑒定，并且可以用于研究種內(nèi)ITS-2片段的變異水平。

（四）PCR-RFLP技術(shù)1、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,簡(jiǎn)稱RFLP)

1）RFLP方法的原理：來(lái)源于細(xì)菌的限制性內(nèi)切酶通?？梢宰R(shí)別并消化長(zhǎng)度為4-6bp的特異性DNA序列，這樣較大的DNA分子可以被降解成許多長(zhǎng)短不等的較小片段。所產(chǎn)生的DNA片段的數(shù)目和長(zhǎng)度反映了酶切位點(diǎn)在DNA分子上的分布。對(duì)于每一個(gè)DNA/限制性內(nèi)切酶組合來(lái)說(shuō)，所產(chǎn)生的片段是特異性的，它能作為某一DNA(或含這種DNA的生物)所特有的“指紋”。四、寄生蟲(chóng)基因組與模式生物基因組研究進(jìn)展

主要內(nèi)容前言人類基因組計(jì)劃簡(jiǎn)介寄生蟲(chóng)基因組計(jì)劃簡(jiǎn)介模式生物基因組簡(jiǎn)介比較基因組學(xué)研究寄生蟲(chóng)基因組研究方向一、前言

人類基因組計(jì)劃(HumanGenomeProject,HGP)是人類自然科學(xué)史上的偉大創(chuàng)舉，它的規(guī)?？梢耘c“曼哈頓原子彈計(jì)劃”、“阿波羅”登月計(jì)劃媲美，但其科學(xué)意義遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了這兩個(gè)計(jì)劃。HGP的主要目標(biāo)是測(cè)定人類的基因組的全部序列，進(jìn)而闡明基因所處的位置、結(jié)構(gòu)、功能、表達(dá)調(diào)控方式，以及重大疾病的致病機(jī)理。為了順利完成人類基因組特別是功能基因組計(jì)劃，相繼啟動(dòng)了模式生物基因組計(jì)劃（ModelOrganismGenomeproject,MOGP）：如大腸埃希菌（Escherichiacoli）、流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)

、釀酒酵母(Sacharomycescerevisiae)

、果蠅(Drosophilamelanogaster)

、擬南芥(Arabidopsisthaliana)

以及哺乳動(dòng)物小鼠(musmusculus)

等基因組計(jì)劃研究。與此同時(shí)，也開(kāi)展了寄生蟲(chóng)基因組計(jì)劃(ParasiteGenomeProject,PGP)，如秀麗線蟲(chóng)(Caenorhabditiselegans)

和血吸蟲(chóng)(Schistosomespp)基因組計(jì)劃等，并作為HGP的重要組成部分，在比較基因組學(xué)研究中扮演了重要的角色

?，F(xiàn)通過(guò)介紹寄生蟲(chóng)基因組和其它模式生物基因組研究進(jìn)展情況，來(lái)揭示未來(lái)生命科學(xué)發(fā)展的趨勢(shì)，以此進(jìn)一步推進(jìn)寄生蟲(chóng)學(xué)的發(fā)展，同時(shí)寄生蟲(chóng)學(xué)及寄生蟲(chóng)病學(xué)工作者有必要了解現(xiàn)代科技發(fā)展的最新動(dòng)態(tài)，明確寄生蟲(chóng)科學(xué)在后基因組時(shí)代所扮演的重要角色和應(yīng)肩負(fù)的歷史重任。二、人類基因組計(jì)劃簡(jiǎn)介(HumanGenomeProject,HGP)

起止時(shí)間:1987年美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院研究所（NationalInstituteofHealth,NIH）和美國(guó)能源部(DepartmentofEnergy,DOE)聯(lián)合提出“人類基因組計(jì)劃”，并于1990年10月1日正式啟動(dòng)，隨后成為包括我國(guó)在內(nèi)的六個(gè)國(guó)家及公司的國(guó)際合作項(xiàng)目。2000年6月26日，人類基因組計(jì)劃與Celera公司的負(fù)責(zé)人共同宣布了人類基因組工作框架圖的完成，2001年2月并分別將自己測(cè)定的框架圖發(fā)表在“Nature”和“Science”與大眾公布。主要目標(biāo):

