酶分子的修飾課件

第六章酶分子的化學修飾1精選版課件ppt第六章酶分子的化學修飾1精選版課件ppt什么是酶分子修飾？

酶分子的化學修飾，就是在分子水平上對酶進行改造，以達到改構(gòu)和改性的目的.即在體外將酶分子通過人工的方法與一些化學基團(物質(zhì))，特別是具有生物相容性的物質(zhì)，進行共價連接，從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。這種物質(zhì)被稱為修飾試劑。2精選版課件ppt什么是酶分子修飾？酶分子的化學修飾，就是在分子水

酶具有穩(wěn)定性差，活力不夠高，以及可能具有抗原性等弱點使酶的應(yīng)用受限制。因此人們希望通過酶分子修飾來改善這些弱點，來提高酶的使用范圍和應(yīng)用價值。為什么要進行酶分子修飾？3精選版課件ppt酶具有穩(wěn)定性差，活力不夠高，以及可能具有抗原性等弱酶分子修飾的意義提高酶的活力

activity增強酶的穩(wěn)定性

stability降低或消除酶的抗原性

immunologicalproperty研究和了解酶分子中主鏈、側(cè)鏈、組成單位、金屬離子和各種物理因素對酶分子空間構(gòu)象的影響structure回本章目錄4精選版課件ppt酶分子修飾的意義提高酶的活力activity回本章目錄4精第一節(jié)酶分子的修飾方法酶分子的修飾：

酶的表面修飾酶的內(nèi)部修飾.

1.1酶的表面修飾1.1.1化學固定化

一般是通過酶表面的酸性或堿性氨基酸殘基將酶共價連接到惰性載體上，由于酶所處的環(huán)境的改變，會使酶的性質(zhì)，特別是動力學性質(zhì)發(fā)生改變．5精選版課件ppt第一節(jié)酶分子的修飾方法酶分子的修飾：1.1酶的固定在電荷載體上，由于介質(zhì)中的質(zhì)子靠近載體，并與載體上的電荷發(fā)生作用，使酶的最適pH向堿性(陰離子載體)或向酸性(陽離子載體)方向偏移。因此在生產(chǎn)工藝中需幾個酶協(xié)同作用時，由于固定化可使不同酶的最適pH彼此靠近。如將糖化酶固定在陰離子載體上，其最適pH由4.5升到6.5，與D-木糖異構(gòu)酶的最適PH(7.5)靠近，這樣可簡化高果糖漿生產(chǎn)工藝。6精選版課件ppt固定在電荷載體上，由于介質(zhì)中的質(zhì)子靠近載體，并與載體上的電荷1.1.2酶的小分子修飾作用用小分子修飾劑共價修飾酶，可使酶穩(wěn)定性提高。這主要是利用一些適宜的小分子修飾劑來修飾酶表面的一些基團：—COOH、一NH3+、—SH、—OH、咪唑基等。如將α—胰凝乳蛋白酶表面的氨基修飾成親水性更強的基團，酶的熱穩(wěn)定性在60℃時提高了1000倍，溫度更高時穩(wěn)定化效應(yīng)更強烈。這個穩(wěn)定的酶能經(jīng)受滅菌的極端條件而不失活，因而有利于醫(yī)療用酶馬肝醇脫氫酶(HLADH)的Lys乙基化、糖基化和甲基化都能增加其活力。其中甲基化使酶活力增加最大，同時酶的穩(wěn)定性也提高了。7精選版課件ppt1.1.2酶的小分子修飾作用7精選版課件ppt1.1.3酶的大分子修飾分為大分子非共價修飾和大分子共價修飾兩類

（1）大分子的非共價修飾使用一些能與酶非共價地相互作用而又能有效地保護酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等．它們既能通過氫鍵固定在酶分子表面，也能通過氫鍵有效地與外部水相連，從而保護酶的活力。一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通過調(diào)節(jié)酶的微環(huán)境來保護酶的活力。有些來自嗜熱菌的酶具有較高穩(wěn)定性，其原因正是由于保護性大分子(如肽和聚胺)發(fā)揮作用的結(jié)果。另一類添加物就是蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子之間相互作用時，其表面區(qū)域內(nèi)排除了水分子，降低了介電常數(shù)，因而增加了相互作用力，其穩(wěn)定性也就增加。因此酶的多聚體或酶聚合體的活力和穩(wěn)定性比單體高8精選版課件ppt1.1.3酶的大分子修飾8精選版課件ppt（2）大分子共價修飾

利用水溶性大分子與酶結(jié)合使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細改變，從而改變酶的特性與功能的方法稱為大分子結(jié)合修飾法，簡稱大分子結(jié)合法。用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、葡萄糖、環(huán)狀糊精、肝素、蔗糖聚合物、羧甲基纖維素、聚氨基酸等，通過共價鍵連接于酶分子的表面、形成一層覆蓋層。這些大分子修飾劑在使用前一般需經(jīng)過活化，然后在一定條件下與酶分子中的側(cè)鏈基團以共價鍵結(jié)合對酶分子進行修飾。9精選版課件ppt（2）大分子共價修飾9精選版課件ppt大分子共價修飾后的這種可溶性酶有許多有用的性質(zhì)：如用聚乙二醇修飾超氧物歧化酶(SOD)，不僅降低或消除酶的抗原性，且提高了穩(wěn)定性，抗蛋白酶的能力，延長了酶在體內(nèi)的半衰期，從而提高了酶藥效。日本學者將聚乙二醇連到脂肪酶、胰凝乳蛋白酶上所得產(chǎn)物溶于有機溶劑，在有機溶劑存在下能夠有效地起作用。嗜熱菌蛋白酶在水介質(zhì)中通常催化肽鏈裂解，但用聚乙二醇共價修飾后，其催化活性顯著改變，在有機溶劑中催化肽鍵合成，已用于制造合成甜味劑。10精選版課件ppt大分子共價修飾后的這種可溶性酶有許多有用的性質(zhì)：如用聚乙二醇

右旋糖酐經(jīng)高碘酸活化后，酶上氨基共價結(jié)合形成修飾酶。

右旋糖酐的活化：大分子結(jié)合修飾后的酶，呈現(xiàn)出來的催化特性：（1）通過修飾提高酶活力（2）通過修飾增加酶的穩(wěn)定性（3）通過修飾降低或消除抗原性11精選版課件ppt右旋糖酐經(jīng)高碘酸活化后，酶上氨基共價結(jié)合形成修飾酶。右旋1.1.5脂質(zhì)體包裹

酶脂質(zhì)體包埋，能使一些被包埋的大分子的酶進入細胞內(nèi)。許多醫(yī)藥酶，如SOD、溶菌酶等，由于分子量大，不易進入細胞內(nèi)，且在體內(nèi)半衰期短，產(chǎn)生免疫原性反應(yīng)。為此，可通過酶的表面化學修飾來解決，如SOD用聚乙二醇(PEG)修飾，修飾后其在體內(nèi)的穩(wěn)定件及免疫原性都大大改善。但如何讓修飾后的SOD進入細胞內(nèi)？可以采用脂質(zhì)體包裹的方法。12精選版課件ppt1.1.5脂質(zhì)體包裹12精選版課件ppt

脂質(zhì)體是天然脂類和或類固醇組成的微球體。酶分子可包埋在其內(nèi)部。它可通過與細胞的膜融合或內(nèi)吞作用而進入細胞內(nèi)。脂質(zhì)體無毒、易制作，亦被用作基因載體。把經(jīng)過表面修飾的SOD包埋在脂質(zhì)體中便可進入細胞。Michelsonn發(fā)現(xiàn)，被包裝的SOD進入細胞的能力比非脂質(zhì)體大得多，但包裝后的SOD進入胞內(nèi)能力與脂質(zhì)體成分及電荷特性有關(guān)。13精選版課件ppt脂質(zhì)體是天然脂類和或類固醇組成的微球體。酶的大分子修飾總結(jié)使用一些能與酶非共價地相互作用而又能有效地保護酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它們既能通過氫鍵固定在酶分子表面，也能通過氫鍵有效地與外部水相連，從而保護酶的活力。一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通過調(diào)節(jié)酶的微環(huán)境來保護酶的活力。另一類添加物就是蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子之間相互作用時，其表面區(qū)域內(nèi)排除了水分子，因而增加了相互作用力，其穩(wěn)定性也就增加了。非共價修飾14精選版課件ppt酶的大分子修飾總結(jié)使用一些能與酶非共價地相互作用而又能有效地用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通過共價鍵連接于酶分子的表面，形成一層覆蓋層。例如：用聚乙二醇修飾超氧物歧化酶，不僅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延長了酶在體內(nèi)的半衰期從而提高了酶藥效。每分子核糖核酸酶與6.5分子的右旋糖酐結(jié)合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶與11分子右旋糖酐結(jié)合，酶活力達到原有酶活力的5.1倍共價修飾15精選版課件ppt用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通過共價鍵連接聚乙二醇是線性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在體內(nèi)無毒性、無殘留、無免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以與酶產(chǎn)生交聯(lián)，因而，它被廣泛用于酶的修飾。酶半衰期相對穩(wěn)定性天然SOD6min1右旋糖酐-SOD7h70Ficoll(低分子量)–SOD14h140Ficoll(高分子量)–SOD24h240聚乙二醇-SOD35h350此外，還有脂質(zhì)體包裹、反相膠團微囊化等修飾方法

