分子熒光法測定維生素B2的含量Word版

整理為word格式整理為word格式整理為word格式【實驗項目】分子熒光法定量測定維生素B2的含量【實驗目的】掌握標準曲線法定量分析維生素B2的基本原理。了解熒光分光光度計的基本原理、結(jié)構及性能，掌握其基本操作?！緦嶒炘怼繜晒馐枪庵掳l(fā)光。任何熒光物質(zhì)都具有激發(fā)光譜和發(fā)射光譜,發(fā)射波長總是大于激發(fā)波長。熒光激發(fā)光譜是通過測定熒光體的發(fā)光通量隨波長變化而獲得的光譜，反映不同波長激發(fā)光引起熒光的相對效率。熒光發(fā)射光譜是當熒光物質(zhì)在固定的激發(fā)光源照射后所產(chǎn)生的分子熒光，是熒光強度對發(fā)射波長的關系曲線，表示在所發(fā)射的熒光中各種波長相對強度。由于各種不同的熒光物質(zhì)有它們各自特定的熒光發(fā)射波長，可用它來鑒定熒光物質(zhì)。有些發(fā)熒光的物質(zhì)其熒光強度與物質(zhì)的濃度成正比，故可用熒光分光光度法測定其含量。維生素B2溶液在430~440nm藍光的照射下，發(fā)出綠色熒光，熒光峰在535nm附近。維生素B2在pH＝6~7的溶液中熒光強度最大，而且其熒光強度與維生素B2溶液濃度呈線性關系，因此可以用熒光光譜法測維生素B2的含量。維生素B2在堿性溶液中經(jīng)光線照射會發(fā)生分解而轉(zhuǎn)化為另一物質(zhì)——光黃素，光黃素也是一個能發(fā)熒光的物質(zhì)，其熒光比維生素B2的熒光強得多，故測維生素B2的熒光時溶液要控制在酸性范圍內(nèi)，且在避光條件下進行。在稀溶液中，熒光強度F與物質(zhì)的濃度c有以下關系：F＝2.303ФI0εbc當實驗條件一定時，熒光強度與熒光物質(zhì)的濃度呈線性關系：F=Kc【儀器與試劑】儀器：熒光分光光度計（型號：F2500HITA[H]）；1cm石英比色皿；50mL容量瓶整理為word格式整理為word格式整理為word格式試劑：維生素B2標準溶液（10.0μg/mL）（已加乙酸）【實驗內(nèi)容與步驟】1.系列標準溶液和待測溶液的配制取維生素B2（10.0μg/mL）標準溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL分別置于50mL的容量瓶中，標定，搖勻。取2.00mL待測溶液于50mL的容量瓶中，標定，搖勻。2.激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜的繪制（用3.00mLd的標準溶液）設置λEm=520nm為發(fā)射波長，在250~400范圍內(nèi)掃描，記錄發(fā)射波長強度和激發(fā)波長的關系曲線，便得到激發(fā)光譜。記錄最大激發(fā)波長設置λEx為最大激發(fā)波長即371nm，在400~600nm范圍內(nèi)掃描，記錄發(fā)射強度與發(fā)射波長間的函數(shù)關系，便得到熒光發(fā)射光譜從熒光發(fā)射光譜上找出其最大的發(fā)射波長λEm和熒光強度。標準溶液及樣品的熒光測定將激發(fā)波長固定在371nm，熒光發(fā)射波長為521nm，測量上述系列標準溶液的熒光發(fā)射強度，按濃度從從低到高測定。在同樣條件下測定未知溶液的熒光強度，并由標準曲線確定未知試樣中維生素B2的濃度。【實驗數(shù)據(jù)】1.激發(fā)波長λEx=371nm熒光發(fā)射波長λEm=521nm2.標準溶液劑待測溶液的濃度和熒光強度記錄維生素B2溶液濃度（μg/mL）0.20.40.60.81.0待測溶液相對熒光強度26.7051.7675.3598．81121.050.38可得待測溶液的濃度為0.393μg/mL.整理為word格式整理為word格式整理為word格式【實驗圖像】1.以λEm=520為發(fā)射波長，溶液濃度為0.6μg/mL，在250~400nm范圍掃描得到的熒光強度和激發(fā)波長的關系曲線設置激發(fā)波長為371nm，溶液濃度為0.6μg/mL，在400~600nm范圍內(nèi)掃描，所得發(fā)射強度與發(fā)射波長間的熒光發(fā)射光譜如下：整理為word格式整理為word格式整理為word格式3.以激發(fā)波長λEx=371nm熒光發(fā)射波長λEm=521nm，測量系列標準溶液濃度，以標準溶液的熒光發(fā)射強度為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標，制作標準曲線如下：【結(jié)果分析與討論】1.石英皿是四面透光的，拿的時候不能接觸到四個透光面，只能拿上下角部，擦外壁殘留液時由于擦鏡紙不吸水，故可先用吸水紙巾擦干，再用擦鏡紙擦。整理為word格式整理為word格式整理為word格式2.本次實驗所得到的R值為0.99977，而理論R值為1，相關度很接近，說明準確度比較高，溶液配制比較準確。3.配制好的溶液應盡快測量，避免久置成分變化而影響結(jié)果。4.干擾熒光分光分光度法的因素：(1)溶劑：同一熒光物質(zhì)在不同的溶劑中可能表現(xiàn)出不同的熒光性質(zhì)。溶劑的極性增強，對激發(fā)態(tài)會產(chǎn)生更大的穩(wěn)定作用，結(jié)果使物質(zhì)的熒光波長紅移，熒光強度增大。(2)溫度：升高溫度會使非輻射躍遷概率增大，熒光效率降低。(3)PH：大多數(shù)含有酸性或堿性取代基團的芳香族化合物的熒光性質(zhì)受PH的影響很大。(4)溶液表面活性劑的存在，減少非輻射躍遷的概率，提高了熒光效率。(5)溶液中溶解氧的存在，由于氧分子的順磁性質(zhì)，使激發(fā)單重態(tài)分子向三重態(tài)的體系間竄躍速率加大，因而會使熒光效率降低。【思考題】1、試解釋熒光光度法較吸收光度法靈敏度高的原因？答：原因是由于現(xiàn)代電子技術具有檢測十分微弱光信號的能力，并且熒光強度與激發(fā)光強度成正比，提高激發(fā)光強度也可以增大熒光強度，使測定的靈敏度提高；而吸收光度法測定的是吸光度，不管是增大入射光強度，還是提高檢測器的靈敏度，都會使透射光信號與入射光信號以同樣的比例增大，吸光度值不會改變，因此靈敏度不能提高。2、維生素B2在pH=6~7時熒光最強，本實驗為何在酸性溶液中測定？整理為word格式整理為word格式整理為w