測(cè)定人類的基因組的全部序列，進(jìn)而闡明基因所處的位置、結(jié)構(gòu)、功能、表達(dá)調(diào)控方式，以及重大疾病的致病機(jī)理。取得的成就:

發(fā)表的工作框架圖已能覆蓋人類基因組全長(zhǎng)的97%，其中至少92%的序列已組裝得準(zhǔn)確無(wú)誤，并認(rèn)為編碼蛋白質(zhì)的為3-4萬(wàn)多個(gè)，不是以前估計(jì)的10-14萬(wàn)個(gè)。三、寄生蟲(chóng)基因組研究進(jìn)展1．寄生蟲(chóng)生物學(xué)特性和基因組研究概況

寄生蟲(chóng)與病毒、細(xì)菌相比是復(fù)雜病原體，不僅有多個(gè)發(fā)育階段，而且有復(fù)雜的生活史，其生物學(xué)特性與高等生物相似，有的寄生蟲(chóng)的基因組僅為人類的1/10，預(yù)測(cè)表達(dá)蛋白僅比人少1/3。早在20世紀(jì)90年代初期，WHO、聯(lián)合國(guó)發(fā)展計(jì)劃署和世界銀行等共同制定了寄生蟲(chóng)基因組計(jì)劃，研究的對(duì)象主要是對(duì)熱帶地區(qū)公共健康有重要影響的寄生蟲(chóng)，包括原蟲(chóng)的瘧原蟲(chóng)、錐蟲(chóng)和利什曼原蟲(chóng)，蠕蟲(chóng)的絲蟲(chóng)和血吸蟲(chóng)等。目前已經(jīng)開(kāi)始和完成了秀麗線蟲(chóng)(Caenorhabditiselegans)、日本血吸蟲(chóng)(Schistosomejaponicum)、曼氏血吸蟲(chóng)(S.mansoni)、惡性瘧原蟲(chóng)(Plasmodiumfalciparum)、枯氏錐蟲(chóng)（Tryanosomacruzi）、布氏錐蟲(chóng)(T.brucei)、碩大利什曼原蟲(chóng)(Leishmannia.major)、馬來(lái)絲蟲(chóng)(B.malayi)、剛地弓形蟲(chóng)(Toxplasmagondii)基因組計(jì)劃等，取得了很大進(jìn)展。以下重點(diǎn)介紹血吸蟲(chóng)和秀麗線蟲(chóng)基因組計(jì)劃的研究進(jìn)展。1．血吸蟲(chóng)生物學(xué)特性和基因組研究概況1.1.血吸蟲(chóng)生物學(xué)和基因組特點(diǎn)

血吸蟲(chóng)主要包括日本血吸蟲(chóng)、曼氏血吸蟲(chóng)和埃及血吸蟲(chóng)，它有蟲(chóng)卵、胞蚴、毛蚴、尾蚴、成蟲(chóng)等多個(gè)發(fā)育階段和復(fù)雜的生活史，由8對(duì)染色體組成，其中7對(duì)常染色體，1對(duì)性染色體，雌蟲(chóng)是異配性別（ZW型），雄蟲(chóng)是同配性別（ZZ型）。

血吸蟲(chóng)單倍體基因組含有2.7×108

個(gè)堿基對(duì)，約為人類基因組的1/10，其中有60％的高、中度重復(fù)序列，30％的單拷貝序列，其復(fù)雜性與軟體動(dòng)物相似，估計(jì)有15000～20000個(gè)基因。

血吸蟲(chóng)基因組計(jì)劃（SchistosomeGenomeProject,SGP）繼人類基因組計(jì)劃之后，于1992年由巴西政府首先發(fā)起，美國(guó)基因組研究協(xié)會(huì)作為后勤保障。目前WHO血吸蟲(chóng)基因組協(xié)作組是最廣泛的國(guó)際合作組織之一，包括歐洲、亞洲、非洲、澳洲和南北美洲，由Verde博士統(tǒng)一協(xié)調(diào)，Johnston博士任秘書(shū)長(zhǎng)。

2001年我國(guó)也啟動(dòng)自己的血吸蟲(chóng)基因組研究計(jì)劃，研究材料是日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株。

