古代養(yǎng)生漢方常用中藥提取物的抗氧化實(shí)驗(yàn)研究

古代養(yǎng)生漢方常用中藥提取物的抗氧化實(shí)驗(yàn)研究中國(guó)多肽產(chǎn)業(yè)集團(tuán)武漢肽類(lèi)物質(zhì)研究所武漢多肽抗衰老研發(fā)有限公司唐良艷姜波【摘要】目的與方法采用DPPH?法和還原能力測(cè)定法測(cè)定了古代養(yǎng)生漢方常用23種中藥提取物的抗氧化能力，并同VitC做了比較。結(jié)果不同的中藥提取物抗氧化能力不同，23種中藥提取物對(duì)DPPH?自由基的清除能力和還原能力均呈量效關(guān)系，其中葡萄籽提取物的抗氧化能力最強(qiáng)，與VitC的抗氧化能力一致?！娟P(guān)鍵詞】養(yǎng)生漢方；還原能力；中藥提取物；抗氧化能力；DPPH·本文選取了23種古代養(yǎng)生漢方常用中藥提取物，并用DPPH·法和還原能力測(cè)定法兩種方法對(duì)這23種中藥提取物的抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定。一、材料1.1原料：23種天然植物提取物(由武漢天天好生物制品公司提供、VitC（市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)。）1.2儀器：722N型可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精密儀器有限公司、KQ－50超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司、電子天平(奧豪斯、80-1型沉淀離心機(jī)、恒溫水浴鍋（黃驊市新興儀器廠）、容量瓶、具塞試管等。1.3試劑：DPPH·(二苯代苦味酰自由基、2，2－Diphenyl-1-picry-hydrazyl購(gòu)于SIGMA，10%三氯乙酸(TCA、1%鐵氰化鉀、0.1%三氯化鐵、0.2mol/LpH6.6磷酸緩沖液、其他試劑均為分析純。二、實(shí)驗(yàn)方法2.1通過(guò)DPPH·法比較23種中藥提取物的抗氧化活性2.1.1方法：參考Shimada的方法，測(cè)定清除DPPH自由基的能力。實(shí)驗(yàn)上所采用的DPPH甲醇溶液為紫羅蘭色在517nm下有強(qiáng)的吸光值，若與試樣結(jié)合，將會(huì)降低吸光值，由此藉以判斷試樣清除DPPH自由基的能力，其吸光值愈低，表示試樣清除DPPH自由基的能力愈強(qiáng)。[2]2.1.2樣品DPPH·清除率的測(cè)定：取5mL一定濃度的試樣溶液，分別加入新鮮配制的0.4mMDPPH甲醇（無(wú)水乙醇）溶液1mL，呈深紫藍(lán)色，混合均勻，反應(yīng)10分鐘。以分光光度計(jì)在517nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。2.1.3計(jì)算樣品對(duì)DPPH?自由基的清除能力（scavengingactivity,SA）可表示公式為：SA（％）＝[A0－（A1-A2）]/A0×100%A0→DPPH?與溶劑混合液的吸光度A1→DPPH?與樣品反應(yīng)后的吸光度1A2→樣品與溶劑混合液的吸光度2.223種中藥提取物還原能力的測(cè)定2.2.1方法：還原能力的測(cè)定是參考Oyaizu的方法，其原理即試樣將赤血鹽﹙K3Fe(CN6﹚還原成黃血鹽﹙K4Fe(CN6﹚，黃血鹽再與Fe3+作用，生成普魯士藍(lán)，在700nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光值，以檢測(cè)普魯士藍(lán)的生成量，作為試樣的還原力，吸光值愈高，表示試樣還原力愈強(qiáng)。[3]K3Fe(CN6+Sample?→K4Fe(CN6+Sample-oxide3++3K4Fe(CN6+4Fe?