微生物的遺傳變異與育種課件

第十章微生物的遺傳變異與育種

第一節(jié)

遺傳物質(zhì)的物質(zhì)基礎(chǔ)第十章微生物的遺傳變異與育種

第一節(jié)遺傳物質(zhì)的物1遺傳(heredity)：親代生物傳遞給子代一套實現(xiàn)與其相同形狀的遺傳信息。

特點：具穩(wěn)定性。遺傳型（genotype）：又稱基因型，指某一生物個體所含有的全部基因的總和是一種內(nèi)在可能性或潛力。

遺傳(heredity)：2變異(variation):

生物體在外因或內(nèi)因的作用下，遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或數(shù)量發(fā)生改變而導(dǎo)致表型改變。變異的特點：a。群體一般為10-6～10-10；b.形狀變化的幅度大；c.變化后形成的新性狀是穩(wěn)定遺傳的。

變異(variation):3表型（phenotype）：指生物體所具有的一切外表特征和內(nèi)在特性的總和;

是具一定遺傳型的生物在一定條件下所表現(xiàn)出的具體性狀。遺傳型+環(huán)境條件

表型

。

表型（phenotype）：4

飾變（modification）：指不涉及遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變而只發(fā)生在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯水平上的表型變化。特點：a.幾乎整個群體中的每一個個體都發(fā)生同樣的變化；b.性狀變化的幅度?。籧.因遺傳物質(zhì)不變，故飾變是不遺傳的。引起飾變的因素消失后，表型即可恢復(fù)。

5一、3個經(jīng)典實驗（一）經(jīng)典轉(zhuǎn)化實驗（二）噬菌體感染實驗（三）植物病毒重建實驗一、3個經(jīng)典實驗（一）經(jīng)典轉(zhuǎn)化實驗6（一）經(jīng)典轉(zhuǎn)化實驗1928年F.Griffith肺炎鏈球菌使小鼠患敗血癥死亡S型菌株---菌株形成莢膜、菌落表面光滑、致病R型菌株---菌株不形成莢膜、菌落表面粗糙、不致病

（一）經(jīng)典轉(zhuǎn)化實驗1928年F.Griffith肺炎鏈球7微生物的遺傳變異與育種課件8平板培養(yǎng)實驗

熱死S菌——不生長

活R菌—長出RII菌

熱死S菌+活R菌—長出大量R菌和10-菌

平板培養(yǎng)實驗熱死S菌——不生長

活R菌—長出RI9活R菌+S菌無細(xì)胞抽提液——長出大量R菌和少量S菌

活R菌+S菌無細(xì)胞抽提液101944年O.T.Avery活R菌+①加S菌DNA②加S菌DNA及DNA酶以外的酶③加S菌的DNA和DNA酶④加S菌的RNA⑤加S菌的蛋白質(zhì)⑥加S菌的莢膜多糖

長出S菌只長R菌1944年O.T.Avery活R菌+長出S菌只長R菌1110分鐘后用搗碎器使空殼脫離吸附離心沉淀細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)后，可產(chǎn)生大量完整的子代噬菌體（二）噬菌體感染實驗含32P-DNA的一組：放射性85%在沉淀中10分鐘后吸附離心沉淀細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)后，可產(chǎn)生大量完整的子12微生物的遺傳變異與育種課件13

（三）植物病毒的重建實驗（三）植物病毒的重建實驗14微生物的遺傳變異與育種課件15二、遺傳物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的存在部位和方式（一）核酸存在的七個水平及質(zhì)粒細(xì)胞水平：存在于細(xì)胞核或核質(zhì)體，單核或多核細(xì)胞核水平:原與真核生物的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)不同，核外DNA染色體水平:倍性(真核)和染色體數(shù)核酸水平：在原核中同染色體水平、存在部分二倍體 DNA或RNA，復(fù)合或裸露，雙鏈或單鏈基因水平：具自主復(fù)制能力的遺傳功能單位，長度與信息量，轉(zhuǎn)錄——翻譯密碼子水平： 信息單位,起始和終止,核苷酸水平： 突變或交換單位，四種堿基二、遺傳物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的存在部位和方式（一）核酸存在的七個水平16DNA的三種存在形式

DNA的三種存在形式17第二節(jié)

基因突變和誘變育種一、基因突變第二節(jié)基因突變和誘變育種一、基因突變18一、基因突變突變：指生物體的表型發(fā)生的可遺傳的變化。狹義突變：基因突變—點突變廣義突變：基因突變和染色體畸變突變的幾率：10-6---10-9

野生菌株------突變-------突變株一、基因突變突變：指生物體的表型發(fā)生的可遺傳的變化。19（一）基因突變類型（表型分類）營養(yǎng)缺陷型（株）抗性突變型（株）條件致死突變（株）形態(tài)突變型（株）抗原突變型（株）產(chǎn)量突變型（株）（一）基因突變類型（表型分類）營養(yǎng)缺陷型（株）形態(tài)突變型（20營養(yǎng)缺陷型——因突變而喪失合成某種物質(zhì)的能力，因此必須在培養(yǎng)基中添加某種物質(zhì)才能生長的突變類型?？剐酝蛔冃汀蛲蛔兌a(chǎn)生了對某種化學(xué)藥物或致死物理因子的抗性的突變株。

營養(yǎng)缺陷型——因突變而喪失合成某種物質(zhì)的能力，因此必須在培養(yǎng)21條件致死突變型——突變后在某種條件下可正常生長繁殖，而在另一條件下卻無法生長繁殖的突變型

抗原突變型——因突變而引起的抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生改變條件致死突變型——突變后在某種條件下可正常生長繁殖，而在另一22（二）突變率每一細(xì)胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率。突變率為10–8是指該細(xì)胞在一億次細(xì)胞分裂中，會發(fā)生一次突變。突變率也可以用每一單位群體在每一世代中產(chǎn)生突變株（mutant，即突變型）的數(shù)目來表示。突變率=突變細(xì)胞數(shù)/分裂前群體細(xì)胞數(shù)

（二）突變率每一細(xì)胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率。23突變是獨立的。某一基因發(fā)生突變不會影響其它基因的突變率。突變是獨立的。某一基因發(fā)生突變不會影響其它基因的突變率。24（三）基因突變的特點以細(xì)菌的抗藥性為例。不對應(yīng)性：突變的性狀與突變原因之間無直接的對應(yīng)關(guān)系。自發(fā)性：突變可以在沒有人為誘變因素處理下自發(fā)地產(chǎn)生。稀有性：突變率低且穩(wěn)定。

（三）基因突變的特點以細(xì)菌的抗藥性為例。25（三）基因突變的特點獨立性：各種突變獨立發(fā)生，不會互相影響?？烧T發(fā)性：誘變劑可提高突變率。穩(wěn)定性：變異性狀穩(wěn)定可遺傳。（三）基因突變的特點獨立性：各種突變獨立發(fā)生，不會互26（三）基因突變的特點可逆性：從原始的野生型基因到變異株的突變稱為正向突變，從突變株回到野生型的過程則稱為回復(fù)突變

（三）基因突變的特點可逆性：從原始的野生型基因到變異株的突變27（四）基因突變的自發(fā)性和不對應(yīng)性變量試驗又稱波動試驗或彷徨試驗。1943年，S.E.Luria和M.Delbrück根據(jù)統(tǒng)計學(xué)原理，設(shè)計了的實驗。大腸桿菌大腸桿菌的T1噬菌體（烈性噬菌體）觀察統(tǒng)計抗噬菌體的抗性菌株數(shù)量

（四）基因突變的自發(fā)性和不對應(yīng)性變量試驗又稱波動試驗或彷徨試28微生物的遺傳變異與育種課件29微生物的遺傳變異與育種課件302、涂布實驗原理與變量試驗相同，方法更為簡便，且可計算突變率。

2、涂布實驗原理與變量試驗相同，方法更為簡便，且可計算突變率31（五）基因突變劑機(jī)制自發(fā)突變誘發(fā)突變（五）基因突變劑機(jī)制自發(fā)突變32微生物的遺傳變異與育種課件331、

染色體數(shù)目的變化

n----2n-----3n-----4n整倍變化n----n+1、n-1，2n---2n+1、2n-1、2n-2非整倍變化原核生物只有一條染色體，但可成為部分二倍體。

1、

染色體數(shù)目的變化n----2n-----3n---342、

染色體結(jié)構(gòu)的變化

染色體結(jié)構(gòu)的變化也稱為染色體畸變，包括：缺失、重復(fù)、倒位、易位、轉(zhuǎn)座。一般認(rèn)為這是由于染色體單體發(fā)生斷裂后，錯誤性愈合而造成的。

