豬屎豆種子超低溫保存技術(shù)規(guī)程

T/CSMAXXXX－2018豬屎豆種子超低溫保存技術(shù)規(guī)程范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬屎豆（CrotalariapallidaAit.）種子超低溫保存過程中的術(shù)語和定義、保存種子的選擇、種子前處理、種子保存的量、種子冷凍方式、恢復(fù)培養(yǎng)等技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬屎豆種子的超低溫長期貯藏。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T3543.4農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程發(fā)芽試驗(yàn)GB/T3543.6農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程水分測定GB/T3543.7農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程其他項(xiàng)目檢驗(yàn)術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。豬屎豆CrotalariapallidaAit.為豆科（Leguminosae）豬屎豆屬（CrotalariaLinn.）多年生草本或直立矮小灌木，全草和根可供藥用，具有散結(jié)、清濕熱等作用，現(xiàn)代臨床試用于抗腫瘤效果較好，主要對鱗狀上皮癌，基底細(xì)胞癌有療效。收載于《全國中草藥匯編（卷二）（2014）》。豬屎豆果實(shí)CrotalariapallidaAit.fruits果實(shí)為莢果，其莢果長圓形，幼時被毛，成熟后脫落，果瓣開裂后扭轉(zhuǎn)，內(nèi)有種子20~30顆。豬屎豆種子Crotalaria

pallida

Ait.seeds豬屎豆的播種材料為完整種子，貯藏特性判斷為頑拗性種子。種子棕紅色或紫黑色，腎形或馬蹄形。種子超低溫保存seedofcryopreservation指將經(jīng)過前處理的豬屎豆種子置于液氮（-196℃）中保存。保存種子的選擇果實(shí)采收9月至12月，果莢顏色由灰綠色變?yōu)樽厣蚝谧厣珪r，即可采收，去除果莢，取出種子。種子的選擇挑選發(fā)育飽滿、均勻、健康的種子，置于10℃冰箱中保存?zhèn)溆茫ù娣艜r間不超過3個月）。種子前處理活力檢測豬屎豆種子活力以種子發(fā)芽率為判別標(biāo)準(zhǔn)。參照《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》的規(guī)定，計(jì)算出種子的發(fā)芽率＝種子發(fā)芽數(shù)／實(shí)驗(yàn)種子數(shù)×100％。待保存的豬屎豆種子活力應(yīng)≥65%。含水量范圍用尼龍網(wǎng)袋包裹豬屎豆種子，置于盛有變色硅膠的干燥器內(nèi)，硅膠與種子的體積比為180000:1，室溫條件下干燥處理2~10h，在干燥過程中定期測定種子含水量，將種子含水量由15%~20%降至12%~14%。參照GB/T3543.6中的高恒溫烘干法（130℃烘干1h）測定種子含水量（W0），W0=（鮮重-絕干重）/鮮重×100%。種子保存量豬屎豆種子保存量不少于500粒，以便后期的活力檢測使用。種子冷凍方式豬屎豆種子超低溫保存的冷凍方式為分步冷凍法，即將裝有種子和玻璃化保護(hù)溶液（PVS2）的1mL凍存管（每管60粒種子）置于4℃冰箱中0.5h，取出立即放入-20℃冰柜中1h，之后迅速投入液氮中保存?；謴?fù)培養(yǎng)種子解凍處理液氮中至少凍存24h后，取出1個凍存管，立即放入40℃水浴中快速解凍3min，而后用洗滌液（DS）浸泡3次，每次5min，并用純凈水沖洗干凈。凍后種子活力檢測取出30粒解凍后的種子，參照5.1~5.2生活力檢測方法，進(jìn)行超低溫保存后的初始活力檢測。當(dāng)種子生活力≥60%時視為保存成功。恢復(fù)培養(yǎng)將剩下30粒解凍后的豬屎豆種子，播種到帶有無菌濾紙的發(fā)芽盒中，溫度28℃～30℃，濕度70～85%條件下培養(yǎng)。豬屎豆種子出芽周期大概3～10d。附錄[1]種子發(fā)芽測試方法豬屎豆種子硬實(shí)率較高，不能直接播種。發(fā)芽測試前應(yīng)用75℃的恒溫水浴箱中熱水浸泡種子5min，取一定量的種子放入25mL試管中，加水淹過種子，加熱過程中同時用玻璃棒不段攪動。5min后取出試管，自然冷卻至室溫后取出種子，置于帶有無菌濾紙的發(fā)芽盒中，溫度25℃~28℃，濕度70%~85%條件下培養(yǎng)。各測試4個重復(fù)，每重復(fù)30粒種子。[2]玻璃化溶液（PVS2）的配制及保存方法精密量取甘油23.8mL、乙二醇13.6mL、二甲亞砜13.6mL，稱取蔗糖13.7g，溶于MS溶液中，調(diào)pH至5.8后定容至100mL，高溫高壓滅菌，4℃冷藏。注意：配置時需戴手套，并在通風(fēng)廚內(nèi)操作。[3]洗滌液（DS）的配制及保存方法精密稱取蔗糖41.1g溶于MS溶液中，調(diào)pH至5.8后定容至100mL，高溫高壓滅菌，4℃冷藏。參考文獻(xiàn)[1]中國植物志委員會.《中國植物志》第42（2）卷[M].科學(xué)出版社.2004（1998）:349[2]XuLangran.ChenDezhao.ZhuXiangyunetal.Fabaceae（Leguminosae）[M]//FloraOfChinaBeijing:SciencePress/St.Louis:MissouriBotanicalGardenPress.2010.10:121-130.[3]王國強(qiáng)等.全國中草藥匯編（卷二）[M].XX，人民衛(wèi)生出版社，2014：946[4]傅家