16精選版課件ppt聚乙二醇是線性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在體內(nèi)無毒性1.2酶分子內(nèi)部的修飾1.2.1非催化活性基團的修飾用化學試劑與酶蛋白上的非催化活性基團部位的一些氨基酸殘基進行共價連接進行修飾的方法。被修飾的殘基可以是親核的(Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His)，也可以是親電的(Tyr、Trp)．還可以是可氧化的(Tyr、Trp、Met)。對這類非催化殘基的修飾可改變酶的動力學性質(zhì)，改變酶對特殊底物的束縛能力。17精選版課件ppt1.2酶分子內(nèi)部的修飾17精選版課件ppt1.2.2催化活性基團的修飾通過有目的、選擇性修飾側(cè)鏈成分來實現(xiàn)催化活性基團部位內(nèi)的氨基酸的取代，這種將氨基酸側(cè)鏈轉(zhuǎn)化為另一種新的氨基酸側(cè)鏈的方法，叫化學突變法。如將枯草桿菌蛋白酶活性部位的Ser殘基轉(zhuǎn)化為Cys殘基，新產(chǎn)生的巰基蛋白酶對肽或脂沒有水解能力，但能水解一些高度活化的底物，如硝基苯脂。這種方法由于受到專一試劑、有機化學工業(yè)水平的限制，沒有蛋白質(zhì)工程技術(shù)普遍，但它通過產(chǎn)生非蛋白質(zhì)氨基酸的能力，可以有力地補充蛋白質(zhì)工程技術(shù)。18精選版課件ppt1.2.2催化活性基團的修飾18精選版課件ppt1.2酶分子內(nèi)部的修飾1.2.3酶蛋白主鏈修飾

酶蛋白主鏈修飾主要是靠酶法對酶蛋白的主鏈進行相關(guān)修飾。如用蛋白酶對ATP酶有限水解，切除其十幾個殘基后，酶活力提高了5.5倍。該活化酶仍為四聚體，亞單位分子量變化不大。這說明天然酶平時處于非最佳的催化構(gòu)象狀態(tài)。19精選版課件ppt1.2酶分子內(nèi)部的修飾19精選版課件ppt1.3.2酶的金屬離子置換修飾把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的修飾方法，稱為金屬離子置換修飾。酶分子中的金屬離子取代可以改變酶的專一性、穩(wěn)定性及其抑制作用。α-淀粉酶中的鈣離子（Ca2+），谷氨酸脫氫酶中的鋅離子(Zn2+)，過氧化氫酶分子中的鐵離子(Fe2+)，?；被崦阜肿又械匿\離子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的銅、鋅離子(Cu2+,Zn2+)

20精選版課件ppt1.3.2酶的金屬離子置換修飾把酶分子中的金屬離子換成另一1.3.2酶的金屬離子置換修飾若從酶分子中除去其所含的金屬離子，酶往往會喪失其催化活性。如果重新加入原有的金屬離子，酶的催化活性可以恢復(fù)或者部分恢復(fù)。若用另一種金屬離子進行置換，則可使酶呈現(xiàn)出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至喪失，有的可以使酶的活力提高或者增加酶的穩(wěn)定性。21精選版課件ppt1.3.2酶的金屬離子置換修飾若從酶分子中除去其所含的金屬金屬離子置換修飾的過程

酶的分離純化：首先將欲進行修飾的酶經(jīng)分離純化，除去雜質(zhì)，獲得具有一定純度的酶液。b.除去原有的金屬離子：在純化的酶液中加入一定量金屬螯合劑，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金屬離子與EDTA等形成螯合物。通過透析、超濾、分子篩層析等方法，將EDTA-金屬螯合物從酶液中除去。此時酶往往成為無活性狀態(tài)。c.加入置換離子：去離子的酶液中加入一定量另一種金屬離子，酶蛋白與新加入的金屬離子結(jié)合，除去多余的置換離子，就可得到經(jīng)過金屬離子置換后的酶。22精選版課件ppt金屬離子置換修飾的過程酶的分離純化：首先將欲進行修飾的酶經(jīng)金屬離子置換修飾的注意事項

金屬離子置換修飾只適用于那些在分子結(jié)構(gòu)中本來含有金屬離子的酶。用于金屬離子置換修飾的金屬離子，一般都是二價金屬離子。

23精選版課件ppt金屬離子置換修飾的注意事項23精選版課件ppt

金屬酶的金屬取代舉例

如酰化氨基酸水解酶活性部位中的Zn2+被Co2+取代后的酶，其最適pH和底物專一性都有改變：Zn酶對乙酰Ala的最適pH8.5．而Co酶為7.0；鈷酶對N—氯乙酰Ala等6種底物的水解活力增加，而對N—氯乙酰Met等三種底物的活力降低。在使用時對不同底物可以選用不同的酶——Zn/Co酶。Fe—SOD中的Fe被Mn取代后，酶的穩(wěn)定性和抑制作用發(fā)生顯著改變：Mn-SOD對H2O2穩(wěn)定性顯著增加．而對NaN3的抑制作用顯著降低。24精選版課件ppt金屬酶的金屬取代舉例24精選版課件ppt第二節(jié)酶側(cè)鏈基團的修飾酶化學修飾的目的，主要是提高酶的穩(wěn)定性和消除作為外源物質(zhì)在體內(nèi)的抗原性。要達到這些目的，在修飾原理、修飾劑和反應(yīng)條件的選擇以及對酶學性質(zhì)的了解等方面，都必須有足夠的了解。25精選版課件ppt第二節(jié)酶側(cè)鏈基團的修飾酶化學修飾的目的，主要是提高酶的穩(wěn)2.1被修飾酶的性質(zhì)

在開展酶的修飾工作前．對被修飾酶的酶學性質(zhì)必須有一個較為全面的了解。

2.1.1酶的穩(wěn)定性

被修飾酶對熱、對酸堿的穩(wěn)定性，作用溫度及PH范圍以及最適溫度、最適PH的情況等應(yīng)有所了解。2.1.2酶活性中心的狀況酶催化活性主要依賴于酶的活性中心。因此對酶活性中心的組成，如：酶蛋白中哪些氨基酸殘基或其側(cè)鏈基團參與了酶活性中心．是否需要輔因子，此外還需了解酶分子形狀、寡聚酶的亞基組成等。26精選版課件ppt2.1被修飾酶的性質(zhì)26精選版課件ppt2.1.3酶側(cè)鏈基團的性質(zhì)及反應(yīng)性選擇性修飾試劑必須要與多肽鏈中某一種特定的氨基酸殘基側(cè)鏈基團發(fā)生化學反應(yīng)，并形成緊密共價結(jié)合。酶分子中經(jīng)常被修飾的氨基酸殘基側(cè)鏈基團有：巰基、氨基、羧基、咪唑基、羥基、酚基、胍基、吲哚基、硫醚基及二硫鍵等。

27精選版課件ppt2.1.3酶側(cè)鏈基團的性質(zhì)及反應(yīng)性27精選版課件p2.1.3酶側(cè)鏈基團的性質(zhì)及反應(yīng)性

（1）對巰基的化學修飾巰基是蛋白質(zhì)的一類重要的親核基團，因此常被用來修飾。修飾方法大體上有如下幾種：

①烷基化試劑。烷基試劑中用得最多的是碘乙酸、巰基乙醇、谷胱甘肽(GSH)、碘乙酰胺。

E—SH+ICH2COOH→E—S—CH2COOH

②汞試劑。這類試劑如HgCl2、對氯汞苯甲酸(pCMB)和2—氯汞硝基苯酚等。28精選版課件ppt2.1.3酶側(cè)鏈基團的性質(zhì)及反應(yīng)性28精選版課件p③Ellman試劑。5，5’·二硫--二--（2—硝基苯甲酸)是目前最常用的巰基修飾試劑，又稱Ellman試劑，還可用來測定酶蛋白巰基含量。29精選版課件ppt③Ellman試劑。5，5’·二硫--二--（2—硝基苯甲酸(2)氨基的化學修飾①乙酸酐修飾②2，4，6—三硝基苯磺酸修飾。30精選版課件ppt(2)氨基的化學修飾②2，4，6—三硝基苯磺酸修飾。30精選③2，4—二硝基氟苯修飾(Sanger反應(yīng))Sanger反應(yīng)的作用？④氨基的烷基化。這類試劑包括鹵代乙酸、芳香鹵和芳香磺酸等。31精選版課件ppt③2，4—二硝基氟苯修飾(Sanger反應(yīng))④氨基的烷基化。⑤丹磺酰氯(DNS)修飾。⑥苯異硫氰酸酯(PITC)修飾(即Edman反應(yīng))32精選版課件ppt⑤丹磺酰氯(DNS)修飾。⑥苯異硫氰酸酯(PITC)修飾(即(3)羧基的化學修飾(4)咪唑基的修飾反應(yīng)。(5)吲哚基的化學修飾甲硫氨酸側(cè)鏈基團的化學修飾胍基的化學修飾33精選版課件ppt(3)羧基的化學修飾33精選版課件ppt(8)二硫鍵的化學修飾①2—·巰基乙醇修飾②34精選版課件ppt(8)二硫鍵的化學修飾①2—·巰基乙醇修飾②34精選版③二硫蘇糖醇(DTT)修飾35精選版課件ppt③二硫蘇糖醇(DTT)修飾35精選版課件ppt（9）酚基的化學修飾