可造成隱性基因的表達(dá)、顯形基因的拷貝數(shù)增多、某一性狀的缺失、基因間連鎖程度的變化、不同染色體基因的連鎖等變化。2、

染色體結(jié)構(gòu)的變化

染色體結(jié)構(gòu)的變化也稱為染色體畸35重復(fù)、缺失、倒位、易位重復(fù)、缺失、倒位、易位36轉(zhuǎn)座因子（可移動基因、跳躍基因）插入序列IS轉(zhuǎn)座子Tn轉(zhuǎn)座噬菌體Mn轉(zhuǎn)座頻率：10-5—10-7

轉(zhuǎn)座因子---復(fù)制---非同源重組正向重復(fù)序列-----轉(zhuǎn)座酶基因-----反向重復(fù)序列

轉(zhuǎn)座因子（可移動基因、跳躍基因）插入序列IS373、基因突變（點突變）的誘變機(jī)制誘變劑（mutagen）：凡能提高突變率的任何理化因子，就稱為誘變劑種類：誘變劑的種類很多代表性的誘變劑的作用機(jī)制。

3、基因突變（點突變）的誘變機(jī)制誘變劑（mutagen）：凡38（1）堿基置換（substitution）一對堿基被另一對堿基所置換。轉(zhuǎn)換（transition），即DNA鏈中的一個嘌呤被另一個嘌呤或是一個嘧啶被另一個嘧啶所置換；顛換（transversion），即一個嘌呤被一個嘧啶,或是一個嘧啶被一個嘌呤所置換。

（1）堿基置換（substitution）一對堿基被另一對堿39堿基的置換（實線代表轉(zhuǎn)換；虛線代表顛換）

堿基的置換（實線代表轉(zhuǎn)換；虛線代表顛換）40堿基置換后會出現(xiàn)下列幾種情況(1)

錯義突變

一種氨基酸，變成另一種氨基酸；(2)

無義突變

氨基酸的堿基置換后變成UAG（琥珀突變）、UAA（赫石突變）UGA（乳石突變）等終止密碼子；

堿基置換后會出現(xiàn)下列幾種情況(1)

錯義突變一種氨41配對原則

嘌呤

------嘧啶

6位上是氨基的嘌呤------4位上是酮基的嘧啶

6位上是酮基的嘌呤------4位上是氨基的嘧啶

配對原則42*烷化劑(alkylatingagent)帶有一個或多個活性烷基，誘變作用是其與DNA中的堿基或磷酸作用。常見的烷化劑有硫酸二乙酯（EDS）、甲基磺酸乙酯（EMS）、N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍（NTG）、亞硝基甲基脲(NMU)、氮芥、乙烯亞胺和環(huán)氧乙酸等。*烷化劑(alkylatingagent)帶有一個或多43B間接引起置換的誘變劑這類誘變劑主要是一些堿基類似物

這些化合物有5-溴尿嘧啶（5-BU），5-氟尿嘧啶(5-FU)、8-氮鳥嘌呤(8-NG)和2-氨基嘌呤（2-AP）等。它們與正常堿基的結(jié)構(gòu)類似，在DNA復(fù)制時，它們可以被錯誤地?fù)饺隓NA，引起誘變效應(yīng)，所以說它們引起堿基置換的作用是間接的。

B間接引起置換的誘變劑這類誘變劑主要是一些堿基類似物44（2）移碼突變移碼突變是指由一種誘變劑引起DNA分子中的一個或少數(shù)幾個核苷酸的插入或缺失，從而使該部位后面的全部遺傳密碼發(fā)生轉(zhuǎn)錄和翻譯錯誤的一類突變。

（2）移碼突變移碼突變是指由一種誘變劑引起DNA分子中的一個45移碼突變誘變劑

吖啶類染料（原黃素、吖啶黃、吖啶橙等）和一系列稱為ICR類的化合物（美國的腫瘤研究所合成而得名），都是移碼突變的有效誘變劑

移碼突變誘變劑

吖啶類染料（原黃素、吖啶黃、吖啶橙等）464、自發(fā)突變的機(jī)理大多數(shù)自發(fā)突變本質(zhì)上也是誘發(fā)的，只不過它不是人為的，而是自然環(huán)境或細(xì)胞內(nèi)環(huán)境誘發(fā)的。細(xì)胞外因素、細(xì)胞內(nèi)因素DNA分子內(nèi)部因素

4、自發(fā)突變的機(jī)理大多數(shù)自發(fā)突變本質(zhì)上也是誘發(fā)的，只不過它不47（1）細(xì)胞外的誘發(fā)因素

自然環(huán)境或人工條件下的物理和化學(xué)因素自然環(huán)境中，宇宙間的短波輻射、宇宙線和紫外線等，多因素低劑量長期輻射的綜合效應(yīng)，將會引起生物的自發(fā)突變。自然環(huán)境中存在低劑量的金屬離子、高分子化合物、生物堿藥物、染料等都能成為引起生物突變的化學(xué)因素

（1）細(xì)胞外的誘發(fā)因素自然環(huán)境或人工條件下的物理和化學(xué)因素48（2）細(xì)胞內(nèi)的誘發(fā)因素

細(xì)胞的代謝活動會產(chǎn)生一些誘變物質(zhì)，如過氧化氫、咖啡堿和重氮絲氨酸等，它們是引起自發(fā)突變的內(nèi)源誘變劑。許多微生物的陳舊培養(yǎng)物中易出現(xiàn)自發(fā)突變株，可能就是這類原因。

（2）細(xì)胞內(nèi)的誘發(fā)因素細(xì)胞的代謝活動會產(chǎn)生一些誘變物質(zhì)，如49（3）

DNA分子內(nèi)部因素

DNA分子中的堿基存在著互變異構(gòu)效應(yīng)。A、T、G、C四種堿基，存在酮基結(jié)構(gòu)（T，G）或氨基結(jié)構(gòu)（A，C），酮式與烯醇式存在互變異構(gòu)，氨基式與亞氨基式存在互變狀態(tài)（3）DNA分子內(nèi)部因素

DNA分子中的堿基存在著互變異構(gòu)50（3）

DNA分子內(nèi)部因素

一般生理條件下，堿基互變平衡反應(yīng)傾向于酮式或氨基式，DNA兩條互補(bǔ)鏈之間總是以A:T和CG堿基配對。但T偶爾也會以稀有的烯醇式形式出現(xiàn)，這樣在DNA復(fù)制到達(dá)這一位置的瞬間，新合成鏈中T對應(yīng)的不再是A，而是G；（3）DNA分子內(nèi)部因素

一般生理條件下，堿基互變平衡反應(yīng)51（3）

DNA分子內(nèi)部因素

同理，若堿基C以稀有的亞氨基形式出現(xiàn)，在DNA復(fù)制到達(dá)這一位置的瞬間，則它對應(yīng)的不是G據(jù)統(tǒng)計，堿基對發(fā)生自發(fā)突變的幾率約為10–8~10–9。

（3）DNA分子內(nèi)部因素

同理，若堿基C以稀有的亞氨基形式52微生物的遺傳變異與育種課件53環(huán)出效應(yīng)環(huán)狀突出效應(yīng)。有人提出，在DNA的復(fù)制過程中，如果其中某一單鏈上偶然產(chǎn)生一個小環(huán)，則會因其上的基因越過復(fù)制而發(fā)生遺傳缺失環(huán)出效應(yīng)環(huán)狀突出效應(yīng)。有人提出，在DNA的復(fù)制過程中，如果其54（六）紫外線對DNA的損傷及其修復(fù)嘧啶對紫外線的敏感性要比嘌呤強(qiáng)得多。嘧啶的光化產(chǎn)物主要是二聚體和水合物。其中了解較清楚的是胸腺嘧啶二聚體的形成和消除。紫外線的主要作用是使同鏈DNA的相鄰嘧啶間形成共價結(jié)合的胸腺嘧啶二聚體。（六）紫外線對DNA的損傷及其修復(fù)嘧啶對紫外線的敏感性要比嘌551、光復(fù)活作用（photoreactivation）經(jīng)紫外線照射后的微生物立即暴露于可見光下時，可明顯降低其死亡率的現(xiàn)象，稱為光復(fù)活作用。對照：8×106個/mlE.coliU.V.100個/ml試驗：8×106個/mlE.coliU.V.360~490nm2×106個/mlE.coli