1.2、血吸蟲(chóng)基因組研究進(jìn)展血吸蟲(chóng)基因組協(xié)作組已經(jīng)開(kāi)展了5個(gè)方面的研究：1）發(fā)現(xiàn)和描述新的曼氏血吸蟲(chóng)和日本血吸蟲(chóng)基因；2）建立主要針對(duì)曼氏血吸蟲(chóng)的低分辨率物理圖譜；3）測(cè)定和分析曼氏和日本血吸蟲(chóng)的線粒體基因組；4）特異性發(fā)育階段或各期生活史的cDNA文庫(kù)、扣除cDNA文庫(kù)、標(biāo)化cDNA文庫(kù)、大片段基因文庫(kù)及基因點(diǎn)陣；5）創(chuàng)建和維護(hù)血吸蟲(chóng)的互聯(lián)網(wǎng)站和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)――“SchistoDB”。cDNA文庫(kù)和EST序列分析已構(gòu)建了血吸蟲(chóng)不同發(fā)育階段的cDNA文庫(kù)，其中日本血吸蟲(chóng)構(gòu)建了4個(gè)cDNA文庫(kù)，中國(guó)完成了毛蚴和成蟲(chóng)的cDNA文庫(kù)，另外2個(gè)由菲律賓構(gòu)建；曼氏血吸蟲(chóng)構(gòu)建了16個(gè)cDNA文庫(kù)，中國(guó)沒(méi)有參與研究。EST(序列表達(dá)標(biāo)簽)是從cDNA文庫(kù)中挑選出單個(gè)克隆進(jìn)行部分序列測(cè)定，并將這些序列作為基因的標(biāo)志，對(duì)基因差異表達(dá)的研究具有重要價(jià)值。至1999年底，EST庫(kù)中已有曼氏血吸蟲(chóng)EST12508個(gè)，日本血吸蟲(chóng)EST1370個(gè)。Johnston（1999）對(duì)8193個(gè)曼氏血吸蟲(chóng)基因組序列和891個(gè)日本血吸蟲(chóng)基因組序列進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)分別有4450和640個(gè)基因。最近用EST方法進(jìn)行了血吸蟲(chóng)不同生活階段基因表達(dá)的比較研究。Franco等對(duì)曼氏血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵、毛蚴、童蟲(chóng)和成蟲(chóng)的1123個(gè)EST分析，發(fā)現(xiàn)有466個(gè)基因，其中427個(gè)為新發(fā)現(xiàn)的，一些是階段特異表達(dá)的，而另一些是各階段都表達(dá)的“管家基因”。Fan等用日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵、成蟲(chóng)和尾蚴cDNA文庫(kù)的747個(gè)EST，分析有457個(gè)基因，在249個(gè)暫定的基因中，13個(gè)基因在一個(gè)以上的階段表達(dá)。在208個(gè)與數(shù)據(jù)庫(kù)中不相匹配的基因中，2個(gè)基因在3個(gè)發(fā)育階段都表達(dá)，另一些在2個(gè)發(fā)育階段表達(dá)。基因組文庫(kù)與物理圖譜血吸蟲(chóng)基因組研究有著悠久的歷史，20世紀(jì)初就有血吸蟲(chóng)核型分析的報(bào)道，1965年才完成了曼氏血吸蟲(chóng)核型分析，隨后對(duì)C帶和G帶的特征做了補(bǔ)充。對(duì)血吸蟲(chóng)核型分析發(fā)現(xiàn)，血吸蟲(chóng)株間著絲點(diǎn)位置和C帶只存在很少的差異，而種間的變異較大，故用于描述血吸蟲(chóng)屬內(nèi)的染色體變化。1974年Hillyer首先從曼氏血吸蟲(chóng)中分離DNA，并進(jìn)行測(cè)序。1994年，由巴西、美國(guó)和日本等合作的實(shí)驗(yàn)室，構(gòu)建了第一個(gè)曼氏血吸蟲(chóng)的YAC文庫(kù)，并繪制了第一個(gè)染色體圖譜。由大片段基因克隆構(gòu)建的文庫(kù)是繪制物理圖譜的基本條件之一，目前已獲得兩類可用于制圖的基因組文庫(kù)，一類是YAC文庫(kù)，有2300個(gè)克隆，平均插入片段為358kb;另一類是BAC文庫(kù)，有28000個(gè)克隆，插入片段為100～150kb。線粒體DNA(mtDNA)測(cè)序