→Fe4[Fe(CN6]3+12K2.2.2樣品還原能力的測(cè)定取一定濃度的樣品(1～10mg/ml0.1ml，加人2.5m1pH6.6的磷酸鹽緩沖液(0.2mol/L和2.5ml1%的鐵氰化鉀溶液，混勻，在50℃保溫20min后加人2.5ml10%的三氯乙酸，混合后以3000r/min離心10min。取上清液2.5ml，加2.5ml蒸餾水和0.5ml0.1%的FeCI3，室溫放置10min后，在700nm波長(zhǎng)處比色，比色值越大，還原能力越強(qiáng)。三、結(jié)果3.123種中藥提取物對(duì)DPPH·自由基清除能力分別配制濃度為20ppm、100ppm、200ppm的中藥提取物，測(cè)定其對(duì)DPPH·自由基清除能力SA%，結(jié)果如表1：2注：――清除能力為零表1從上而下為各種中藥提取物清除DPPH?能力由強(qiáng)到弱的排列，在樣品濃度為20ppm的時(shí)候，葡萄籽提取物對(duì)DPPH·的清除率已達(dá)100％。3.2VitC與5種中藥提取物對(duì)DPPH·的清除作用比較通常，當(dāng)SA%值在15%～75%之間時(shí)，該值與提取物濃度成正比，但當(dāng)SA％值超過(guò)這一范圍時(shí)，尤其在高自由基清除能力的情況下，SA％值不隨提取物濃度增加而增加。因此，為了準(zhǔn)確評(píng)估那些SA%值較大的提取物的抗氧化活性，將表1中濃度為200ppm時(shí)，自由基清除能力較強(qiáng)的5種樣品進(jìn)行細(xì)致的試驗(yàn)，即以幾種較小的相近濃度的樣品溶液進(jìn)行試驗(yàn)。[4]分別配制5ppm、10ppm、20ppm三種濃度的樣液進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果如圖1：圖1VitC與5種中藥提取物對(duì)DPPH·的清除作用比較如圖1所示，VitC的DPPH清除能力與葡萄籽提取物DPPH清除能力一致，其余4種中藥提取物的DPPH·自由基清除能力依次為：銀杏黃酮＞紅景天提取物＞枳椇子提取物＞丹參提取物。3.2.123種中藥提取物還原能力的測(cè)定分別在700nm比色的結(jié)果如表2，VitC在1mg/ml時(shí)，A700nm讀數(shù)為1.597。3從表2可知，23種中藥提取物與VitC比較，其還原能力均不如VitC。在這23種中藥提取物中葡萄籽提取物的還原能力最強(qiáng)。四、結(jié)論本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了古代養(yǎng)生漢方常用中藥提取物中23種中藥提取物的DPPH·自由基清除能力和還原能力，證明葡萄籽提取物、銀杏黃酮、紅景天提取物、枳椇子提取物、丹參提取物、銀杏葉提取物、紅花提取物、甘草提取物的DPPH·清除能力和還原能力較強(qiáng)：在濃度為100ppm時(shí)對(duì)DPPH·自由基的清除能力達(dá)到了80％以上，特別是葡萄籽提取物，在濃度為20ppm時(shí)，清除率已達(dá)100%，與VitC相近。而且所有中藥提取物均隨其濃度的增大，對(duì)于DPPH·自由基的清除能力也在增強(qiáng)，呈現(xiàn)一定量效關(guān)系；在濃度為5mg/ml和10mg/ml時(shí)，葡萄籽提取物，枳椇子提取物，紅景天提取物，丹參提取物，紅花提取物的還原能力最強(qiáng)，而且本實(shí)驗(yàn)以濃度為1mg/ml的VitC作對(duì)照，葡萄籽提取物在濃度為10mg/ml時(shí)，還原能力甚至大于當(dāng)VitC為1mg/ml時(shí)的還原能力。五、討論423種中藥提取物的有效成分查資料表明，23種中藥提取物中具有抗氧化性的主要成分如表3：如表3，中藥種類(lèi)不同，其清除自由基和還原能力不同，可能與提取方法、有效成分及含量有關(guān)。