可見光，30分

1、光復(fù)活作用（photoreactivation）經(jīng)紫外線561、光復(fù)活作用（photoreactivation）經(jīng)紫外線照射后形成的帶有胸腺嘧啶二聚體的DNA分子，在黑暗下會被一種光激活酶即光裂合酶（photolyase）結(jié)合，當(dāng)形成的復(fù)合物暴露在可見光（300~500nm）下時，此酶會因獲得光能而發(fā)生解離，從而使二聚體重新分解成單體。光激活酶也從復(fù)合物中釋放出來。每一E.coli細(xì)胞中約含有25個光激活酶分子。1、光復(fù)活作用（photoreactivation）經(jīng)紫外線571、光復(fù)活作用（photoreactivation）

由于一般的微生物中都存在著光復(fù)活作用，所以進(jìn)行紫外線誘變育種時，只能在紅光下照射及處理照射后的菌液。

1、光復(fù)活作用（photoreactivation）58微生物的遺傳變異與育種課件592、暗修復(fù)作用（darkrepair）又稱切除修復(fù)（excisionrepair）。是活細(xì)胞內(nèi)一種用于修復(fù)被紫外線等誘變劑（包括烷化劑、X射線和γ射線等）損傷后的DNA的機(jī)制。這種修復(fù)作用與光無關(guān)。2、暗修復(fù)作用（darkrepair）又稱切除修復(fù)（exc60有四種酶參與①內(nèi)切核酸酶：切開

②外切核酸酶：擴(kuò)大③DNA聚合酶：復(fù)制④通過連接酶：連接

完成了修復(fù)作用。

有四種酶參與61微生物的遺傳變異與育種課件623、紫外誘變方法:設(shè)備：紫外燈、磁力攪拌器、暗室等，紫外燈：波長為253、7nm,功率是15W處理時的照射距離：20cm—30cm樣品：要直接暴露在紫外燈下，厚度不能超過3mm照射時，要用磁力攪拌器攪拌。處理劑量：常用照射時間或死亡率作為相對劑量3、紫外誘變方法:設(shè)備：紫外燈、磁力攪拌器、暗室等，63在實際應(yīng)用中，用死亡率表示照射劑量更可靠。

通常先繪制照射時間與死亡率的關(guān)系曲線，然后選擇合適的劑量。

生產(chǎn)上經(jīng)常采用的劑量：

死亡率為70%——80%左右。

在實際應(yīng)用中，用死亡率表示照射劑量更可靠。64二、突變與育種（一）自發(fā)突變與育種1、生產(chǎn)中育種10-6突變率-----尋找正向突變菌株2、定向培育優(yōu)良菌種牛型結(jié)核桿菌------13年----230代----卡介苗（減毒活菌疫苗）二、突變與育種（一）自發(fā)突變與育種65（二）誘變育種

誘變+篩選誘變是隨機(jī)的；篩選是定向的目前發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)菌株都是經(jīng)過突變改造過的。（二）誘變育種誘變+篩選661、誘變育種的基本規(guī)律1、誘變育種的基本規(guī)律672、誘變育種中的幾個原則

誘變劑的選擇

1誘變劑作用的普遍性：選擇那些在其它菌種選育中誘變效果好的誘變劑。如：UV，亞硝基胍（NTG），快中子等。2．誘變劑的特異性：經(jīng)驗之談。

如，四環(huán)素族抗生素用亞硝酸、羥胺，

青霉素用氮芥、乙烯亞胺、亞硝基胍．2、誘變育種中的幾個原則

誘變劑的選擇1誘變劑作用的普683*菌株的差異：（即使是同一菌）A：遺傳性不穩(wěn)定的菌株------用緩和誘變劑

B：遺傳性穩(wěn)定的菌株---------首用強(qiáng)，后用緩。*考慮誘變機(jī)制：UV嘧啶，

亞硝酸

嘌呤，因此復(fù)合用為好

3*菌株的差異：（即使是同一菌）692、誘變育種中的幾個原則

誘變基本過程

2、誘變育種中的幾個原則

誘變基本過程70選擇合適的出發(fā)菌株↓制備待處理的菌懸液↓誘變處理↓篩選↓保藏和擴(kuò)大試驗選擇合適的出發(fā)菌株71出發(fā)菌株的選擇

出發(fā)菌株—用來育種處理的起始菌株

◆出發(fā)菌株應(yīng)具備

①對誘變劑的敏感性高；

②具有特定生產(chǎn)性狀的能力或潛力；

◆出發(fā)菌株的來源

①自然界直接分離到的野生型菌株：

②歷經(jīng)生產(chǎn)考驗的菌株：

③已經(jīng)歷多次育種處理的菌株：出發(fā)菌株的選擇

出發(fā)菌株—用來育種處理的起始菌株

◆出發(fā)菌72（4）.制備單細(xì)胞或單孢子懸液

要求①菌體處于對數(shù)生長期，

②細(xì)胞分散且為單細(xì)胞，

方法：①玻璃珠打散10-15min;

②加０.3%吐溫80

③用無菌脫脂棉過濾。

制備：物理誘變劑——生理鹽水

化學(xué)誘變劑——緩沖液

濃度：細(xì)菌、放線菌108個/ml

霉菌、酵母菌106個/ml（4）.制備單細(xì)胞或單孢子懸液

要求①菌體處于對數(shù)生長期73（5）誘變劑劑量的選擇用90-99%殺菌劑量用50—85%的殺菌劑量，此時正突變率高，特別是出發(fā)菌株已是高產(chǎn)菌株。

（5）誘變劑劑量的選擇用90-99%殺菌劑量74（6）誘變劑的處理方法

誘變劑使用方式

單一處理

復(fù)合處理：

誘變處理條件：溫度（生長溫度）PH（緩沖劑）

處理時間誘變作用的終止：用解毒劑、用水稀釋

（6）誘變劑的處理方法誘變劑使用方式單一處理75微生物的遺傳變異與育種課件76（7）突變株的篩選

篩選條件：基因型+環(huán)境

表型

表型遲延

充分表達(dá)分離性遲延現(xiàn)象生理性遲延現(xiàn)象

（7）突變株的篩選篩選條件：基因型+環(huán)境表型77（7）突變株的篩選

合適的篩選方法

：

平皿快速檢測法變色圈法

透明圈法

生長圈法抑菌圈法

梯度平板法搖瓶培養(yǎng)法（7）突變株的篩選合適的篩選方法：平皿快速檢測法78微生物的遺傳變異與育種課件79第一輪：一個出發(fā)菌株→→→

選出200個菌株→→→

選出50株→→→選出5株誘變處理初篩

（每瓶一株）復(fù)篩（每瓶四株）

第二輪：5個出發(fā)菌株→→→

→→

→

選出50株

→→

→選出5株40株40株40株40株40株誘變處理初篩復(fù)篩（每瓶一株）（每瓶四株）第一輪：誘變處理初篩（每瓶一株）復(fù)篩（每瓶四株）803、三類突變株的篩選產(chǎn)量突變株篩選

抗藥性突變株的篩選（梯度平板法）

營養(yǎng)缺陷型(auxotroph)的篩選

3、三類突變株的篩選產(chǎn)量突變株篩選81

產(chǎn)量突變株篩選瓊脂塊培養(yǎng)法（春日霉素）孢子懸液------誘變----適當(dāng)培養(yǎng)（表型遲延）-----

涂布平板----打孔取菌落-----瓊脂塊培養(yǎng)----4-5天—

測定瓊脂塊所含的抗生素的抑菌圈----效價高菌

產(chǎn)量突變株篩選瓊脂塊培養(yǎng)法（春日霉素）82微生物的遺傳變異與育種課件83

抗藥性突變株的篩選（梯度平板法）

抗藥性突變株的篩選（梯度平板法）84抗藥性突變株的應(yīng)用：*作為菌株的遺傳標(biāo)記*作為生產(chǎn)菌種（結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株）如“吡哆醇高產(chǎn)菌株的篩選”

抗藥性突變株的應(yīng)用：85微生物的遺傳變異與育種課件86營養(yǎng)缺陷型(auxotroph)的篩選A：有關(guān)的三類遺傳型個體：營養(yǎng)缺陷型突變株：必須在培養(yǎng)基內(nèi)加入相應(yīng)有機(jī)養(yǎng)分野生型菌株：自然界分離到的任何微生物，在其發(fā)生營養(yǎng)缺陷突變前的原始菌株，為該微生物的野生型。原養(yǎng)型菌株：指營養(yǎng)缺陷型突變菌株回復(fù)突變或重組后產(chǎn)生的菌株，與野生型的表型相同。