最近開(kāi)展了日本血吸蟲(chóng)、曼氏血吸蟲(chóng)、埃及血吸蟲(chóng)mtDNA克隆和測(cè)序計(jì)劃，這項(xiàng)計(jì)劃的目標(biāo)是:1)由于mtDNA編碼的蛋白質(zhì)與代謝的膜轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，研究mtDNA為新藥開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)；2）分析發(fā)現(xiàn)幾個(gè)常見(jiàn)的EST序列由mtDNA編碼，包含整個(gè)mtDNA的克隆可作為探針庫(kù)用于cDNA文庫(kù)篩選；3）為有效控制血吸蟲(chóng)病的流行，希望找到用來(lái)分析血吸蟲(chóng)種群內(nèi)分化程度和種群間關(guān)系的方法，以監(jiān)測(cè)流行地區(qū)血吸蟲(chóng)病的發(fā)生和傳播。研究證實(shí)mtDNA的進(jìn)化比基因組進(jìn)化更快，可能成為一個(gè)很好的種群進(jìn)化標(biāo)記。已發(fā)現(xiàn)曼氏血吸蟲(chóng)株間mtDNAd-環(huán)的大小存在明顯差異，各種群間d-環(huán)VNTR序列也存在差異。對(duì)它的研究可成為血吸蟲(chóng)病流行病學(xué)的疾病監(jiān)控標(biāo)志。

生物信息學(xué)和數(shù)據(jù)庫(kù)

建立血吸蟲(chóng)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(schistosomegenomedatabase,SchistDB)是WTO血吸蟲(chóng)基因組計(jì)劃的基本目標(biāo)之一。已建立的數(shù)據(jù)庫(kù)包括的內(nèi)容有：1）DNA和蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)；2）序列的BLAST結(jié)果；3)序列簇資料、基因組的文獻(xiàn)圖表；4)血吸蟲(chóng)協(xié)作組的信息交流和有關(guān)分子生物學(xué)研究的最新進(jìn)展等，這個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)可從寄生蟲(chóng)基因組FTP站點(diǎn)下載，也可以直接在國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)上瀏覽應(yīng)用。2.秀麗線蟲(chóng)基因組研究進(jìn)展

2.1秀麗線蟲(chóng)生物學(xué)和基因組特點(diǎn)

秀麗線蟲(chóng)是新桿線蟲(chóng)的一個(gè)種，是一微小的自由生活的土壤線蟲(chóng)，而另一些新桿線蟲(chóng)對(duì)動(dòng)物是致病性或寄生性的。在線蟲(chóng)早期發(fā)育階段，由受精卵產(chǎn)生5個(gè)體基細(xì)胞—AB、MS、E、C、D和一個(gè)性腺基細(xì)胞P。線蟲(chóng)大多數(shù)組織都由幾個(gè)基細(xì)胞共同發(fā)育而來(lái)，如皮下、神經(jīng)、肌肉等組織；只有腸道和性腺分別由單個(gè)基細(xì)胞獨(dú)立分化而來(lái)，在胚胎發(fā)育的前半段，體基細(xì)胞通過(guò)固定的細(xì)胞譜系共產(chǎn)生1090個(gè)子細(xì)胞，其中131個(gè)經(jīng)歷了程序性死亡（Programmeddeath），剩下的959個(gè)細(xì)胞終止分化或變成胚胎后干細(xì)胞。

該線蟲(chóng)雌雄異體，成蟲(chóng)全身透明，長(zhǎng)約1mm，一般生長(zhǎng)周期為3～4d，其發(fā)育模式是沿固定的細(xì)胞譜系（celllineage）進(jìn)行，即由一個(gè)細(xì)胞發(fā)育成多細(xì)胞生物體，因此它成為研究動(dòng)物發(fā)育的理想模式系統(tǒng)。