①N—乙酰咪唑修飾

②碘化反應(yīng)

36精選版課件ppt（9）酚基的化學修飾①N—乙酰咪唑修飾②碘化反應(yīng)36精2.2酶分子修飾的基本要求和條件

對酶分子進行修飾必須在修飾原理、修飾劑和反應(yīng)條件的選擇以及酶學性質(zhì)等方面都要有足夠的了解。做好基礎(chǔ)課（1）酶的穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、作用溫度、pH、抑制劑等。（2）酶活性中心的狀況

活性中心基團、輔因子等。其他如分子大小、性狀、亞基數(shù)等。37精選版課件ppt2.2酶分子修飾的基本要求和條件對酶分子進行修飾必須在修酶分子修飾的條件修飾反應(yīng)盡可能在酶穩(wěn)定條件下進行，并盡量不破壞酶活性功能的必需基團，使修飾率高，同時酶的活力回收高。（1）pH與離子強度

pH決定了酶蛋白分子中反應(yīng)基團的解離狀態(tài)。由于它們的解離狀態(tài)不同，反應(yīng)性能也不同。（2）修飾反應(yīng)的溫度與時間

嚴格控制溫度和時間可以減少以至消除一些非專一性的修飾反應(yīng)。（3）反應(yīng)體系中酶與修飾劑的比例回本章目錄38精選版課件ppt酶分子修飾的條件修飾反應(yīng)盡可能在酶穩(wěn)定條件下進行，并盡量不破因此謹慎選擇修飾反應(yīng)條件是必須的。當然，這些修飾條件隨著修飾反應(yīng)的不同而不同，因此，需要經(jīng)過大量實驗摸索才能確定.2.2.1pH與離子強度

pH決定了酶蛋白分子中反應(yīng)基團的解離狀態(tài)。由于它們的解離狀態(tài)不同，反應(yīng)性能也不同。例如在pH2—5時，碘乙酸可以選擇性地與Met的側(cè)鏈基團發(fā)生修飾反應(yīng)，而在此pH條件下，可被碘乙酸修飾的基團，如巰基、咪唑基和氨基等，都處于不反應(yīng)的狀態(tài)。另一方面，有些修飾試劑在不同pH條件下與同一基團可形成不同產(chǎn)物。39精選版課件ppt因此謹慎選擇修飾反應(yīng)條件是必須的。當然，這些修飾條件隨著修飾

2.2.2修飾反應(yīng)的溫度與時間

嚴格控制溫度和時間可以減少以至消除一些非專一性的修飾反應(yīng)。如用聚乳糖作修飾劑表面修飾酶（還原劑為氫硼化氰，BH3CN）時．在8℃時10d內(nèi)幾乎無反應(yīng)．而當溫度從25℃上升到37℃時反應(yīng)速度加快了3倍，而且隨pH的升高而加快。用甲酸氧化酶蛋白的反應(yīng)，在低溫(約—10℃)下修飾反應(yīng)僅限于Cys、胱氨酸和Met殘基上，而在較高溫度下，甲酸可以與Trp、Tyr、Ser、Scr以及Thr殘基發(fā)生反應(yīng)。

2.2.3反應(yīng)體系中酶與修飾劑的比例

用聚乙二醇(PEG)修飾酶時，活化PEG的多少能控制酶分子的修飾程度。40精選版課件ppt2.2.2修飾反應(yīng)的溫度與時間40精選版課件ppt2.3酶蛋白修飾反應(yīng)的主要類型

化學修飾劑與酶蛋白反應(yīng)的類型主要有如下幾種：2.3.1酯化及相關(guān)反應(yīng)

酯化及相關(guān)反應(yīng)，主要的修飾試劑包括乙酰瞇唑、二異丙基氟磷酸(DFPA)、酸酐磺酰氯、硫代三氟乙酸乙酯、O—甲基異脲。在室溫(20—25℃)、pH4.5—9.0條件下，主要與酶蛋白中的氨基、羥基、酚基及巰基等側(cè)鏈基團發(fā)生酰基化反應(yīng)：41精選版課件ppt2.3酶蛋白修飾反應(yīng)的主要類型41精選版課件ppt42精選版課件ppt42精選版課件ppt2.3.2烷基化反應(yīng)

這類修飾劑主要有2，4—二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、碘甲烷、苯甲酰鹵代物等，通常帶有一個活潑的負電性的鹵素原子，使烷基帶有部分正電性，導(dǎo)致酶蛋白親核基團烷基化。常被修飾的基團有氨基、巰基、羧基、甲硫基、咪唑基等。43精選版課件ppt2.3.2烷基化反應(yīng)43精選版課件ppt2.3.3氧化還原反應(yīng)

氧化劑有H2O2、N—溴代琥珀酰亞胺等；另外一類是光氧化試劑。它們都具有氧化性，能將側(cè)鏈基團氧化。受氧化的側(cè)鏈基團有巰基、甲硫基、吲哚基和酚基等。還原劑有2—巰基乙醇、巰基乙酸、二硫蘇糖醇(DTT)等。它們主要作用于二硫鍵。連四硫酸鈉、連四硫酸鉀作為氧化劑作用溫和，同時，在修飾反應(yīng)中用作巰基保護劑。例如：44精選版課件ppt2.3.3氧化還原反應(yīng)44精選版課件ppt2.3.4芳香環(huán)取代反應(yīng)[四硝基甲烷(Tetranitro—Methane，TNM)反應(yīng)]：由于蛋白質(zhì)中氨基酸殘基上的酚羥基在3和5位上容易發(fā)生親電取代的碘化和硝代反應(yīng)，其中四硝基甲烷是這類修飾劑中的典型例子．四硝基甲烷作用于Tyr殘基的酚羥基后，形成3—硝基酪氨酸衍生物。其產(chǎn)物具有特殊光譜。45精選版課件ppt2.3.4芳香環(huán)取代反應(yīng)45精選版課件ppt2.3.5溴化氰[BrCN)裂解反應(yīng)BrCN裂解Met反應(yīng)可在自發(fā)誘導(dǎo)重排條件下導(dǎo)致肽鍵斷裂：46精選版課件ppt2.3.5溴化氰[BrCN)裂解反應(yīng)46精選版課件pp第三節(jié)酶蛋白肽鏈的修飾酶蛋白肽鏈的修飾包括和肽鏈有限水解修飾和對酶蛋白肽鏈的大分子修飾反應(yīng)，耍注意的問題是修飾劑分子量大小、鏈的長度。一般要求修飾劑具有較大的分子量、良好的生物相容性和水溶性。這樣，經(jīng)修飾的酶，其半衰期較長，活力回收較高。下面將介紹—些主要的修飾反應(yīng)和修飾劑。47精選版課件ppt第三節(jié)酶蛋白肽鏈的修飾酶蛋白肽鏈的修飾包括和肽鏈有限水解酶蛋白主鏈修飾(肽鏈有限水解修飾)利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學結(jié)構(gòu)及其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法。酶蛋白主鏈修飾之一主要是靠酶切/酶原激活法。a、胃蛋白酶原的激活

48精選版課件ppt酶蛋白主鏈修飾(肽鏈有限水解修飾)利用酶分子主鏈的切斷和連接49精選版課件ppt49精選版課件pptb、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活

50精選版課件pptb、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活50精選版課51精選版課件ppt51精選版課件pptc、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活

52精選版課件pptc、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活肽鏈有限水解修飾酶蛋白主鏈修飾——酶切/酶原激活法胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活53精選版課件ppt肽鏈有限水解修飾53精選版課件ppt3.1聚乙二醇及其修飾反應(yīng)聚乙二醇（PEG）具有良好的生物相容性和水溶性，在體內(nèi)無毒性、無殘留、無免疫原性，并可消除酶的抗原性．使其末端活化后可以與酶產(chǎn)生交聯(lián)，因而，它被廣泛用于酶的修飾。被修飾的酶分子被蓋上一層疏松的親水外殼，導(dǎo)致流體動力學發(fā)生改變，從而產(chǎn)生了許多有用的性質(zhì)，比如：修飾酶能在廣泛的pH范圍溶解；不被離子交換劑吸附；電泳遷移率下降；沉降速度較天然酶慢等。聚乙二醇用作修飾劑時應(yīng)注意下面幾個問題：54精選版課件ppt3.1聚乙二醇及其修飾反應(yīng)聚乙二醇（PEG）具有良好的(1)PEG分子量為750一5000的修飾效果較好，用甲氧基PEG效果更好。(2)修飾效果不僅與其分子量有關(guān)，還與所用活化劑及其與酶的配比有關(guān)?！慊罨疨EG與酶的配比為15—50：1（mol)時，酶活性最多保留40％以上。(3)在多數(shù)情況下酶的抗原性隨分子表面自由氨基被其修飾而降低，當50％以下自由氨基被修飾后，酶基本沒有抗原性了，但酶活性也隨自由氨基的減少而下降，因此在選擇方法上，應(yīng)盡量選擇對酶活性影響小的修飾方法。PEG的修飾方法主要有以下幾種。55精選版課件ppt(1)PEG分子量為750一5000的修飾效果較好，用甲氧基3.1.1疊氮法此法是將PEG末端羥基轉(zhuǎn)化為疊氮基，然后與酶反應(yīng)。（1)PEG甲氧甲酰甲酯制備，PEG與氯代醋酸酐及重氮甲烷反應(yīng)，生成PEG甲氧甲酰甲酯，再與亞硝酸鈉反應(yīng)生成疊氮化合物而活化。56精選版課件ppt3.1.1疊氮法（1)PEG甲氧甲酰甲酯制備，PEG57精選版課件ppt57精選版課件ppt3.1.2琥珀酸酐法此法常用二溴代琥珀酸酐在溫和的堿性條件下將PEG活化，經(jīng)減壓濃縮制得活化PEG，活化PEG與酶分子上氨基發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，而得修飾酶：58精選版課件ppt3.1.2琥珀酸酐法58精選版課件ppt3.1.3三氯均嗪法