營養(yǎng)缺陷型(auxotroph)的篩選A：有關(guān)的三類遺傳型個87有關(guān)的三類培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基（MM）[-]：凡是能滿足野生型菌株營養(yǎng)要求的最低成分的合成培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基（CM）[+]：滿足一切營養(yǎng)缺陷型菌株生長的天然或半合成培養(yǎng)基。

補(bǔ)充培養(yǎng)基（SM）[x]：在MM中有針對性地加入一或幾種營養(yǎng)成分以滿足相應(yīng)營養(yǎng)缺陷型菌株生長的合成培養(yǎng)基。

有關(guān)的三類培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基（MM）[-]：凡是能滿足野生型菌88篩選步驟

野生型菌株C-1：誘變處理（同前講述）

C-2：淘汰野生型（濃縮缺陷型）C-3：檢出缺陷型

C-4：鑒定缺陷型篩選步驟野生型菌株89C-2：淘汰野生型（濃縮缺陷型）

誘變后，仍存在大量的野生型，不利于分離（1）抗生素法野生型菌株在MM上生長+青霉素—殺死Ｇ＋

缺陷型菌株在MM上不生長＋青霉素—-不殺死注意：使環(huán)境的滲透壓提高，避免細(xì)胞破裂?？股靥幚硗旰?，離心收集細(xì)胞，并轉(zhuǎn)入低滲溶液制霉菌素法則適合于真菌（例如：酵母、霉菌），可與真菌細(xì)胞膜上的甾醇作用，從而引起溶菌

C-2：淘汰野生型（濃縮缺陷型）誘變后，仍存在大量的野生型90微生物的遺傳變異與育種課件91（2）菌絲過濾法

適于：絲狀（放線菌、霉菌）原理：野生型基本培養(yǎng)基上發(fā)育成菌絲；缺陷型孢子不萌發(fā)可通過濾膜，野生型菌絲不能通過。

（2）菌絲過濾法92微生物的遺傳變異與育種課件93檢出缺陷型逐個檢出法影印檢出法夾層培養(yǎng)法限量補(bǔ)給法檢出缺陷型逐個檢出法94逐個檢出法

逐個檢出法95影印檢出法

影印檢出法96夾層培養(yǎng)法

夾層培養(yǎng)法97限量補(bǔ)給法

在含少量的（0.01%）蛋白胨的MM上培養(yǎng),大菌落為野生型小菌落的為缺陷型。

限量補(bǔ)給法98鑒定缺陷型生長譜法組合營養(yǎng)物法組合補(bǔ)充培養(yǎng)基法鑒定缺陷型生長譜法99生長譜法

斜面菌種-----生理鹽水洗下細(xì)胞------洗滌-----涂布（105個/皿）

生長譜法斜面菌種-----生理鹽水洗下細(xì)胞------洗滌100紙片1:氨基酸混合液;紙片2:維生素混合液;紙片3:核酸水解液;紙片4:酵母水解液

紙片1:氨基酸混合液;101組合營養(yǎng)物法：A將多種營養(yǎng)因子編組；b.將組合液的紙片放在涂菌的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)；c.結(jié)果分析；一組：1

2345

二組：26

789

三組：3710

1112

四組：48111314

五組：59121415組合營養(yǎng)物法：A將多種營養(yǎng)因子編組；102組合營養(yǎng)物法：組合營養(yǎng)物法：103組合補(bǔ)充培養(yǎng)基法如是多個缺陷型菌株，則制成各營養(yǎng)組合平板，將帶測菌株依次點接到這一組平板的對應(yīng)位置上，根據(jù)在各平板上的生長情況逐個分析各菌株的缺陷型

MM+A+B+C+A+B+A+C

組合補(bǔ)充培養(yǎng)基法如是多個缺陷型菌株，1044、

Amestest：對化學(xué)誘變劑做檢測4、Amestest：對化學(xué)誘變劑做檢測105

原理：his-在基本培養(yǎng)基上不長；而發(fā)生回復(fù)突變則長。

菌種：鼠傷寒沙門氏菌his-；

106第三節(jié)

基因重組和雜交育種一、原核生物的基因重組第三節(jié)基因重組和雜交育種一、原核生物的基因重組107原核生物的基因重組凡把兩個不同性狀個體內(nèi)的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)過遺傳分子間的重新組合，形成新遺傳型個體的方式，稱為基因重組（generecombination）或遺傳重組。作用：重組可使生物體在未發(fā)生突變的情況下，也能產(chǎn)生新遺傳型的個體。

原核生物的基因重組凡把兩個不同性狀個體內(nèi)的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起108重組與雜交的關(guān)系重組是分子水平上的一個概念，可以理解成是遺傳物質(zhì)分子水平上的雜交而一般所說的雜交（hybridization）則是細(xì)胞水平上的一個概念。雜交中必然包含著重組，而重組則不限于雜交這一形式。重組與雜交的關(guān)系重組是分子水平上的一個概念，可以理解成是遺傳109一、原核微生物的基因重組特點：片段性：僅一小段DNA單向性：共體

受體轉(zhuǎn)移機(jī)制多樣性：

轉(zhuǎn)化、

轉(zhuǎn)導(dǎo)、

接合、

原生質(zhì)體融合一、原核微生物的基因重組特點：110（一）轉(zhuǎn)化受體菌直接吸收來自供體菌的游離DNA片段，并把它整合到自己的基因組中，而獲得部分新的遺傳性狀的基因轉(zhuǎn)移過程，稱為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的的受體菌稱為轉(zhuǎn)化子（transformant）。來自供體菌的DNA片段稱為轉(zhuǎn)化因子（一）轉(zhuǎn)化受體菌直接吸收來自供體菌的游離DNA片段，并把它整1111、轉(zhuǎn)化發(fā)生的條件（1）兩個菌株間的親緣關(guān)系密切（2）受體細(xì)胞要處于感受態(tài).（3）供體DNA片段（轉(zhuǎn)化因子）大小適宜，分子量一般為1×106

D左右，15個基因

感受態(tài)：受體細(xì)胞能從環(huán)境吸取外源DNA片段并實現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)

1、轉(zhuǎn)化發(fā)生的條件（1）兩個菌株間的親緣關(guān)系密切112（4）單鏈供體DNA進(jìn)入受體菌，發(fā)生同源重組；

（在受體菌表面，一條鏈被水解）（5）DNA復(fù)制，受體細(xì)胞分裂，帶有新形狀的個體為轉(zhuǎn)化子（4）單鏈供體DNA進(jìn)入受體菌，發(fā)生同源重組；113微生物的遺傳變異與育種課件114微生物的遺傳變異與育種課件115

轉(zhuǎn)染把噬菌體或其它病毒的DNA（或RNA）抽提出來，讓它去感染感受態(tài)的宿主細(xì)胞，并進(jìn)而產(chǎn)生正常的噬菌體或病毒的后代，這種現(xiàn)象稱為轉(zhuǎn)染（transfection）。

轉(zhuǎn)染把噬菌體或其它病毒的DNA（或RNA）抽提出來，讓它去116（二）轉(zhuǎn)導(dǎo)（Transduction）借助缺陷噬菌體為媒介，把供體細(xì)胞中DNA片段攜帶到受體細(xì)胞中，從而使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱轉(zhuǎn)導(dǎo)。獲得新遺傳性狀的受體細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)子（transductant）。轉(zhuǎn)導(dǎo)過程不需要細(xì)胞接觸，而是以噬菌體為載體

（二）轉(zhuǎn)導(dǎo)（Transduction）借助缺陷噬菌體為媒介，117轉(zhuǎn)導(dǎo)主要分為：

完全普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)

流產(chǎn)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)

低頻局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)兩種類型

高頻局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)主要分為：118（1)

普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)（Generalizedtransduction）

由于完全缺陷型噬菌體攜帶了供體菌染色體片段，當(dāng)它去感染受體菌時，使后者獲得這部分遺傳性狀的現(xiàn)象稱為普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)

（1)

普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)（Generalizedtransd119完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)條件

供體菌----野生型（鼠傷寒沙門氏菌

）受體菌-----各種營養(yǎng)缺陷型完全缺陷型噬菌體----P22，感染復(fù)數(shù)<1特點：供體的任何基因都有可能進(jìn)入受體細(xì)胞完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)條件120微生物的遺傳變異與育種課件121（2）局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)

Restrictedtransduction是指通過部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中并獲得表達(dá)的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。

（2）局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)

Restrictedtransducti122（2）局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)

Restrictedtransduction條件：

供體菌----大腸桿菌K12（λ）溶源菌（野生型）

受體菌-----營養(yǎng)缺陷型（Bio-，gal-）

部分缺陷溫和性噬菌體----λd特點：

只傳遞供體菌的少數(shù)特定基因（2）局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)