2、2、基因組測(cè)序：

秀麗線蟲(chóng)作為第一個(gè)多細(xì)胞真核生物被完全測(cè)序，基因組有6對(duì)染色體，其中5對(duì)為常染色體，1對(duì)性染色體，雌雄異體，雌蟲(chóng)為XX，雄蟲(chóng)為XO，雄蟲(chóng)個(gè)體數(shù)量較少，僅占萬(wàn)分之五。于1990年開(kāi)始進(jìn)行基因組計(jì)劃研究，1998年12月完成了基因組的測(cè)序。

基因組堿基數(shù)為97Mb，GC含量為56％，已有60000個(gè)cDNA被標(biāo)簽測(cè)序，分析了101000個(gè)EST序列,包含有19099蛋白基因

，每個(gè)基因平均有5個(gè)內(nèi)含子，外顯子比例占基因組的27％。2.3、秀麗線蟲(chóng)參與細(xì)胞凋亡的基因及分子發(fā)生機(jī)制研究進(jìn)展

在個(gè)體的發(fā)育過(guò)程中，線蟲(chóng)細(xì)胞通過(guò)固定的細(xì)胞譜系進(jìn)行分化或死亡，除與細(xì)胞決定模式有關(guān)外，還有多類基因如Ced、Csp、Egl、Ces等參與了線蟲(chóng)細(xì)胞的程序性死亡（ProgrammedCellDeathorApoptosis）即細(xì)胞凋亡的調(diào)控，這些基因起著控制識(shí)別、吞噬及消化死亡細(xì)胞的作用。四、模式生物基因組計(jì)劃（ModelOrganismGenomeproject,MOGP）

基因組計(jì)劃包括結(jié)構(gòu)基因組（Structuralgenomics）計(jì)劃和功能基因組（Functionalgenomics）計(jì)劃，前者主要包括兩方面：定位和排列即完成基因組的遺傳圖譜、物理圖譜、序列圖譜和基因圖譜。后者主要研究基因所具有的功能，并確定在生物體生命活動(dòng)過(guò)程中是如何發(fā)揮作用的。把研究較多的一些低等生物作為模式生物進(jìn)行比較分析，從其基因組中發(fā)現(xiàn)一些普遍規(guī)律或重要信息，來(lái)作為其它基因組研究的基礎(chǔ)。

起因:

為了順利完成人類基因組特別是功能基因組計(jì)劃，將一些低等生物作為高等生物特別是人的模式生物進(jìn)行基因組的研究是非常必要的,模式生物是橋梁。種類：大腸桿菌（Escherichiacoli）、流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)

、釀酒酵母(Sacharomycescerevisiae)

、秀麗線蟲(chóng)(Caenorhabditiselegans)

、果蠅(Drosophilamelanogaster)

、擬南芥(Arabidopsisthaliana)

、小鼠(musmusculus)

等哺乳動(dòng)物。

1、流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)：

采用shotgun策略，將基因組DNA打成2kb左右的小片段分別克隆，用了19687個(gè)模板，進(jìn)行了28643個(gè)測(cè)序反應(yīng)，組建了140個(gè)片段重疊群，僅用了3-4個(gè)月的時(shí)間完成全部的測(cè)序工作，于1995年7月第一個(gè)細(xì)菌基因組全序列發(fā)表，大小為1.8Mb。這是微生物以至整個(gè)生物學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)里程碑。它含1703個(gè)基因或ORF。從其DAN全序列中鑒定出76個(gè)基因，其中32個(gè)（與其它病原菌同源）均表達(dá)細(xì)胞表面蛋白。2、大腸桿菌（Escherichiacoli）:

20世紀(jì)70年代初期，在發(fā)現(xiàn)DNA重組技術(shù)的同時(shí)，就開(kāi)展了大腸桿菌基因組的研究。它主要包括揭示新基因，查明DNA序列和基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及該基因的功能與基因間的調(diào)控關(guān)系即操縱子學(xué)說(shuō)。這一技術(shù)路線也成為其它模式生物特別是人的基因組計(jì)劃研究技術(shù)路線。

1997年9月，大腸桿菌的完整基因圖譜已繪制成功，基因組全序列完成，全長(zhǎng)為5Mb，共有4288個(gè)基因，同時(shí)也搞清了所有基因的氨基酸序列。