PEG經(jīng)三氯氯均嗪活化后，用石油醚抽提或減壓蒸餾，制得活化PEG，后者與酶交聯(lián)，制得修飾酶：59精選版課件ppt3.1.3三氯均嗪法59精選版課件ppt3.1.4羰二亞胺法

此法是將PEG用無水三乙胺、對—磺酰氯甲苯處理后，再加NaN3沸騰回流處理36h．制得PEG—N3，PEG—N3再轉(zhuǎn)變成PEG—NH2，PEG—NH2通過羰二亞胺與酶分子上羧基交聯(lián)：60精選版課件ppt3.1.4羰二亞胺法60精選版課件ppt

3.1.5重氮法

此法是將PEG末端羥基轉(zhuǎn)化為重氮基團，再在弱堿性條件下與酶分子的酚基、咪唑基等反應(yīng)，而生成修飾酶。主要反應(yīng)有以下三種。

(1)對—硝基芐基氯活化法61精選版課件ppt3.1.5重氮法61精選版課件ppt(2)N—羧甲氨基苯甲酐活化法62精選版課件ppt(2)N—羧甲氨基苯甲酐活化法62精選版課件ppt(3)4—氟—2—硝基重氮物活化法63精選版課件ppt(3)4—氟—2—硝基重氮物活化法63精選版課件ppt3.2糖類的修飾反應(yīng)3.2.1右旋糖苷及右旋糖苷硫酸酯的修飾反應(yīng)

右旋糖苷是由α—葡萄糖通過α—1，6—糖苷鍵連接而成的高分子多糖，具有良好的生物相容性和水溶性。其多糖上的雙羥基經(jīng)活化后可與酶分子上游離氨基相結(jié)合、從而修飾了酶。

（1）溴化氰法（2）高碘酸氧化法64精選版課件ppt3.2糖類的修飾反應(yīng)3.2.1右旋糖苷及右旋糖苷硫3.2糖類的修飾反應(yīng)3.2.2糖肽(Glycopeptide)的修飾反應(yīng)

糖肽是蛋白酶水解人纖維蛋白或Y一球蛋白所得到的產(chǎn)物。其分子上具有游離氨基，活化后與酶分子上氨基反應(yīng)，從而可修飾酶。

(1)2，3—異氰酸甲苯活化法（2）戊二醛法3.2.3聚乳糖[Polylactose)修飾反應(yīng)65精選版課件ppt3.2糖類的修飾反應(yīng)65精選版課件ppt3.3合成大分子多聚物修飾酶

3.3.1聚N—乙烯吡咯烷酮

PVP(N—乙烯吡咯烷酮)水溶性、分子量為10000，常用作修飾劑。3.3.2聚乙烯醇修飾酶

聚乙烯醇（PVA）與對硝基苯氧酰氯反應(yīng)后，其產(chǎn)物的硝基用連二亞硫酸鈉還原成氨基，與酶分子中羧基共價連結(jié)，生成修飾酶。3.3.3聚丙烯酸(PAA)修飾酶

聚丙烯酸常用的分子量為250000，經(jīng)N—羥基琥珀酰亞胺活化后與酶的氨基反應(yīng)，生成修飾酶。其反應(yīng)過程如下：66精選版課件ppt3.3合成大分子多聚物修飾酶3.3.1聚N—乙烯吡咯3.3.4聚氨基酸修飾酶

聚賴氨酸修飾酶

聚賴氨酸作為修飾劑的常用分子量為6700。其Lys上的氨基與含羧基較多的酶的羧基通過羰二亞胺產(chǎn)生交聯(lián)，從而生成修飾酶。其反應(yīng)如下：67精選版課件ppt3.3.4聚氨基酸修飾酶67精選版課件ppt3.4天然大分子對酶的修飾反應(yīng)3.4.1肝素修飾酶

肝素由氨基葡萄糖和兩種糖醛酸組成，平均分子量約2000，是一種含硫酸酯的粘多糖：68精選版課件ppt3.4天然大分子對酶的修飾反應(yīng)3.4.1肝素修飾酶經(jīng)肝素修飾的酶具有良好的穩(wěn)定性，同時具有抗凝血、抗血栓、降血脂等活性，更能提高酶的療效。目前常用羰二亞胺、三氯均嗪、溴化氰活化法來用肝素修飾酶?，F(xiàn)分別介紹如下：（1）羰二亞胺法

用羰二亞胺活化肝素分子上的羧基后，與酶上的氨基共價連接，形成修飾酶：69精選版課件ppt經(jīng)肝素修飾的酶具有良好的穩(wěn)定性，同時具有抗凝血、抗血栓、降血（2）三氯均嗪法肝素分子的羥基用三氯均嗪活化后，與酶分子上的氨基反應(yīng)，形成修飾酶。70精選版課件ppt（2）三氯均嗪法70精選版課件ppt（3）溴化氰法

肝素的鄰雙羥基用BrCN活化，然后與酶的氨基反應(yīng)．生成修飾酶。其反應(yīng)與右旋糖苷溴化氰活化法相似。3.4.2人血清白蛋白修飾酶

(1)戊二醛法

利用戊二醛雙功能基團使白蛋白上的和酶分子上的氨基相互交聯(lián)，從而生成修飾酶。71精選版課件ppt（3）溴化氰法3.4.2人血清白蛋白修飾酶71精選版課（2）羰二亞胺法

利用羰二亞胺作交聯(lián)劑，使白蛋白與酶交聯(lián)起來，從而生成修飾酶。反應(yīng)如下：72精選版課件ppt（2）羰二亞胺法72精選版課件ppt(3)活性酯法

目前活性酯法應(yīng)用較多，酶的修飾程度高，活力回收高，同時不需用底物保護。其反應(yīng)過程如下：73精選版課件ppt(3)活性酯法73精選版課件ppt第四節(jié)修飾酶的性質(zhì)酶分子化學修飾這項新技術(shù)可以大大地改善天然酶的不足之處，使其更適合于工業(yè)生產(chǎn)的應(yīng)用要求。如修飾酶穩(wěn)定性的提高，便導(dǎo)致其應(yīng)用工藝上降低成本、改善反應(yīng)條件及延長使用壽命，最終導(dǎo)致了工業(yè)上的技術(shù)革新和技術(shù)改造。

酶的化學修飾改變了天然酶的最適pH、Km、抑制常數(shù)、減少或消除了抗原性，甚至使酶分子具備對某些組織和細胞的親和力和穿透性。這些性質(zhì)也正是酶應(yīng)用技術(shù)中的關(guān)鍵問題。因此酶化學修飾后酶性質(zhì)改變的研究，在工業(yè)生產(chǎn)和基礎(chǔ)理論上都具有十分重要的意義。74精選版課件ppt第四節(jié)修飾酶的性質(zhì)酶分子化學修飾這項新技4.1修飾酶的熱穩(wěn)定性

酶分子經(jīng)化學修飾后，一般熱穩(wěn)定性有較大的提高。這是由于修飾劑的多個功能基團與酶分子上的多個基團（如氨基、羧基、咪唑基、酚基、巰基等）相互交聯(lián)，增加酶分于構(gòu)象穩(wěn)定性，因而提高了酶對熱的穩(wěn)定性。PEG修飾酶的穩(wěn)定性沒有明顯提高，可能是因為這種交聯(lián)作用較少之故。但這種交聯(lián)如果發(fā)生在酶分子活性中心，不但酶的活力會下降，而且有時酶的熱穩(wěn)定性也有下降的現(xiàn)象。75精選版課件ppt4.1修飾酶的熱穩(wěn)定性75精選版課件ppt76精選版課件ppt76精選版課件ppt4.2修飾酶的抗原性