酚類(lèi)物質(zhì)含量高的中藥提取物的清除DPPH·能力和還原能力如表3所示，葡萄籽提取物的抗氧化活性在所有的樣品中最強(qiáng)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它中藥提取物，這與它所含成分有關(guān)，葡萄籽提取物中的原花青素含量可高達(dá)95％，其主要由不同數(shù)量的兒茶素、表兒茶素及表兒茶素沒(méi)食子酸酯聚合而成，其低聚體有強(qiáng)抗氧化活性，以高效、低毒、高生物利用率而著稱，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的最有效的自由基清除劑之一，因此它是抗氧化物質(zhì)的良好來(lái)源，有進(jìn)[5]一步研究和開(kāi)發(fā)的價(jià)值。5.3黃酮類(lèi)物質(zhì)含量高的中藥提取物的清除DPPH·能力和還原能力枳椇子提取物、銀杏黃酮、紅景天提取物、銀杏葉提取物及山楂提取物等的抗氧化活性其次，[4]其主要成分為黃酮類(lèi)及皂苷類(lèi)。陳季武等應(yīng)用DPPH·分光光度法測(cè)定研究了11種天然的黃酮類(lèi)化合物清除DPPH·的能力，結(jié)果表明，11種都能有效地清除DPPH·，與本試驗(yàn)結(jié)果吻合。在本試驗(yàn)中，銀杏黃酮在濃度為20ppm時(shí)，對(duì)DPPH·的清除率已達(dá)56％，究其機(jī)理可能為銀杏黃酮黃酮苷的含量較高。枳椇子提取物、銀杏葉提取物等都含有大量的黃酮苷，故其對(duì)DPPH·都有強(qiáng)的清[6]除能力。紅花提取物中含有8種黃酮醇化合物，經(jīng)鑒定是：山奈酚、槲皮素、6－羥基山奈酚、山奈酚－3－葡萄糖苷、槲皮素－7－葡萄糖苷、槲皮素－3－葡萄糖苷、山奈酚－3－蕓行糖苷、蘆丁，故其在一定濃度下具有較強(qiáng)的DPPH·清除能力。而且黃酮類(lèi)是一類(lèi)具有酚羥基的化合物，可[8]以提供氫原子給自由基，從而很好的與自由基結(jié)合，其還原能力僅次于葡萄籽提取物5.4多糖類(lèi)物質(zhì)含量高的中藥提取物的清除DPPH·能力5此次試驗(yàn)得出黃芪提取物、枸杞提取物、人參提取物等對(duì)DPPH·清除率很低，還原能力也很差。[9]其主要成分均為多糖，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，多糖具有抗氧化活性,但是其作用機(jī)制可能并非直接清除此種自由基或是具有還原能力。綜合上面幾點(diǎn)，酚類(lèi)抗氧化性較強(qiáng),黃酮類(lèi)其次,多糖較弱,可能是因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)不同或者是其含量不同。本文選取了常用的23種中藥提取物，證實(shí)了富含酚類(lèi)物質(zhì)的葡萄籽提取物的抗氧化活性[10]最強(qiáng)?？寡趸瘎┥行柙谟行С煞值目寡趸瘷C(jī)理、多組分協(xié)同作用方面繼續(xù)研究。參考文獻(xiàn)：[1]張苗海.未病與漢方研究[J]，國(guó)外醫(yī)學(xué)中醫(yī)中藥分冊(cè),2005，26(4:207-211.[2]胡喜蘭，韓照祥，陶瑩，李靜，陳燕.DPPH法測(cè)定17種植物的抗氧化活性[J]，食品科技，2006（10）：264-268.[3]向志軍，趙廣榮，元英進(jìn)，郭治昕.復(fù)方丹參的體外抗氧化活性研究[J],2006，37（2）：127-131.[4]陳季武，胡斌，趙實(shí)，鄧玉，秦海燕.天然黃酮類(lèi)化合物清除DPPH·的構(gòu)效關(guān)系[J]，發(fā)光學(xué)報(bào)，2005，26（5）：664-668.[5]李春陽(yáng)、許時(shí)嬰、王璋.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)[J],2006，25（2）：102-106.[6]蔡奕文，趙謀明，彭志英．天然抗氧化劑發(fā)展近況Ⅱ[J]