62%的基因功能已經(jīng)闡明，仍有38%基因功能尚未完全搞清。3、釀酒酵母(Sacharomycescerevisiae)：

它是最簡(jiǎn)單的真核生物，由一個(gè)細(xì)胞組成一個(gè)獨(dú)立的生物個(gè)體。它可以在特定的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，完全可以控制其化學(xué)和物理環(huán)境；酵母的生命周期也很適合用來(lái)作遺傳分析，很容易構(gòu)建16條染色體單倍型物理圖譜；

基因組為15Mb。將所有的酵母基因同GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的哺乳動(dòng)物基因進(jìn)行比較(不包括EST順序)，發(fā)現(xiàn)有將近31％編碼蛋白質(zhì)的酵母基因或者開(kāi)放閱讀框架與哺乳動(dòng)物編碼蛋白質(zhì)的基因有高度的同源性。經(jīng)對(duì)170多個(gè)克隆的人類基因，分析發(fā)現(xiàn)有42%與酵母基因具有明顯的同源性，這些人類基因的編碼產(chǎn)物大部分與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、膜運(yùn)輸或者DNA合成與修復(fù)有關(guān)，而那些與酵母基因沒(méi)有明顯同源性的人類基因主要編碼一些膜受體、血液或免疫系統(tǒng)組分，或人類特殊代謝途徑中某些重要的酶和蛋白質(zhì)。4、果蠅(Drosophilamelanogaster)：

果蠅是經(jīng)典遺傳學(xué)家喜歡的實(shí)驗(yàn)材料，摩爾根就是根據(jù)果蠅實(shí)驗(yàn)而發(fā)現(xiàn)“連鎖交換”規(guī)律的。

它不僅飼養(yǎng)容易、繁殖快，還是典型的“雌雄異體”生物，雌雄容易識(shí)別。有趣的是，果蠅幼蟲(chóng)的唾液腺的染色體很大，大到人的肉眼就可以看到，上面還有規(guī)律的條紋，可以把一個(gè)基因的位點(diǎn)定到某一條條紋上。果蠅作為遺傳研究的模型生物，已有80年的歷史，它的DNA序列，同它的形態(tài)、生理以及行為復(fù)雜性等方面，是最貼近人類的可供研究的無(wú)脊椎生物體。1998年，Celera公司開(kāi)始對(duì)果蠅基因組進(jìn)行研究，用了不到兩年的時(shí)間破譯了果蠅的序列，并于2000年3月宣布了基因組全序列為180Mb。有13，601基因。果蠅基因組的完成使人們確信“全基因組鳥(niǎo)槍法”(Wholegenomeshotgun)和“片斷處理法”的結(jié)合將成為解譯大基因組最有效的方法。

5、擬南芥(Arabidopsisthaliana)：

是一種典型的開(kāi)花植物，廣泛分布于歐洲、亞洲和北美，它具有（1）生長(zhǎng)周期短。從發(fā)芽到種子成熟僅需6周。（2）體型小，占地少。成熟植株15-20cm高，蓮座葉不超過(guò)5cm。（3）后代多。每株可產(chǎn)生5000粒種子。（4）核基因組小，僅10條染色體。它作為植物模式生物在基因組分析方面是其它植物如玉米、番茄、豌豆、水稻等遺傳模式系統(tǒng)所不能及的。1996年擬南芥基因組國(guó)際合作項(xiàng)目啟動(dòng)，至2000年12月，第一個(gè)植物基因組--擬南芥基因組被全部測(cè)序，遺傳圖譜、物理圖譜建立，序列大小為125Mb?；蚪M測(cè)序區(qū)段覆蓋了全基因組的115.4Mb，分析共含有25，498個(gè)基因，編碼蛋白來(lái)自11，000個(gè)家族。