修飾酶的抗原性與修飾劑有關(guān)。目前，比較公認的在消除酶的抗原性上效果比較明顯的是PEG和人血清白蛋白。PVP(N—乙烯吡咯烷酮)修飾的酶，在重復(fù)用于體內(nèi)后，會誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗體而使酶失活。糖類物質(zhì)包括右旋糖苷也不容易消除酶的抗原性，在體內(nèi)仍可誘發(fā)過敏反應(yīng)。77精選版課件ppt4.2修飾酶的抗原性77精選版課件ppt78精選版課件ppt78精選版課件ppt4.3修飾酶對各類失活因子的抵抗力下表列舉了多種修飾酶對蛋白酶和各類相應(yīng)抑制劑的抵抗能力?？梢钥葱揎椕笇Φ鞍酌浮⒁种苿┚幸欢ǖ牡挚鼓芰?，從而提高其穩(wěn)定性。79精選版課件ppt4.3修飾酶對各類失活因子的抵抗力79精選版課件ppt4.4修飾酶在體內(nèi)的半衰期修飾酶與天然酶比較，一般在體內(nèi)半哀期得到有效延長。由于酶分子經(jīng)修飾后，增強了對熱、蛋白酶、抑制劑等的穩(wěn)定性，因此就延長了在體內(nèi)的半衰期。這對酶的應(yīng)用十分有利。80精選版課件ppt4.4修飾酶在體內(nèi)的半衰期80精選版課件ppt4.5最適pH大部分酶經(jīng)化學修飾后，酶的最適pH發(fā)生變化。這種變化在應(yīng)用上有時具有重要意義。如豬肝尿酸酶用白蛋白修飾后，最適pH由天然酶的10.5，下降到7.4—8.5。這一變化．使pH下降了2個多pH單位，同時pH范圍也擴大。修飾的最適pH更接近于生理環(huán)境，在臨床應(yīng)用上有較大意義。81精選版課件ppt4.5最適pH81精選版課件ppt解釋這一現(xiàn)象的假設(shè)是修飾尿酸酶的微環(huán)境更穩(wěn)定，當酶在pH7.4時，酶活性部位仍能處于相對偏堿的環(huán)境內(nèi)行使催化功能，或者是修飾酶被“固定”于一個更活潑的狀態(tài)，并且當基質(zhì)pH下降時，酶仍能保持這種活潑狀態(tài)使催化功能不受影響。82精選版課件ppt解釋這一現(xiàn)象的假設(shè)是修飾尿酸酶的微環(huán)境更穩(wěn)定，當酶在p

4.6Km的變化大多數(shù)酶經(jīng)修飾后，Vm沒有明顯變化。但有些酶經(jīng)修飾后，Km值變大。這可能是由于屏蔽效應(yīng)所引起的83精選版課件ppt4.6Km的變化83精選版課件pptKm值等于反應(yīng)速度達到最大速度一半時的底物濃度。它給出一個酶能夠應(yīng)答底物濃度變化范圍的有用指標。4.7對組織的分布能力：一些酶經(jīng)化學修飾后，對組織的分布能力有所改變，能在血液中被靶器官選擇性地吸收。84精選版課件pptKm值等于反應(yīng)速度達到最大速度一半時的底物濃度。它給出一個酶（1）α-葡萄糖苷酶：Pmepe’s病主要由糖原貯積于肝細胞的二級溶酶體所造成的。用α-葡萄糖苷酶進行治療時，希望酶在體內(nèi)盡量避免受到吞噬細胞的破壞，盡快到達肝細胞。現(xiàn)在已知肝細胞上有特異性的白蛋白受體，因此用白蛋白修飾酶后，能有利于肝細胞對酶的攝入，使更多的酶達到靶位發(fā)揮作用。（2）辣根過氧化物酶：辣根過氧化物酶用聚LYS修飾后，細胞的攝入量增加，這種穿透細胞的能力增強被認為可能是聚LYS增加了酶分子上正電荷，因為當聚LYS上氨基被?；?，修飾酶就不表現(xiàn)出細胞穿透力增強的現(xiàn)象。85精選版課件ppt（1）α-葡萄糖苷酶：Pmepe’s病主要由糖原貯積于肝細胞（3）溶菌酶：天然溶菌酶幾乎不能被肝細胞吸收，用唾液酸苷酶處理后也沒有變化。但溶菌酶與胎球蛋白來源的糖肽交聯(lián)后，再用唾液酸苷酶除去糖肽末端唾液酸，暴露出半乳糖殘基，就很快能被肝細胞吸收，如果用半乳糖苷酶除去半乳糖，則肝細胞的吸收又馬上下降，由此可見，肝細胞表面有特異性的半乳糖受體來識別和結(jié)合半乳糖分子，而此修飾方法也能使一些酶或藥物被肝吸收加快。（溶菌酶+唾液酸苷酶→不能被肝cell吸收）溶菌酶+糖肽（修飾劑）交聯(lián)→唾液酸苷酶→暴露半乳糖殘基→很快被肝cell吸收86精選版課件ppt（3）溶菌酶：（溶菌酶+唾液酸苷酶→不能被肝cell吸收）溶表：天然和修飾溶菌酶的肝攝入量對比酶每分鐘肝攝入量（%）天然溶菌酶3.2糖肽修飾溶菌酶3.5脫唾液酸糖肽修飾溶菌酶

3487精選版課件ppt表：天然和修飾溶菌酶的肝攝入量對比酶每分鐘肝攝入量（%）天然改變最適反應(yīng)pH、降低Km、提高抑制常數(shù)、減少或消除抗原性、增加對蛋白水解酶的抵抗力、甚至使酶分子具備對某些組織或細胞的親和力或穿透性等等，這都是在實用中急需改進及解決一些技術(shù)關(guān)鍵，酶修飾可以在這方面發(fā)揮重要作用。88精選版課件ppt改變最適反應(yīng)pH、降低Km、提高抑制常數(shù)、減少或消除抗酶化學修飾的前景：綜上所述，酶化學修飾在一定程度上改善天然酶的一些不足之處，在各種客觀條件下增強酶的穩(wěn)定性是一個首要問題，這可降低使用成本，改善反應(yīng)條件及延長使用壽命。89精選版課件ppt酶化學修飾的前景：綜上所述，酶化學修飾在一定程度上改善天然酶復(fù)習題：1、酶分子修飾工作，具體表現(xiàn)在哪幾個方面？

2、簡述目前常用的酶的修飾劑及其活化方法？3、修飾后酶的性質(zhì)在哪幾個方面會發(fā)生哪些變化？為什么？

90精選版課件ppt復(fù)習題：90精選版課件ppt第六章酶分子的化學修飾91精選版課件ppt第六章酶分子的化學修飾1精選版課件ppt什么是酶分子修飾？

酶分子的化學修飾，就是在分子水平上對酶進行改造，以達到改構(gòu)和改性的目的.即在體外將酶分子通過人工的方法與一些化學基團(物質(zhì))，特別是具有生物相容性的物質(zhì)，進行共價連接，從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。這種物質(zhì)被稱為修飾試劑。92精選版課件ppt什么是酶分子修飾？酶分子的化學修飾，就是在分子水

酶具有穩(wěn)定性差，活力不夠高，以及可能具有抗原性等弱點使酶的應(yīng)用受限制。因此人們希望通過酶分子修飾來改善這些弱點，來提高酶的使用范圍和應(yīng)用價值。為什么要進行酶分子修飾？93精選版課件ppt酶具有穩(wěn)定性差，活力不夠高，以及可能具有抗原性等弱酶分子修飾的意義提高酶的活力

activity增強酶的穩(wěn)定性

stability降低或消除酶的抗原性

immunologicalproperty研究和了解酶分子中主鏈、側(cè)鏈、組成單位、金屬離子和各種物理因素對酶分子空間構(gòu)象的影響structure回本章目錄94精選版課件ppt酶分子修飾的意義提高酶的活力activity回本章目錄4精第一節(jié)酶分子的修飾方法酶分子的修飾：

酶的表面修飾酶的內(nèi)部修飾.

1.1酶的表面修飾1.1.1化學固定化

一般是通過酶表面的酸性或堿性氨基酸殘基將酶共價連接到惰性載體上，由于酶所處的環(huán)境的改變，會使酶的性質(zhì)，特別是動力學性質(zhì)發(fā)生改變．95精選版課件ppt第一節(jié)酶分子的修飾方法酶分子的修飾：1.1酶的固定在電荷載體上，由于介質(zhì)中的質(zhì)子靠近載體，并與載體上的電荷發(fā)生作用，使酶的最適pH向堿性(陰離子載體)或向酸性(陽離子載體)方向偏移。因此在生產(chǎn)工藝中需幾個酶協(xié)同作用時，由于固定化可使不同酶的最適pH彼此靠近。如將糖化酶固定在陰離子載體上，其最適pH由4.5升到6.5，與D-木糖異構(gòu)酶的最適PH(7.5)靠近，這樣可簡化高果糖漿生產(chǎn)工藝。96精選版課件ppt固定在電荷載體上，由于介質(zhì)中的質(zhì)子靠近載體，并與載體上的電荷1.1.2酶的小分子修飾作用用小分子修飾劑共價修飾酶，可使酶穩(wěn)定性提高。這主要是利用一些適宜的小分子修飾劑來修飾酶表面的一些基團：—COOH、一NH3+、—SH、—OH、咪唑基等。如將α—胰凝乳蛋白酶表面的氨基修飾成親水性更強的基團，酶的熱穩(wěn)定性在60℃時提高了1000倍，溫度更高時穩(wěn)定化效應(yīng)更強烈。這個穩(wěn)定的酶能經(jīng)受滅菌的極端條件而不失活，因而有利于醫(yī)療用酶馬肝醇脫氫酶(HLADH)的Lys乙基化、糖基化和甲基化都能增加其活力。其中甲基化使酶活力增加最大，同時酶的穩(wěn)定性也提高了。97精選版課件ppt1.1.2酶的小分子修飾作用7精選版課件ppt1.1.3酶的大分子修飾分為大分子非共價修飾和大分子共價修飾兩類