Restrictedtransducti123正常噬菌體和轉(zhuǎn)導(dǎo)半乳糖（gal）的缺陷型噬菌體(dg)的形成過程

正常噬菌體和轉(zhuǎn)導(dǎo)半乳糖（gal）的缺陷型噬菌體(dg)的124發(fā)生誤切頻率10–4~10–6因此

形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子的頻率低條件：感染復(fù)數(shù)m.o.i<1低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生誤切頻率10–4~10–6低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)125高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)條件：當(dāng)感染復(fù)數(shù)m.o.I>1

受體菌變?yōu)樾纬呻p溶源菌E.coliK12(/dg)UV

①轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體（

dg）50%+②輔助噬菌體（

）50%再次侵染其他受體細(xì)胞

，m.o.I<1

侵染的50%受體菌變?yōu)檗D(zhuǎn)導(dǎo)子高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)條件：當(dāng)感染復(fù)數(shù)m.o.I>1①轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體（d126微生物的遺傳變異與育種課件127微生物的遺傳變異與育種課件128微生物的遺傳變異與育種課件129（3）、溶源轉(zhuǎn)變當(dāng)溫和噬菌體感染宿主而使其發(fā)生溶源化時，因噬菌體的基因整合到宿主的核基因組上，而使后者獲得了除免疫性以外的新性狀的現(xiàn)象，稱為溶源轉(zhuǎn)變。性質(zhì)：表面上與轉(zhuǎn)導(dǎo)相似，而本質(zhì)上不同于轉(zhuǎn)導(dǎo)。

（3）、溶源轉(zhuǎn)變當(dāng)溫和噬菌體感染宿主而使其發(fā)生溶源化時，因噬130（3）、溶源轉(zhuǎn)變區(qū)別：當(dāng)宿主喪失其原噬菌體時，通過溶源轉(zhuǎn)變而獲得的新性狀也隨之消失溫和噬菌體不攜帶來自供體菌的外源基因，是噬菌體自身基因使宿主獲得新性狀溫和噬菌體使完整的，不是缺陷的獲得新性狀的是溶源化的宿主細(xì)胞，不是轉(zhuǎn)導(dǎo)子

（3）、溶源轉(zhuǎn)變區(qū)別：131白喉棒桿菌：白喉毒素/溫和噬菌體肉毒梭菌：C型或D型肉毒毒素紅霉素鏈霉菌：合霉素合成和氣生菌絲形成/P4溫和噬菌體

白喉棒桿菌：白喉毒素/溫和噬菌體132（三）接合供體與受體細(xì)胞直接接觸，借性菌毛傳遞DNA，在受體細(xì)胞中發(fā)生交換、整合，使之獲得供體菌的遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為接合。通過接合而獲得新性狀的受體細(xì)胞就是接合子conjugant）

（三）接合供體與受體細(xì)胞直接接觸，借性菌毛傳遞DNA，在受體133微生物的遺傳變異與育種課件134微生物的遺傳變異與育種課件1351946年J.Lederberg等采用E.coli的兩株營養(yǎng)缺陷型進(jìn)行實驗1946年J.Lederberg等采用E.coli的兩株營養(yǎng)136微生物的遺傳變異與育種課件137大腸桿菌“接合”涉及到的菌株

F+（雄性）菌株：

含游離的F因子1~4個

，有

性菌毛1~4根

Hfr（高頻重組）菌株：

含整合的F因子，有性菌毛，F(xiàn)ˊ菌株

介于F+菌株與Hfr菌株之間，細(xì)胞中有游

離的、帶小段染色體基因的環(huán)狀F因子

F–（雌性）菌株

：沒有F因子，無性菌毛

大腸桿菌“接合”涉及到的菌株F+（雄性）菌株：含游離的138接合：雌性菌X雄性

F+菌株

Hfr菌株

Fˊ菌株

從自然界分離到的2000株E.coli中約有30%是F–菌株。F–（雌性）菌株接合接合：雌性菌X雄性F–（雌性）菌株接合139微生物的遺傳變異與育種課件140（1）F+×F–F++F+

（2）Hfr×F–Hfr+F–

（在大多數(shù)情況下）

Hfr×F–Hfr+Hfr（或

F+）

（極少數(shù)情況下）

（3）F×F–F′+F′注意：接合實驗所用到的F-菌株是一系列營養(yǎng)缺陷型菌株，當(dāng)發(fā)生重組時，變成原養(yǎng)型

（1）F+×F–141接合的結(jié)果轉(zhuǎn)性率高，染色體基因重組率低接合的結(jié)果轉(zhuǎn)性率高，染色體基因重組率低142Hfr菌株中F因子的整合、斷裂和轉(zhuǎn)移

Hfr菌株中F因子的整合、斷裂和轉(zhuǎn)移143微生物的遺傳變異與育種課件144Hfr的接合中斷實驗接合的結(jié)果轉(zhuǎn)性低，染色體基因重組率高Hfr的接合中斷實驗接合的結(jié)果轉(zhuǎn)性低，染色體基因重組率高145Hfr的中斷雜交實驗Hfr的中斷雜交實驗146微生物的遺傳變異與育種課件147F因子在Hfr菌株中的染色體上：插入位點有幾個可以正向，可以反向插入構(gòu)成了Hfr1菌株、Hfr2菌株、Hfr3……一系列菌株，相對穩(wěn)定通過中斷實驗，劃出了環(huán)狀染色體圖

F因子在Hfr菌株中的染色體上：148F’轉(zhuǎn)導(dǎo)1初生F’菌株F’轉(zhuǎn)導(dǎo)1初生F’菌株149F’轉(zhuǎn)導(dǎo)2次生F’菌株F’轉(zhuǎn)導(dǎo)2次生F’菌株150（四）原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合是通過人工方法，使遺傳性狀不同的兩個細(xì)胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合，并產(chǎn)生重組子的過程。應(yīng)用原生質(zhì)體融合技術(shù)后，細(xì)胞間基因重組的頻率大大提高了，在某些例子中，原生質(zhì)體的重組頻率已大于10-1

（四）原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合是通過人工方法，使遺傳性狀不同151主要步驟選擇親株、制備原生質(zhì)體、原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體再生篩選優(yōu)良性狀的融合子。

主要步驟選擇親株、152微生物的遺傳變異與育種課件153選擇親株

選擇遺傳性狀穩(wěn)定且具有優(yōu)勢互補(bǔ)的兩個親株。參與融合的親株一般都需要帶有可以識別的遺傳標(biāo)記，如營養(yǎng)缺陷型或抗藥性等。誘變劑對原種進(jìn)行處理來獲得這些遺傳標(biāo)記。應(yīng)先測定菌株各遺傳標(biāo)記的穩(wěn)定性，自發(fā)回復(fù)突變的頻率低選擇親株選擇遺傳性狀穩(wěn)定且具有優(yōu)勢互補(bǔ)的兩個親株。154原生質(zhì)體制備

一般都采用酶解法去壁。根據(jù)微生物細(xì)胞壁的不同，需分別采用不同的酶，如溶菌酶，纖維素酶，蝸牛酶等。有時需結(jié)合其它一些措施，如在生長培養(yǎng)基中添加甘氨酸、蔗糖或抗生素等，以提高細(xì)胞壁對酶解的敏感性。

原生質(zhì)體制備一般都采用酶解法去壁。155原生質(zhì)體融合聚乙二醇（PEG）能有效地促進(jìn)原生質(zhì)體融合一般PEG的使用濃度范圍在25-40%。原生質(zhì)體只需要與PEG接觸一分鐘，紫外線照射或脈沖電場等物理因素處理也能促進(jìn)原生質(zhì)體融合。

原生質(zhì)體融合聚乙二醇（PEG）能有效地促進(jìn)原生質(zhì)體融合156原生質(zhì)體再生就是使原生質(zhì)體重新長出細(xì)胞壁

，恢復(fù)完整的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。不同微生物的原生質(zhì)體的最適再生條件不同。但最重要的一個共同點是都需要高滲透壓。細(xì)菌一般再生率為3-10%。

原生質(zhì)體再生就是使原生質(zhì)體重新長出細(xì)胞壁，恢復(fù)完整的細(xì)胞形157篩選優(yōu)良性狀融合重組子

直接法將融合液涂布高滲再生選擇培養(yǎng)基平板上，直接篩選出原養(yǎng)型重組子；間接法把融合液涂布在營養(yǎng)豐富的高滲再生平板上，表型延遲后，再涂布高滲再生選擇培養(yǎng)基。篩選優(yōu)良性狀融合重組子直接法將融合液涂布高滲再生選擇培養(yǎng)基158原生質(zhì)體融合的優(yōu)點：