6、小鼠（musmusculus

）：

小鼠在世界范圍內(nèi)替人受辜，作為人的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，不知道已為人類貢獻(xiàn)了多少它們的同胞生命！與其它模式生物比較，它是人類的近緣親戚的哺乳動(dòng)物，只有幾億年的進(jìn)化距離，基因組與人類的差不多，大小為3000Mb，基因的數(shù)目與人的也差不多，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的人類基因，小鼠不僅都有，而且都很相似。因此小鼠是人類基因組研究主要模式生物。在HGP進(jìn)行得如火如荼的同時(shí)，小鼠基因組被推薦為優(yōu)先研究的哺乳動(dòng)物。1998年春天，NIH召集各方面的科學(xué)家，探討小鼠基因組研究行動(dòng)計(jì)劃，同年秋天行動(dòng)計(jì)劃被確認(rèn)和發(fā)表，擬定于2003年完成小鼠基因組工作圖（Workingdraft），目前已取得了較大的進(jìn)展五、比較基因組學(xué)研究

在開(kāi)展人類基因組計(jì)劃的同時(shí)，開(kāi)展模式生物基因組計(jì)劃，其目的在于利用模式生物基因組與人類基因組之間編碼順序和組織結(jié)構(gòu)上的同源性，用單一或簡(jiǎn)單的生物模式闡明高等生物特別是人的基因組在結(jié)構(gòu)以及物種進(jìn)化的內(nèi)在聯(lián)系，目前已從模式生物之間以及人類之間發(fā)現(xiàn)了一些共性特征以及各自的獨(dú)特性。

1、模式生物基因組一般都比較小，但編碼基因的比例較高，重復(fù)序列和非編碼序列較少，是一些“壓縮”的基因組

在酵母中幾乎70%的序列是編碼蛋白的ORF，酵母基因組中每2Kb可以找到一個(gè)ORF；在線蟲(chóng)中每6Kb有一個(gè)蛋白編碼序列；在人類基因組中在30Kb或更大的區(qū)域，才能找到一個(gè)ORF，大部分是高度重復(fù)的非編碼序列。這就是人的基因組特別龐大，但它的編碼蛋白基因特別少的緣故。

2、模式生物基因組中G+C%含量高,同時(shí)CpG島的比例也比較高。

河豚魚(yú)（Fugurubripes）的G+C%含量是脊椎動(dòng)物中最高的，而人類僅為40.3%，這可能是低等生物中編碼序列的比例比較高；另一個(gè)原因與模式生物的密碼子第三位堿基選擇有關(guān)。這種現(xiàn)象與物種進(jìn)化關(guān)系一致，反映了進(jìn)化的程序。

3、在模式生物特別在人的基因組中發(fā)現(xiàn)了重復(fù)（Duplication）

同時(shí)存在兩個(gè)或兩個(gè)以上的序列結(jié)構(gòu)一致或十分相似的編碼蛋白的DNA序列。酵母基因組全序列測(cè)序結(jié)果表明，在進(jìn)化的某些時(shí)刻發(fā)生了重復(fù)，在酵母著絲粒周圍和染色體臂的中央可以看到這種重復(fù)；在多細(xì)胞生物的基因組中，這種重復(fù)更為明顯。在嗜血桿菌、釀酒酵母、果蠅、秀麗線蟲(chóng)和擬南芥中，這種重復(fù)分別占11.2%、28.6%、27.5%、44.8%和65.0%。小鼠和人的比例則更高。4、在各種不同的物種中，大多數(shù)的重要生物功能是由相當(dāng)數(shù)量的同源序列基因（Orthologous）蛋白承擔(dān)

這種蛋白就是一些在不同物種中有共同祖先的蛋白質(zhì)。在不同物種中這些蛋白的結(jié)構(gòu)和數(shù)量是十分相似或接近的，它們的作用是在生物體中執(zhí)行中介代謝、DNA、RNA代謝、蛋白質(zhì)折疊、運(yùn)輸和降解等功能。研究表明，人類蛋白質(zhì)有６１％與果蠅同源，４３％與線蟲(chóng)同源，４６％與酵母同源。人類１７號(hào)染色體上的全部基因幾乎都可以在小鼠１１號(hào)染色體上找到。在多細(xì)胞生物體中，隨著功能的需要就會(huì)出現(xiàn)許多蛋白以執(zhí)行其復(fù)雜功能，但維持最基本生命活動(dòng)的蛋白是保守的。

5、同線（Synteny）連鎖的同源基因在