（1）大分子的非共價修飾使用一些能與酶非共價地相互作用而又能有效地保護酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等．它們既能通過氫鍵固定在酶分子表面，也能通過氫鍵有效地與外部水相連，從而保護酶的活力。一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通過調(diào)節(jié)酶的微環(huán)境來保護酶的活力。有些來自嗜熱菌的酶具有較高穩(wěn)定性，其原因正是由于保護性大分子(如肽和聚胺)發(fā)揮作用的結(jié)果。另一類添加物就是蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子之間相互作用時，其表面區(qū)域內(nèi)排除了水分子，降低了介電常數(shù)，因而增加了相互作用力，其穩(wěn)定性也就增加。因此酶的多聚體或酶聚合體的活力和穩(wěn)定性比單體高98精選版課件ppt1.1.3酶的大分子修飾8精選版課件ppt（2）大分子共價修飾

利用水溶性大分子與酶結(jié)合使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細改變，從而改變酶的特性與功能的方法稱為大分子結(jié)合修飾法，簡稱大分子結(jié)合法。用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、葡萄糖、環(huán)狀糊精、肝素、蔗糖聚合物、羧甲基纖維素、聚氨基酸等，通過共價鍵連接于酶分子的表面、形成一層覆蓋層。這些大分子修飾劑在使用前一般需經(jīng)過活化，然后在一定條件下與酶分子中的側(cè)鏈基團以共價鍵結(jié)合對酶分子進行修飾。99精選版課件ppt（2）大分子共價修飾9精選版課件ppt大分子共價修飾后的這種可溶性酶有許多有用的性質(zhì)：如用聚乙二醇修飾超氧物歧化酶(SOD)，不僅降低或消除酶的抗原性，且提高了穩(wěn)定性，抗蛋白酶的能力，延長了酶在體內(nèi)的半衰期，從而提高了酶藥效。日本學者將聚乙二醇連到脂肪酶、胰凝乳蛋白酶上所得產(chǎn)物溶于有機溶劑，在有機溶劑存在下能夠有效地起作用。嗜熱菌蛋白酶在水介質(zhì)中通常催化肽鏈裂解，但用聚乙二醇共價修飾后，其催化活性顯著改變，在有機溶劑中催化肽鍵合成，已用于制造合成甜味劑。100精選版課件ppt大分子共價修飾后的這種可溶性酶有許多有用的性質(zhì)：如用聚乙二醇

右旋糖酐經(jīng)高碘酸活化后，酶上氨基共價結(jié)合形成修飾酶。

右旋糖酐的活化：大分子結(jié)合修飾后的酶，呈現(xiàn)出來的催化特性：（1）通過修飾提高酶活力（2）通過修飾增加酶的穩(wěn)定性（3）通過修飾降低或消除抗原性101精選版課件ppt右旋糖酐經(jīng)高碘酸活化后，酶上氨基共價結(jié)合形成修飾酶。右旋1.1.5脂質(zhì)體包裹

酶脂質(zhì)體包埋，能使一些被包埋的大分子的酶進入細胞內(nèi)。許多醫(yī)藥酶，如SOD、溶菌酶等，由于分子量大，不易進入細胞內(nèi)，且在體內(nèi)半衰期短，產(chǎn)生免疫原性反應(yīng)。為此，可通過酶的表面化學修飾來解決，如SOD用聚乙二醇(PEG)修飾，修飾后其在體內(nèi)的穩(wěn)定件及免疫原性都大大改善。但如何讓修飾后的SOD進入細胞內(nèi)？可以采用脂質(zhì)體包裹的方法。102精選版課件ppt1.1.5脂質(zhì)體包裹12精選版課件ppt

脂質(zhì)體是天然脂類和或類固醇組成的微球體。酶分子可包埋在其內(nèi)部。它可通過與細胞的膜融合或內(nèi)吞作用而進入細胞內(nèi)。脂質(zhì)體無毒、易制作，亦被用作基因載體。把經(jīng)過表面修飾的SOD包埋在脂質(zhì)體中便可進入細胞。Michelsonn發(fā)現(xiàn)，被包裝的SOD進入細胞的能力比非脂質(zhì)體大得多，但包裝后的SOD進入胞內(nèi)能力與脂質(zhì)體成分及電荷特性有關(guān)。103精選版課件ppt脂質(zhì)體是天然脂類和或類固醇組成的微球體。酶的大分子修飾總結(jié)使用一些能與酶非共價地相互作用而又能有效地保護酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它們既能通過氫鍵固定在酶分子表面，也能通過氫鍵有效地與外部水相連，從而保護酶的活力。一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通過調(diào)節(jié)酶的微環(huán)境來保護酶的活力。另一類添加物就是蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子之間相互作用時，其表面區(qū)域內(nèi)排除了水分子，因而增加了相互作用力，其穩(wěn)定性也就增加了。非共價修飾104精選版課件ppt酶的大分子修飾總結(jié)使用一些能與酶非共價地相互作用而又能有效地用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通過共價鍵連接于酶分子的表面，形成一層覆蓋層。例如：用聚乙二醇修飾超氧物歧化酶，不僅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延長了酶在體內(nèi)的半衰期從而提高了酶藥效。每分子核糖核酸酶與6.5分子的右旋糖酐結(jié)合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶與11分子右旋糖酐結(jié)合，酶活力達到原有酶活力的5.1倍共價修飾105精選版課件ppt用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通過共價鍵連接聚乙二醇是線性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在體內(nèi)無毒性、無殘留、無免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以與酶產(chǎn)生交聯(lián)，因而，它被廣泛用于酶的修飾。酶半衰期相對穩(wěn)定性天然SOD6min1右旋糖酐-SOD7h70Ficoll(低分子量)–SOD14h140Ficoll(高分子量)–SOD24h240聚乙二醇-SOD35h350此外，還有脂質(zhì)體包裹、反相膠團微囊化等修飾方法

106精選版課件ppt聚乙二醇是線性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在體內(nèi)無毒性1.2酶分子內(nèi)部的修飾1.2.1非催化活性基團的修飾用化學試劑與酶蛋白上的非催化活性基團部位的一些氨基酸殘基進行共價連接進行修飾的方法。被修飾的殘基可以是親核的(Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His)，也可以是親電的(Tyr、Trp)．還可以是可氧化的(Tyr、Trp、Met)。對這類非催化殘基的修飾可改變酶的動力學性質(zhì)，改變酶對特殊底物的束縛能力。107精選版課件ppt1.2酶分子內(nèi)部的修飾17精選版課件ppt1.2.2催化活性基團的修飾通過有目的、選擇性修飾側(cè)鏈成分來實現(xiàn)催化活性基團部位內(nèi)的氨基酸的取代，這種將氨基酸側(cè)鏈轉(zhuǎn)化為另一種新的氨基酸側(cè)鏈的方法，叫化學突變法。如將枯草桿菌蛋白酶活性部位的Ser殘基轉(zhuǎn)化為Cys殘基，新產(chǎn)生的巰基蛋白酶對肽或脂沒有水解能力，但能水解一些高度活化的底物，如硝基苯脂。這種方法由于受到專一試劑、有機化學工業(yè)水平的限制，沒有蛋白質(zhì)工程技術(shù)普遍，但它通過產(chǎn)生非蛋白質(zhì)氨基酸的能力，可以有力地補充蛋白質(zhì)工程技術(shù)。108精選版課件ppt1.2.2催化活性基團的修飾18精選版課件ppt1.2酶分子內(nèi)部的修飾1.2.3酶蛋白主鏈修飾

酶蛋白主鏈修飾主要是靠酶法對酶蛋白的主鏈進行相關(guān)修飾。如用蛋白酶對ATP酶有限水解，切除其十幾個殘基后，酶活力提高了5.5倍。該活化酶仍為四聚體，亞單位分子量變化不大。這說明天然酶平時處于非最佳的催化構(gòu)象狀態(tài)。109精選版課件ppt1.2酶分子內(nèi)部的修飾19精選版課件ppt1.3.2酶的金屬離子置換修飾把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的修飾方法，稱為金屬離子置換修飾。酶分子中的金屬離子取代可以改變酶的專一性、穩(wěn)定性及其抑制作用。α-淀粉酶中的鈣離子（Ca2+），谷氨酸脫氫酶中的鋅離子(Zn2+)，過氧化氫酶分子中的鐵離子(Fe2+)，?；被崦阜肿又械匿\離子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的銅、鋅離子(Cu2+,Zn2+)

110精選版課件ppt1.3.2酶的金屬離子置換修飾把酶分子中的金屬離子換成另一1.3.2酶的金屬離子置換修飾若從酶分子中除去其所含的金屬離子，酶往往會喪失其催化活性。如果重新加入原有的金屬離子，酶的催化活性可以恢復(fù)或者部分恢復(fù)。若用另一種金屬離子進行置換，則可使酶呈現(xiàn)出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至喪失，有的可以使酶的活力提高或者增加酶的穩(wěn)定性。111精選版課件ppt1.3.2酶的金屬離子置換修飾若從酶分子中除去其所含的金屬金屬離子置換修飾的過程