可以提高重組率

可進(jìn)行多親本融合

有利于不同種間、屬間微生物的雜交

通過原生質(zhì)體融合提高產(chǎn)量

原生質(zhì)體融合的優(yōu)點：159二、真核微生物的基因重組有性雜交準(zhǔn)性雜交原生質(zhì)體融合遺傳轉(zhuǎn)化二、真核微生物的基因重組有性雜交160（一）有性雜交一般指性細(xì)胞間的接合和隨之發(fā)生的染色體重組，并產(chǎn)生新遺傳型后代的過程。凡是能產(chǎn)生有性孢子的酵母菌或霉菌，原則上都能采用與高等動、植物雜交育種相似的有性雜交方法進(jìn)行育種。

（一）有性雜交一般指性細(xì)胞間的接合和隨之發(fā)生的染色體重161親本的單倍化↓有性雜交↓雜交后代的檢出↓篩選優(yōu)良性狀個體親本的單倍化162工業(yè)上應(yīng)用的釀酒酵母通常是雙倍體酵母菌，并且只進(jìn)入無性世代。要使這些酵母菌發(fā)生基因重組，應(yīng)先誘使其產(chǎn)生子囊孢子，再使兩個不同性狀的親本發(fā)生接合，形成二倍體的雜交后代。

工業(yè)上應(yīng)用的釀酒酵母通常是雙倍體酵母菌，并且只進(jìn)入無性世代。163酒精酵母

面包發(fā)酵產(chǎn)酒率高

對糖的利用能力強(qiáng)

子囊孢子

子囊孢子

雜交二倍體

酒精酵母面包發(fā)酵164（二）準(zhǔn)性雜交育種（parasexualhybridization）準(zhǔn)性生殖是一種類似于有性生殖，但比它更原始的生殖方式，

準(zhǔn)性生殖可發(fā)生在同一生物的二個不同來源的體細(xì)胞之間，經(jīng)細(xì)胞融合但不發(fā)生減數(shù)分裂，導(dǎo)致低頻率的基因重組

（二）準(zhǔn)性雜交育種（parasexualhybridiza165準(zhǔn)性生殖的過程①菌絲聯(lián)結(jié)②異核體形成（質(zhì)配）③核配形成雜合二倍體④體細(xì)胞交換和單倍體化。

準(zhǔn)性生殖的過程①菌絲聯(lián)結(jié)166①菌絲聯(lián)結(jié)發(fā)生在一些形態(tài)上無區(qū)別，但遺傳特性有差別的兩個同種親本的體細(xì)胞之間，發(fā)生的頻率較低。

①菌絲聯(lián)結(jié)發(fā)生在一些形態(tài)上無區(qū)別，但遺傳特性有差別的兩個同種167微生物的遺傳變異與育種課件168②異核體形成（質(zhì)配）同一菌絲含有不同遺傳性狀的細(xì)胞核。具有野生型性狀（基因互補(bǔ)功能），可在基本培養(yǎng)基上生長；異核體的分生孢子不能在基本培養(yǎng)基上生長；

②異核體形成（質(zhì)配）同一菌絲含有不同遺傳性狀的細(xì)胞核。169③核配形成雜合二倍體

異核體中的二個核偶爾會發(fā)生核融合或核配(caryogamy)，形成雜合雙倍體。它較異核體穩(wěn)定，產(chǎn)生的孢子比單倍體菌絲產(chǎn)生的孢子大一倍。雜合二倍體產(chǎn)生的分生孢子能在基本培養(yǎng)基上生長；

③核配形成雜合二倍體異核體中的二個核偶爾會發(fā)生核融合或核配170④體細(xì)胞交換和單倍體化雜合體細(xì)胞中有極少數(shù)細(xì)胞核在進(jìn)行有絲分裂的過程中，能發(fā)生體細(xì)胞染色體間的交換、分離（單倍體化）而產(chǎn)生具有新性狀的單倍體雜合子、雙倍體及非整倍體。

④體細(xì)胞交換和單倍體化雜合體細(xì)胞中有極少數(shù)細(xì)胞核在進(jìn)行有絲分171微生物的遺傳變異與育種課件172微生物的遺傳變異與育種課件173第四節(jié)

基因工程基因工程是用人為的方法將所需的某一供體生物的遺傳物質(zhì)DNA分子提取出來，在離體條件下切割后，把它與作為載體的DNA分子連接起來，然后導(dǎo)入某一受體細(xì)胞中，讓外來的遺傳物質(zhì)在其中進(jìn)行正常的復(fù)制和表達(dá)，從而獲得新物種的一種嶄新的育種技術(shù)

第四節(jié)基因工程基因工程是用人為的方法將所需的某一供體生物的174微生物的遺傳變異與育種課件175第五節(jié)

菌種的衰退、復(fù)壯和保藏

一、菌種的衰退與復(fù)壯1、衰退（degeneration）：菌種在培養(yǎng)或保藏過程中，由于自發(fā)突變的存在，出現(xiàn)某些原有優(yōu)良生產(chǎn)性狀的劣化、遺傳標(biāo)記的丟失等現(xiàn)象，稱為菌種的衰退

第五節(jié)菌種的衰退、復(fù)壯和保藏

一、菌種的衰退與復(fù)176常見的衰退現(xiàn)象菌落和細(xì)胞形態(tài)的改變；生長速度緩慢，產(chǎn)孢子越來越少；抵抗力、抗不良環(huán)境能力減弱等。代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對宿主寄生能力下降常見的衰退現(xiàn)象菌落和細(xì)胞形態(tài)的改變；1772、菌種的復(fù)壯（rejuvenation）使衰退的菌種恢復(fù)原來優(yōu)良性狀。狹義的復(fù)壯從衰退的群體中找出未衰退的個體，廣義的復(fù)壯：利用自發(fā)突變（正變）不斷地從生產(chǎn)中選育優(yōu)良菌種

2、菌種的復(fù)壯（rejuvenation）使衰退的菌種恢復(fù)原178菌種的復(fù)壯措施：

①純種分離：（平板劃線法、涂布法、傾注法、單細(xì)胞挑取法等）。

②通過寄主體內(nèi)生長進(jìn)行復(fù)壯；

③淘汰已衰退的個體菌種的復(fù)壯措施：

①純種分離：（平板劃線法、涂布法、傾注法、1793、防止菌種衰退的方法

①

控制傳代次數(shù)

②選擇合適的培養(yǎng)條件；

③采用不宜衰退的細(xì)胞進(jìn)行傳代

④采用有效的菌種保藏方法。3、防止菌種衰退的方法

①控制傳代次數(shù)180二、菌種保藏：

1.目的：

①

存活，不丟失，不污染

②

防止優(yōu)良性狀喪失

③

隨時為生產(chǎn)、科研提供優(yōu)良菌種

二、菌種保藏：

1.目的：

①存活，不丟失，不污染

②181二、菌種保藏：

2.原理：（1）首先選用優(yōu)良的純種，最好是休眠體，（如分生孢子、芽胞等），（2）其次創(chuàng)造長期降低微生物代謝強(qiáng)度，難以發(fā)生突變的環(huán)境條件。（其環(huán)境要素是干燥、低溫、缺氧、缺營養(yǎng)

以及添加保護(hù)劑等）二、菌種保藏：

2.原理：1823.菌種保藏的方法

菌

連續(xù)在培養(yǎng)基上（內(nèi)）

移種

種

生活態(tài)

傳代培養(yǎng)保藏法

連續(xù)在活宿主上（內(nèi)）移種

保

固體斜面

藏

濕法

半固體瓊脂柱

方

休眠態(tài)

液體介質(zhì)（蒸餾水、糖液、其它溶液）

法

干法

藏在玻璃管內(nèi)

吸附在合適的載體上3.菌種保藏的方法菌183方法①低溫保藏法

方法：菌種管置4℃冰箱保藏，定時傳代

，3-6月

②石蠟油低溫保藏法：

橡皮塞取代棉塞、加石蠟油。1-2年方法①低溫保藏法

方法：菌種管置4℃冰箱保藏，定時傳代，3184（3）干燥保藏法

將菌種置于土壤、細(xì)紗、濾紙、硅膠等干燥材料上保藏。如砂土管法，適用于放線菌、芽孢菌和某些真菌保藏，保藏時間1-10年。（3）干燥保藏法185④真空冷凍干燥法加有保護(hù)劑的菌懸液在凍結(jié)狀態(tài)下予以真空干燥。適用于各種微生物，便于大量保藏，菌種存活時間長，是目前最好的保藏方法。5-15年⑤液氮超低溫保藏法將菌種置于保護(hù)劑中，預(yù)凍后保存在液氮超低溫冰箱中（-196℃）。適用于各種微生物的較理想的保藏方法。15年以上