酶的分離純化：首先將欲進行修飾的酶經(jīng)分離純化，除去雜質(zhì)，獲得具有一定純度的酶液。b.除去原有的金屬離子：在純化的酶液中加入一定量金屬螯合劑，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金屬離子與EDTA等形成螯合物。通過透析、超濾、分子篩層析等方法，將EDTA-金屬螯合物從酶液中除去。此時酶往往成為無活性狀態(tài)。c.加入置換離子：去離子的酶液中加入一定量另一種金屬離子，酶蛋白與新加入的金屬離子結(jié)合，除去多余的置換離子，就可得到經(jīng)過金屬離子置換后的酶。112精選版課件ppt金屬離子置換修飾的過程酶的分離純化：首先將欲進行修飾的酶經(jīng)金屬離子置換修飾的注意事項

金屬離子置換修飾只適用于那些在分子結(jié)構(gòu)中本來含有金屬離子的酶。用于金屬離子置換修飾的金屬離子，一般都是二價金屬離子。

113精選版課件ppt金屬離子置換修飾的注意事項23精選版課件ppt

金屬酶的金屬取代舉例

如酰化氨基酸水解酶活性部位中的Zn2+被Co2+取代后的酶，其最適pH和底物專一性都有改變：Zn酶對乙酰Ala的最適pH8.5．而Co酶為7.0；鈷酶對N—氯乙酰Ala等6種底物的水解活力增加，而對N—氯乙酰Met等三種底物的活力降低。在使用時對不同底物可以選用不同的酶——Zn/Co酶。Fe—SOD中的Fe被Mn取代后，酶的穩(wěn)定性和抑制作用發(fā)生顯著改變：Mn-SOD對H2O2穩(wěn)定性顯著增加．而對NaN3的抑制作用顯著降低。114精選版課件ppt金屬酶的金屬取代舉例24精選版課件ppt第二節(jié)酶側(cè)鏈基團的修飾酶化學修飾的目的，主要是提高酶的穩(wěn)定性和消除作為外源物質(zhì)在體內(nèi)的抗原性。要達到這些目的，在修飾原理、修飾劑和反應(yīng)條件的選擇以及對酶學性質(zhì)的了解等方面，都必須有足夠的了解。115精選版課件ppt第二節(jié)酶側(cè)鏈基團的修飾酶化學修飾的目的，主要是提高酶的穩(wěn)2.1被修飾酶的性質(zhì)

在開展酶的修飾工作前．對被修飾酶的酶學性質(zhì)必須有一個較為全面的了解。

2.1.1酶的穩(wěn)定性

被修飾酶對熱、對酸堿的穩(wěn)定性，作用溫度及PH范圍以及最適溫度、最適PH的情況等應(yīng)有所了解。2.1.2酶活性中心的狀況酶催化活性主要依賴于酶的活性中心。因此對酶活性中心的組成，如：酶蛋白中哪些氨基酸殘基或其側(cè)鏈基團參與了酶活性中心．是否需要輔因子，此外還需了解酶分子形狀、寡聚酶的亞基組成等。116精選版課件ppt2.1被修飾酶的性質(zhì)26精選版課件ppt2.1.3酶側(cè)鏈基團的性質(zhì)及反應(yīng)性選擇性修飾試劑必須要與多肽鏈中某一種特定的氨基酸殘基側(cè)鏈基團發(fā)生化學反應(yīng)，并形成緊密共價結(jié)合。酶分子中經(jīng)常被修飾的氨基酸殘基側(cè)鏈基團有：巰基、氨基、羧基、咪唑基、羥基、酚基、胍基、吲哚基、硫醚基及二硫鍵等。

117精選版課件ppt2.1.3酶側(cè)鏈基團的性質(zhì)及反應(yīng)性27精選版課件p2.1.3酶側(cè)鏈基團的性質(zhì)及反應(yīng)性

（1）對巰基的化學修飾巰基是蛋白質(zhì)的一類重要的親核基團，因此常被用來修飾。修飾方法大體上有如下幾種：

①烷基化試劑。烷基試劑中用得最多的是碘乙酸、巰基乙醇、谷胱甘肽(GSH)、碘乙酰胺。

E—SH+ICH2COOH→E—S—CH2COOH

②汞試劑。這類試劑如HgCl2、對氯汞苯甲酸(pCMB)和2—氯汞硝基苯酚等。118精選版課件ppt2.1.3酶側(cè)鏈基團的性質(zhì)及反應(yīng)性28精選版課件p③Ellman試劑。5，5’·二硫--二--（2—硝基苯甲酸)是目前最常用的巰基修飾試劑，又稱Ellman試劑，還可用來測定酶蛋白巰基含量。119精選版課件ppt③Ellman試劑。5，5’·二硫--二--（2—硝基苯甲酸(2)氨基的化學修飾①乙酸酐修飾②2，4，6—三硝基苯磺酸修飾。120精選版課件ppt(2)氨基的化學修飾②2，4，6—三硝基苯磺酸修飾。30精選③2，4—二硝基氟苯修飾(Sanger反應(yīng))Sanger反應(yīng)的作用？④氨基的烷基化。這類試劑包括鹵代乙酸、芳香鹵和芳香磺酸等。121精選版課件ppt③2，4—二硝基氟苯修飾(Sanger反應(yīng))④氨基的烷基化。⑤丹磺酰氯(DNS)修飾。⑥苯異硫氰酸酯(PITC)修飾(即Edman反應(yīng))122精選版課件ppt⑤丹磺酰氯(DNS)修飾。⑥苯異硫氰酸酯(PITC)修飾(即(3)羧基的化學修飾(4)咪唑基的修飾反應(yīng)。(5)吲哚基的化學修飾甲硫氨酸側(cè)鏈基團的化學修飾胍基的化學修飾123精選版課件ppt(3)羧基的化學修飾33精選版課件ppt(8)二硫鍵的化學修飾①2—·巰基乙醇修飾②124精選版課件ppt(8)二硫鍵的化學修飾①2—·巰基乙醇修飾②34精選版③二硫蘇糖醇(DTT)修飾125精選版課件ppt③二硫蘇糖醇(DTT)修飾35精選版課件ppt（9）酚基的化學修飾

①N—乙酰咪唑修飾

②碘化反應(yīng)

126精選版課件ppt（9）酚基的化學修飾①N—乙酰咪唑修飾②碘化反應(yīng)36精2.2酶分子修飾的基本要求和條件

對酶分子進行修飾必須在修飾原理、修飾劑和反應(yīng)條件的選擇以及酶學性質(zhì)等方面都要有足夠的了解。做好基礎(chǔ)課（1）酶的穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、作用溫度、pH、抑制劑等。（2）酶活性中心的狀況

活性中心基團、輔因子等。其他如分子大小、性狀、亞基數(shù)等。127精選版課件ppt2.2酶分子修飾的基本要求和條件對酶分子進行修飾必須在修酶分子修飾的條件修飾反應(yīng)盡可能在酶穩(wěn)定條件下進行，并盡量不破壞酶活性功能的必需基團，使修飾率高，同時酶的活力回收高。（1）pH與離子強度

pH決定了酶蛋白分子中反應(yīng)基團的解離狀態(tài)。由于它們的解離狀態(tài)不同，反應(yīng)性能也不同。（2）修飾反應(yīng)的溫度與時間

嚴格控制溫度和時間可以減少以至消除一些非專一性的修飾反應(yīng)。（3）反應(yīng)體系中酶與修飾劑的比例回本章目錄128精選版課件ppt酶分子修飾的條件修飾反應(yīng)盡可能在酶穩(wěn)定條件下進行，并盡量不破因此謹慎選擇修飾反應(yīng)條件是必須的。當然，這些修飾條件隨著修飾反應(yīng)的不同而不同，因此，需要經(jīng)過大量實驗摸索才能確定.2.2.1pH與離子強度

pH決定了酶蛋白分子中反應(yīng)基團的解離狀態(tài)。由于它們的解離狀態(tài)不同，反應(yīng)性能也不同。例如在pH2—5時，碘乙酸可以選擇性地與Met的側(cè)鏈基團發(fā)生修飾反應(yīng)，而在此pH條件下，可被碘乙酸修飾的基團，如巰基、咪唑基和氨基等，都處于不反應(yīng)的狀態(tài)。另一方面，有些修飾試劑在不同pH條件下與同一基團可形成不同產(chǎn)物。129精選版課件ppt因此謹慎選擇修飾反應(yīng)條件是必須的。當然，這些修飾條件隨著修飾

2.2.2修飾反應(yīng)的溫度與時間

嚴格控制溫度和時間可以減少以至消除一些非專一性的修飾反應(yīng)。如用聚乳糖作修飾劑表面修飾酶（還原劑為氫硼化氰，BH3CN）時．在8℃時10d內(nèi)幾乎無反應(yīng)．而當溫度從25℃上升到37℃時反應(yīng)速度加快了3倍，而且隨pH的升高而加快。用甲酸氧化酶蛋白的反應(yīng)，在低溫(約—10℃)下修飾反應(yīng)僅限于Cys、胱氨酸和Met殘基上，而在較高溫度下，甲酸可以與Trp、Tyr、Ser、Scr以及Thr殘基發(fā)生反應(yīng)。

2.2.3反應(yīng)體系中酶與修飾劑的比例

用聚乙二醇(PEG)修飾酶時，活化PEG的多少能控制酶分子的修飾程度。130精選版課件ppt2.2.2修飾反應(yīng)的溫度與時間40精選版課件ppt2.3酶蛋白修飾反應(yīng)的主要類型

化學修飾劑與酶蛋白反應(yīng)的類型主要有如下幾種：2.3.1酯化及相關(guān)反應(yīng)