④真空冷凍干燥法186國內(nèi)外菌種保藏機(jī)構(gòu)外菌種保藏機(jī)構(gòu)國內(nèi)外菌種保藏機(jī)構(gòu)中國微生物菌種保藏委員會(CCCCM)

美國的典型菌種保藏中心(ATCC)

英國國家典型菌種保藏所（NCTC）

法國里昂巴斯德研究所（IPL）

國內(nèi)外菌種保藏機(jī)構(gòu)外菌種保藏機(jī)構(gòu)國內(nèi)外菌種保藏機(jī)構(gòu)中國微生物187方法名稱主要措施適宜菌種保藏期評價冰箱保藏法（斜面）冰箱保藏法（半固體）石蠟油封藏法*沙土保藏法冷凍干燥法低溫低溫低溫、缺氧干燥、無營養(yǎng)干燥、無氧、低溫、有保護(hù)劑各大類細(xì)菌、酵母菌各大類**產(chǎn)孢子微生物各大類3~6月6~12月1~2年1~10年5~15年以上簡便簡便簡便簡便有效簡便有效方法名稱主要措施適宜菌種保藏期評價冰箱保藏法（斜面）低溫188第十章微生物的遺傳變異與育種

第一節(jié)

遺傳物質(zhì)的物質(zhì)基礎(chǔ)第十章微生物的遺傳變異與育種

第一節(jié)遺傳物質(zhì)的物189遺傳(heredity)：親代生物傳遞給子代一套實現(xiàn)與其相同形狀的遺傳信息。

特點：具穩(wěn)定性。遺傳型（genotype）：又稱基因型，指某一生物個體所含有的全部基因的總和是一種內(nèi)在可能性或潛力。

遺傳(heredity)：190變異(variation):

生物體在外因或內(nèi)因的作用下，遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或數(shù)量發(fā)生改變而導(dǎo)致表型改變。變異的特點：a。群體一般為10-6～10-10；b.形狀變化的幅度大；c.變化后形成的新性狀是穩(wěn)定遺傳的。

變異(variation):191表型（phenotype）：指生物體所具有的一切外表特征和內(nèi)在特性的總和;

是具一定遺傳型的生物在一定條件下所表現(xiàn)出的具體性狀。遺傳型+環(huán)境條件

表型

。

表型（phenotype）：192

飾變（modification）：指不涉及遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變而只發(fā)生在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯水平上的表型變化。特點：a.幾乎整個群體中的每一個個體都發(fā)生同樣的變化；b.性狀變化的幅度?。籧.因遺傳物質(zhì)不變，故飾變是不遺傳的。引起飾變的因素消失后，表型即可恢復(fù)。

193一、3個經(jīng)典實驗（一）經(jīng)典轉(zhuǎn)化實驗（二）噬菌體感染實驗（三）植物病毒重建實驗一、3個經(jīng)典實驗（一）經(jīng)典轉(zhuǎn)化實驗194（一）經(jīng)典轉(zhuǎn)化實驗1928年F.Griffith肺炎鏈球菌使小鼠患敗血癥死亡S型菌株---菌株形成莢膜、菌落表面光滑、致病R型菌株---菌株不形成莢膜、菌落表面粗糙、不致病

（一）經(jīng)典轉(zhuǎn)化實驗1928年F.Griffith肺炎鏈球195微生物的遺傳變異與育種課件196平板培養(yǎng)實驗

熱死S菌——不生長

活R菌—長出RII菌

熱死S菌+活R菌—長出大量R菌和10-菌

平板培養(yǎng)實驗熱死S菌——不生長

活R菌—長出RI197活R菌+S菌無細(xì)胞抽提液——長出大量R菌和少量S菌

活R菌+S菌無細(xì)胞抽提液1981944年O.T.Avery活R菌+①加S菌DNA②加S菌DNA及DNA酶以外的酶③加S菌的DNA和DNA酶④加S菌的RNA⑤加S菌的蛋白質(zhì)⑥加S菌的莢膜多糖

長出S菌只長R菌1944年O.T.Avery活R菌+長出S菌只長R菌19910分鐘后用搗碎器使空殼脫離吸附離心沉淀細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)后，可產(chǎn)生大量完整的子代噬菌體（二）噬菌體感染實驗含32P-DNA的一組：放射性85%在沉淀中10分鐘后吸附離心沉淀細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)后，可產(chǎn)生大量完整的子200微生物的遺傳變異與育種課件201

（三）植物病毒的重建實驗（三）植物病毒的重建實驗202微生物的遺傳變異與育種課件203二、遺傳物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的存在部位和方式（一）核酸存在的七個水平及質(zhì)粒細(xì)胞水平：存在于細(xì)胞核或核質(zhì)體，單核或多核細(xì)胞核水平:原與真核生物的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)不同，核外DNA染色體水平:倍性(真核)和染色體數(shù)核酸水平：在原核中同染色體水平、存在部分二倍體 DNA或RNA，復(fù)合或裸露，雙鏈或單鏈基因水平：具自主復(fù)制能力的遺傳功能單位，長度與信息量，轉(zhuǎn)錄——翻譯密碼子水平： 信息單位,起始和終止,核苷酸水平： 突變或交換單位，四種堿基二、遺傳物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的存在部位和方式（一）核酸存在的七個水平204DNA的三種存在形式

DNA的三種存在形式205第二節(jié)

基因突變和誘變育種一、基因突變第二節(jié)基因突變和誘變育種一、基因突變206一、基因突變突變：指生物體的表型發(fā)生的可遺傳的變化。狹義突變：基因突變—點突變廣義突變：基因突變和染色體畸變突變的幾率：10-6---10-9

野生菌株------突變-------突變株一、基因突變突變：指生物體的表型發(fā)生的可遺傳的變化。207（一）基因突變類型（表型分類）營養(yǎng)缺陷型（株）抗性突變型（株）條件致死突變（株）形態(tài)突變型（株）抗原突變型（株）產(chǎn)量突變型（株）（一）基因突變類型（表型分類）營養(yǎng)缺陷型（株）形態(tài)突變型（208營養(yǎng)缺陷型——因突變而喪失合成某種物質(zhì)的能力，因此必須在培養(yǎng)基中添加某種物質(zhì)才能生長的突變類型?？剐酝蛔冃汀蛲蛔兌a(chǎn)生了對某種化學(xué)藥物或致死物理因子的抗性的突變株。

營養(yǎng)缺陷型——因突變而喪失合成某種物質(zhì)的能力，因此必須在培養(yǎng)209條件致死突變型——突變后在某種條件下可正常生長繁殖，而在另一條件下卻無法生長繁殖的突變型

抗原突變型——因突變而引起的抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生改變條件致死突變型——突變后在某種條件下可正常生長繁殖，而在另一210（二）突變率每一細(xì)胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率。突變率為10–8是指該細(xì)胞在一億次細(xì)胞分裂中，會發(fā)生一次突變。突變率也可以用每一單位群體在每一世代中產(chǎn)生突變株（mutant，即突變型）的數(shù)目來表示。突變率=突變細(xì)胞數(shù)/分裂前群體細(xì)胞數(shù)

（二）突變率每一細(xì)胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率。211突變是獨立的。某一基因發(fā)生突變不會影響其它基因的突變率。突變是獨立的。某一基因發(fā)生突變不會影響其它基因的突變率。212（三）基因突變的特點以細(xì)菌的抗藥性為例。不對應(yīng)性：突變的性狀與突變原因之間無直接的對應(yīng)關(guān)系。自發(fā)性：突變可以在沒有人為誘變因素處理下自發(fā)地產(chǎn)生。稀有性：突變率低且穩(wěn)定。

（三）基因突變的特點以細(xì)菌的抗藥性為例。213（三）基因突變的特點獨立性：各種突變獨立發(fā)生，不會互相影響?？烧T發(fā)性：誘變劑可提高突變率。穩(wěn)定性：變異性狀穩(wěn)定可遺傳。（三）基因突變的特點獨立性：各種突變獨立發(fā)生，不會互214（三）基因突變的特點可逆性：從原始的野生型基因到變異株的突變稱為正向突變，從突變株回到野生型的過程則稱為回復(fù)突變