酯化及相關(guān)反應(yīng)，主要的修飾試劑包括乙酰瞇唑、二異丙基氟磷酸(DFPA)、酸酐磺酰氯、硫代三氟乙酸乙酯、O—甲基異脲。在室溫(20—25℃)、pH4.5—9.0條件下，主要與酶蛋白中的氨基、羥基、酚基及巰基等側(cè)鏈基團發(fā)生?；磻?yīng)：131精選版課件ppt2.3酶蛋白修飾反應(yīng)的主要類型41精選版課件ppt132精選版課件ppt42精選版課件ppt2.3.2烷基化反應(yīng)

這類修飾劑主要有2，4—二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、碘甲烷、苯甲酰鹵代物等，通常帶有一個活潑的負電性的鹵素原子，使烷基帶有部分正電性，導(dǎo)致酶蛋白親核基團烷基化。常被修飾的基團有氨基、巰基、羧基、甲硫基、咪唑基等。133精選版課件ppt2.3.2烷基化反應(yīng)43精選版課件ppt2.3.3氧化還原反應(yīng)

氧化劑有H2O2、N—溴代琥珀酰亞胺等；另外一類是光氧化試劑。它們都具有氧化性，能將側(cè)鏈基團氧化。受氧化的側(cè)鏈基團有巰基、甲硫基、吲哚基和酚基等。還原劑有2—巰基乙醇、巰基乙酸、二硫蘇糖醇(DTT)等。它們主要作用于二硫鍵。連四硫酸鈉、連四硫酸鉀作為氧化劑作用溫和，同時，在修飾反應(yīng)中用作巰基保護劑。例如：134精選版課件ppt2.3.3氧化還原反應(yīng)44精選版課件ppt2.3.4芳香環(huán)取代反應(yīng)[四硝基甲烷(Tetranitro—Methane，TNM)反應(yīng)]：由于蛋白質(zhì)中氨基酸殘基上的酚羥基在3和5位上容易發(fā)生親電取代的碘化和硝代反應(yīng)，其中四硝基甲烷是這類修飾劑中的典型例子．四硝基甲烷作用于Tyr殘基的酚羥基后，形成3—硝基酪氨酸衍生物。其產(chǎn)物具有特殊光譜。135精選版課件ppt2.3.4芳香環(huán)取代反應(yīng)45精選版課件ppt2.3.5溴化氰[BrCN)裂解反應(yīng)BrCN裂解Met反應(yīng)可在自發(fā)誘導(dǎo)重排條件下導(dǎo)致肽鍵斷裂：136精選版課件ppt2.3.5溴化氰[BrCN)裂解反應(yīng)46精選版課件pp第三節(jié)酶蛋白肽鏈的修飾酶蛋白肽鏈的修飾包括和肽鏈有限水解修飾和對酶蛋白肽鏈的大分子修飾反應(yīng)，耍注意的問題是修飾劑分子量大小、鏈的長度。一般要求修飾劑具有較大的分子量、良好的生物相容性和水溶性。這樣，經(jīng)修飾的酶，其半衰期較長，活力回收較高。下面將介紹—些主要的修飾反應(yīng)和修飾劑。137精選版課件ppt第三節(jié)酶蛋白肽鏈的修飾酶蛋白肽鏈的修飾包括和肽鏈有限水解酶蛋白主鏈修飾(肽鏈有限水解修飾)利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學結(jié)構(gòu)及其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法。酶蛋白主鏈修飾之一主要是靠酶切/酶原激活法。a、胃蛋白酶原的激活

138精選版課件ppt酶蛋白主鏈修飾(肽鏈有限水解修飾)利用酶分子主鏈的切斷和連接139精選版課件ppt49精選版課件pptb、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活

140精選版課件pptb、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活50精選版課141精選版課件ppt51精選版課件pptc、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活

142精選版課件pptc、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活肽鏈有限水解修飾酶蛋白主鏈修飾——酶切/酶原激活法胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活143精選版課件ppt肽鏈有限水解修飾53精選版課件ppt3.1聚乙二醇及其修飾反應(yīng)聚乙二醇（PEG）具有良好的生物相容性和水溶性，在體內(nèi)無毒性、無殘留、無免疫原性，并可消除酶的抗原性．使其末端活化后可以與酶產(chǎn)生交聯(lián)，因而，它被廣泛用于酶的修飾。被修飾的酶分子被蓋上一層疏松的親水外殼，導(dǎo)致流體動力學發(fā)生改變，從而產(chǎn)生了許多有用的性質(zhì)，比如：修飾酶能在廣泛的pH范圍溶解；不被離子交換劑吸附；電泳遷移率下降；沉降速度較天然酶慢等。聚乙二醇用作修飾劑時應(yīng)注意下面幾個問題：144精選版課件ppt3.1聚乙二醇及其修飾反應(yīng)聚乙二醇（PEG）具有良好的(1)PEG分子量為750一5000的修飾效果較好，用甲氧基PEG效果更好。(2)修飾效果不僅與其分子量有關(guān)，還與所用活化劑及其與酶的配比有關(guān)?！慊罨疨EG與酶的配比為15—50：1（mol)時，酶活性最多保留40％以上。(3)在多數(shù)情況下酶的抗原性隨分子表面自由氨基被其修飾而降低，當50％以下自由氨基被修飾后，酶基本沒有抗原性了，但酶活性也隨自由氨基的減少而下降，因此在選擇方法上，應(yīng)盡量選擇對酶活性影響小的修飾方法。PEG的修飾方法主要有以下幾種。145精選版課件ppt(1)PEG分子量為750一5000的修飾效果較好，用甲氧基3.1.1疊氮法此法是將PEG末端羥基轉(zhuǎn)化為疊氮基，然后與酶反應(yīng)。（1)PEG甲氧甲酰甲酯制備，PEG與氯代醋酸酐及重氮甲烷反應(yīng)，生成PEG甲氧甲酰甲酯，再與亞硝酸鈉反應(yīng)生成疊氮化合物而活化。146精選版課件ppt3.1.1疊氮法（1)PEG甲氧甲酰甲酯制備，PEG147精選版課件ppt57精選版課件ppt3.1.2琥珀酸酐法此法常用二溴代琥珀酸酐在溫和的堿性條件下將PEG活化，經(jīng)減壓濃縮制得活化PEG，活化PEG與酶分子上氨基發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，而得修飾酶：148精選版課件ppt3.1.2琥珀酸酐法58精選版課件ppt3.1.3三氯均嗪法

PEG經(jīng)三氯氯均嗪活化后，用石油醚抽提或減壓蒸餾，制得活化PEG，后者與酶交聯(lián)，制得修飾酶：149精選版課件ppt3.1.3三氯均嗪法59精選版課件ppt3.1.4羰二亞胺法

此法是將PEG用無水三乙胺、對—磺酰氯甲苯處理后，再加NaN3沸騰回流處理36h．制得PEG—N3，PEG—N3再轉(zhuǎn)變成PEG—NH2，PEG—NH2通過羰二亞胺與酶分子上羧基交聯(lián)：150精選版課件ppt3.1.4羰二亞胺法60精選版課件ppt

3.1.5重氮法

此法是將PEG末端羥基轉(zhuǎn)化為重氮基團，再在弱堿性條件下與酶分子的酚基、咪唑基等反應(yīng)，而生成修飾酶。主要反應(yīng)有以下三種。

(1)對—硝基芐基氯活化法151精選版課件ppt3.1.5重氮法61精選版課件ppt(2)N—羧甲氨基苯甲酐活化法152精選版課件ppt(2)N—羧甲氨基苯甲酐活化法62精選版課件ppt(3)4—氟—2—硝基重氮物活化法153精選版課件ppt(3)4—氟—2—硝基重氮物活化法63精選版課件ppt3.2糖類的修飾反應(yīng)3.2.1右旋糖苷及右旋糖苷硫酸酯的修飾反應(yīng)

右旋糖苷是由α—葡萄糖通過α—1，6—糖苷鍵連接而成的高分子多糖，具有良好的生物相容性和水溶性。其多糖上的雙羥基經(jīng)活化后可與酶分子上游離氨基相結(jié)合、從而修飾了酶。

（1）溴化氰法（2）高碘酸氧化法154精選版課件ppt3.2糖類的修飾反應(yīng)3.2.1右旋糖苷及右旋糖苷硫3.2糖類的修飾反應(yīng)3.2.2糖肽(Glycopeptide)的修飾反應(yīng)

糖肽是蛋白酶水解人纖維蛋白或Y一球蛋白所得到的產(chǎn)物。其分子上具有游離氨基，活化后與酶分子上氨基反應(yīng)，從而可修飾酶。

(1)2，3—異氰酸甲苯活化法（2）戊二醛法3.2.3聚乳糖[Polylactose)修飾反應(yīng)155精選版課件ppt3.2糖類的修飾反應(yīng)65精選版課件ppt3.3合成大分子多聚物修飾酶

3.3.1聚N—乙烯吡咯烷酮

PVP(N—乙烯吡咯烷酮)水溶性、分子量為10000，常用作修飾劑。3.3.2聚乙烯醇修飾酶

聚乙烯醇（PVA）與對硝基苯氧酰氯反應(yīng)后，其產(chǎn)物的硝基用連二亞硫酸鈉還原成氨基，與酶分子中羧基共價連結(jié)，生成修飾酶。3.3.3聚丙