（三）基因突變的特點可逆性：從原始的野生型基因到變異株的突變215（四）基因突變的自發(fā)性和不對應(yīng)性變量試驗又稱波動試驗或彷徨試驗。1943年，S.E.Luria和M.Delbrück根據(jù)統(tǒng)計學(xué)原理，設(shè)計了的實驗。大腸桿菌大腸桿菌的T1噬菌體（烈性噬菌體）觀察統(tǒng)計抗噬菌體的抗性菌株數(shù)量

（四）基因突變的自發(fā)性和不對應(yīng)性變量試驗又稱波動試驗或彷徨試216微生物的遺傳變異與育種課件217微生物的遺傳變異與育種課件2182、涂布實驗原理與變量試驗相同，方法更為簡便，且可計算突變率。

2、涂布實驗原理與變量試驗相同，方法更為簡便，且可計算突變率219（五）基因突變劑機(jī)制自發(fā)突變誘發(fā)突變（五）基因突變劑機(jī)制自發(fā)突變220微生物的遺傳變異與育種課件2211、

染色體數(shù)目的變化

n----2n-----3n-----4n整倍變化n----n+1、n-1，2n---2n+1、2n-1、2n-2非整倍變化原核生物只有一條染色體，但可成為部分二倍體。

1、

染色體數(shù)目的變化n----2n-----3n---2222、

染色體結(jié)構(gòu)的變化

染色體結(jié)構(gòu)的變化也稱為染色體畸變，包括：缺失、重復(fù)、倒位、易位、轉(zhuǎn)座。一般認(rèn)為這是由于染色體單體發(fā)生斷裂后，錯誤性愈合而造成的。

可造成隱性基因的表達(dá)、顯形基因的拷貝數(shù)增多、某一性狀的缺失、基因間連鎖程度的變化、不同染色體基因的連鎖等變化。2、

染色體結(jié)構(gòu)的變化

染色體結(jié)構(gòu)的變化也稱為染色體畸223重復(fù)、缺失、倒位、易位重復(fù)、缺失、倒位、易位224轉(zhuǎn)座因子（可移動基因、跳躍基因）插入序列IS轉(zhuǎn)座子Tn轉(zhuǎn)座噬菌體Mn轉(zhuǎn)座頻率：10-5—10-7

轉(zhuǎn)座因子---復(fù)制---非同源重組正向重復(fù)序列-----轉(zhuǎn)座酶基因-----反向重復(fù)序列

轉(zhuǎn)座因子（可移動基因、跳躍基因）插入序列IS2253、基因突變（點突變）的誘變機(jī)制誘變劑（mutagen）：凡能提高突變率的任何理化因子，就稱為誘變劑種類：誘變劑的種類很多代表性的誘變劑的作用機(jī)制。

3、基因突變（點突變）的誘變機(jī)制誘變劑（mutagen）：凡226（1）堿基置換（substitution）一對堿基被另一對堿基所置換。轉(zhuǎn)換（transition），即DNA鏈中的一個嘌呤被另一個嘌呤或是一個嘧啶被另一個嘧啶所置換；顛換（transversion），即一個嘌呤被一個嘧啶,或是一個嘧啶被一個嘌呤所置換。

（1）堿基置換（substitution）一對堿基被另一對堿227堿基的置換（實線代表轉(zhuǎn)換；虛線代表顛換）

堿基的置換（實線代表轉(zhuǎn)換；虛線代表顛換）228堿基置換后會出現(xiàn)下列幾種情況(1)

錯義突變

一種氨基酸，變成另一種氨基酸；(2)

無義突變

氨基酸的堿基置換后變成UAG（琥珀突變）、UAA（赫石突變）UGA（乳石突變）等終止密碼子；

堿基置換后會出現(xiàn)下列幾種情況(1)

錯義突變一種氨229配對原則

嘌呤

------嘧啶

6位上是氨基的嘌呤------4位上是酮基的嘧啶

6位上是酮基的嘌呤------4位上是氨基的嘧啶

配對原則230*烷化劑(alkylatingagent)帶有一個或多個活性烷基，誘變作用是其與DNA中的堿基或磷酸作用。常見的烷化劑有硫酸二乙酯（EDS）、甲基磺酸乙酯（EMS）、N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍（NTG）、亞硝基甲基脲(NMU)、氮芥、乙烯亞胺和環(huán)氧乙酸等。*烷化劑(alkylatingagent)帶有一個或多231B間接引起置換的誘變劑這類誘變劑主要是一些堿基類似物

這些化合物有5-溴尿嘧啶（5-BU），5-氟尿嘧啶(5-FU)、8-氮鳥嘌呤(8-NG)和2-氨基嘌呤（2-AP）等。它們與正常堿基的結(jié)構(gòu)類似，在DNA復(fù)制時，它們可以被錯誤地?fù)饺隓NA，引起誘變效應(yīng)，所以說它們引起堿基置換的作用是間接的。

B間接引起置換的誘變劑這類誘變劑主要是一些堿基類似物232（2）移碼突變移碼突變是指由一種誘變劑引起DNA分子中的一個或少數(shù)幾個核苷酸的插入或缺失，從而使該部位后面的全部遺傳密碼發(fā)生轉(zhuǎn)錄和翻譯錯誤的一類突變。

（2）移碼突變移碼突變是指由一種誘變劑引起DNA分子中的一個233移碼突變誘變劑

吖啶類染料（原黃素、吖啶黃、吖啶橙等）和一系列稱為ICR類的化合物（美國的腫瘤研究所合成而得名），都是移碼突變的有效誘變劑

移碼突變誘變劑

吖啶類染料（原黃素、吖啶黃、吖啶橙等）2344、自發(fā)突變的機(jī)理大多數(shù)自發(fā)突變本質(zhì)上也是誘發(fā)的，只不過它不是人為的，而是自然環(huán)境或細(xì)胞內(nèi)環(huán)境誘發(fā)的。細(xì)胞外因素、細(xì)胞內(nèi)因素DNA分子內(nèi)部因素

4、自發(fā)突變的機(jī)理大多數(shù)自發(fā)突變本質(zhì)上也是誘發(fā)的，只不過它不235（1）細(xì)胞外的誘發(fā)因素

自然環(huán)境或人工條件下的物理和化學(xué)因素自然環(huán)境中，宇宙間的短波輻射、宇宙線和紫外線等，多因素低劑量長期輻射的綜合效應(yīng)，將會引起生物的自發(fā)突變。自然環(huán)境中存在低劑量的金屬離子、高分子化合物、生物堿藥物、染料等都能成為引起生物突變的化學(xué)因素

（1）細(xì)胞外的誘發(fā)因素自然環(huán)境或人工條件下的物理和化學(xué)因素236（2）細(xì)胞內(nèi)的誘發(fā)因素

細(xì)胞的代謝活動會產(chǎn)生一些誘變物質(zhì)，如過氧化氫、咖啡堿和重氮絲氨酸等，它們是引起自發(fā)突變的內(nèi)源誘變劑。許多微生物的陳舊培養(yǎng)物中易出現(xiàn)自發(fā)突變株，可能就是這類原因。

（2）細(xì)胞內(nèi)的誘發(fā)因素細(xì)胞的代謝活動會產(chǎn)生一些誘變物質(zhì)，如237（3）

DNA分子內(nèi)部因素

DNA分子中的堿基存在著互變異構(gòu)效應(yīng)。A、T、G、C四種堿基，存在酮基結(jié)構(gòu)（T，G）或氨基結(jié)構(gòu)（A，C），酮式與烯醇式存在互變異構(gòu)，氨基式與亞氨基式存在互變狀態(tài)（3）DNA分子內(nèi)部因素

DNA分子中的堿基存在著互變異構(gòu)238（3）

DNA分子內(nèi)部因素

一般生理條件下，堿基互變平衡反應(yīng)傾向于酮式或氨基式，DNA兩條互補(bǔ)鏈之間總是以A:T和CG堿基配對。但T偶爾也會以稀有的烯醇式形式出現(xiàn)，這樣在DNA復(fù)制到達(dá)這一位置的瞬間，新合成鏈中T對應(yīng)的不再是A，而是G；（3）DNA分子內(nèi)部因素

一般生理條件下，堿基互變平衡反應(yīng)239（3）

DNA分子內(nèi)部因素

同理，若堿基C以稀有的亞氨基形式出現(xiàn)，在DNA復(fù)制到達(dá)這一位置的瞬間，則它對應(yīng)的不是G據(jù)統(tǒng)計，堿基對發(fā)生自發(fā)突變的幾率約為10–8~10